宋雯，王春巧，俞燕，高峰，黃家風(fēng)

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832003）

棉花黃萎病對(duì)棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，在發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)可造成棉花減產(chǎn)30%以上，是影響中國棉花生產(chǎn)的主要病害之一[1]。在中國，該病是由土傳真菌大麗輪枝菌 （Verticillium dahliaeKleb.）引起的維管束病害。棉花黃萎病菌產(chǎn)生的微菌核抗逆性強(qiáng)，可在土壤中存活10年以上[2]，常年連作導(dǎo)致棉花黃萎病發(fā)生日趨嚴(yán)重；由于缺乏有效的防治藥劑和抗病品種，該病害防治已是生產(chǎn)上的重要難題。因此，盡快從分子水平深入解析大麗輪枝菌的致病機(jī)制，找到調(diào)控致病機(jī)制中的關(guān)鍵因子，對(duì)棉花抗病分子育種和探索新型防治方法具有重要的理論價(jià)值。

近年有關(guān)大麗輪枝菌功能基因組研究取得了較大發(fā)展，有些基因是大麗輪枝菌致病所必需的基因，如噻唑合成基因VdThi4[3]、維生素B1 運(yùn)輸基因VdThit[4]、內(nèi)切葡聚糖酶基因VdEG-1[5]和與侵染釘形成相關(guān)的基因VdNoxB、VdPls1[6]，它們的敲除均使大麗輪枝菌喪失致病力。有些基因雖然不是致病所必需的基因，但是將其敲除后明顯減弱大麗輪枝菌的致病力，如葡萄糖阻遏蛋白基因VdCYC8[7]、編碼富含谷氨酸蛋白的基因VdGARP1[8]、蔗糖非發(fā)酵激酶基因VdSNF1[9]和尿嘧啶DNA 糖基化酶基因VdUDG[10]。有些基因編碼效應(yīng)子蛋白通過影響植物免疫參與致病，如Ave1 基因編碼的蛋白誘導(dǎo)含Ve1 基因的番茄產(chǎn)生抗性，在不含Ve1 基因的番茄上卻是主要的致病因子[11]；效應(yīng)蛋白Vdlsc1 通過干擾寄主植物的水楊酸代謝，抑制水楊酸介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，協(xié)助病原菌侵染寄主[12]；VdNLP1、VdNLP2[13-14]和Vd-CUT11[15]基因編碼的蛋白誘導(dǎo)植物免疫引起細(xì)胞死亡。有些基因通過信號(hào)途徑參與大麗輪枝菌致病，如絲裂原活化蛋白激酶基因VMK1[16]、跨膜粘蛋白基因VdMSb[17]、高滲透激活蛋白激酶基因VdHog1[18]和編碼產(chǎn)物具有4 個(gè)跨膜功能域的VdSho1 基因[19]通過絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信號(hào)途徑影響大麗輪枝菌致??；VdPKAC1 和VGB基因分別通過環(huán)腺苷酸 （Cyclic adenosine monophosphate，cAMP） 依賴信號(hào)途徑和G 蛋白信號(hào)途徑對(duì)大麗輪枝菌的致病力起正向調(diào)控作用[20-21]；聚酮合酶基因VdPKS1 通過黑色素合成途徑影響致病[22]。還有一些基因通過編碼轉(zhuǎn)錄因子參與大麗輪枝菌的致病過程，如VdSge1 基因編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子不僅調(diào)節(jié)其他效應(yīng)子基因的表達(dá)，而且是大麗輪枝菌產(chǎn)孢和致病所必需的因素[23-24]；轉(zhuǎn)錄因子基因Vdpf[25]、VdMcm1[26]、VdCrz1[27]和VdFTF1[28]，除了對(duì)大麗輪枝菌的毒力起正向調(diào)控作用外，還分別參與調(diào)控微菌核形成、黑色素合成相關(guān)基因和植物細(xì)胞壁降解酶基因的表達(dá)。綜上所述，大麗輪枝菌的致病機(jī)制復(fù)雜，所有這些基因在真菌發(fā)育和致病過程中的相互作用仍有待深入研究。

多胺包括腐胺、亞精胺（Spermidine，Spd）和精胺，是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的低分子量、聚陽離子、具有生物活性的脂肪族含氮堿，在基因表達(dá)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化以及響應(yīng)非生物脅迫等方面有重要作用[29]。細(xì)胞內(nèi)多胺水平的穩(wěn)定主要受鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）和鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白（Ornithine decarboxylase antizyme，OAZ）嚴(yán)格調(diào)控[30]。ODC 是以磷酸吡哆醛為輔基的氨基酸脫羧酶，是多胺合成途徑中的第1 個(gè)限速酶，催化L-鳥氨酸脫羧生成腐胺，腐胺再經(jīng)過一些催化作用生成精脒和精胺[31]。它對(duì)多胺的合成起極其重要的作用。OAZ 在翻譯后可以連接到ODC 上，抑制ODC 的催化活性，并靶向地促使26S 蛋白酶降解ODC，從而負(fù)向調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多胺含量[32]。OAZ 都具有保守的ODC-AZ結(jié)構(gòu)域，將編碼這類蛋白的同源基因命名為OAZ基因。OAZ基因具有2 個(gè)開放閱讀框（ORF1 和ORF2），ORF2 的表達(dá)以核糖體移碼的翻譯機(jī)制翻譯蛋白，當(dāng)細(xì)胞中存在過高濃度的多胺時(shí)，誘導(dǎo)核糖體＋1 移碼，跳過ORF1 終止子中的T 堿基，繼續(xù)翻譯，表達(dá)具有抗酶蛋白功能的OAZ，OAZ 又反過來降低胞內(nèi)多胺的濃度，從而使細(xì)胞內(nèi)的多胺濃度維持在穩(wěn)定水平[33]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，利用棉花根系分泌物誘導(dǎo)培養(yǎng)導(dǎo)致棉花黃萎病菌鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白基因（VdOAZ）明顯上調(diào)表達(dá)。因此，本研究將該基因從大麗輪枝菌野生型菌株V592 中敲除，通過生物學(xué)特性和致病力測定及致病相關(guān)的其他基因在敲除突變體和V592 中的表達(dá)分析，以及Spd 誘導(dǎo)條件下，測定V592 菌株中VdOAZ基因及致病相關(guān)的其他基因的相對(duì)表達(dá)量，初步明確VdOAZ基因?qū)Υ篼愝喼亩玖Α?微菌核的形成及分生孢子產(chǎn)生的影響，并能響應(yīng)Spd 水平的變化。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及載體

本研究所用的大麗輪枝菌野生型菌株V592[8]來自于棉花，屬于落葉型強(qiáng)致病力菌株，由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存?？寺≥d體pMD19-T 購自寶生物TaKaRa 公司。敲除載體pGKO-HPT 由郭惠珊研究員惠贈(zèng)，該載體攜帶單純皰疹病毒胸苷激酶（Herpes simplex virus thymidine kinase）基因HSVtk作為負(fù)向篩選標(biāo)記。用于基因互補(bǔ)的載體p1300-Neo-oLiC-Cas9-TtrpC，包括oLiC 啟動(dòng)子和TtrpC 終止子，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 VdOAZ 基因的克隆及測序

將V592 菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar medium，PDA 培養(yǎng)基）上活化并培養(yǎng)菌株7 d，并按照Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit（BioFlux）提取試劑盒說明書的方法提取菌株DNA。將V592 菌株在Czapek-Dox 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，離心并收集沉淀，按照Trizol（QIAGEN）法分別提取菌株的總RNA。并用PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ（TaKaRa）進(jìn)行cDNA 合成。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 中公布的大麗輪枝菌全基因組（V.dahliaeVdLs.17）數(shù)據(jù)庫的基因信息，檢索到OAZ基因VDAG_00022 的序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物VdOAZfull-F （5'-ATGTCGCCCATGAAAAACAACAATAATC-3'） 和VdOAZfull-R（5'-CTACAGCTCCATGCCCATGAA G-3'）。分別從V592 菌株的基因組DNA 和cDNA 中經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增OAZ基因的全長，克隆測序并命名為VdOAZ。

1.3 載體構(gòu)建和真菌轉(zhuǎn)化

利用基因同源重組原理，用潮霉素抗性基因（HPH）取代VdOAZ基因的1 006 bp 片段。使用I-5TM2×High-Fidelity Master Mix 高保真DNA 聚合酶 （TsingKe） 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，先用引物VdOAZ-up-F（5'-CTTGCTGAGGTCTTAATTAAGGGTCATGTCACTCCGT-3'） 和VdOAZ-up-R（5'-AGTGCTGAGGCATTAATTAATTCATTTTCCATTCGTCCCA-3'） 從V592 基因組中擴(kuò)增VdOAZ基因上游842 bp 的DNA 片段；再用引物VdOAZ-down-F（5'-CCCGCTGAGGACTTAATTAATTCCTGGGGGTCGAGTT-3'）和VdOAZ-down-R（5'-CTCGCTGAGGGTTTAATTAACGTGGCAATTACCTACACA-3'） 從V592 基因組中擴(kuò)增VdOAZ基因下游793 bp 的DNA 片段。用PacⅠ限制性核酸內(nèi)切酶將載體pGKO-HPT 酶切線性化，將目標(biāo)基因的2 個(gè)同源臂和線性化載體通過ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme）進(jìn)行重組，構(gòu)建敲除載體pGKO-HPT∷VdOAZ。將構(gòu)建成功的敲除載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）方法轉(zhuǎn)化V592 菌株的分生孢子。轉(zhuǎn)化子的篩選先用Wang 等[34]的PCR 方法進(jìn)行初步篩選，再分別用檢測HPH基因的引物Hph588U （5'-AGCTGCGCCGATG-GTTTCTACAA-3'）和Hph588L（5'-GCGCGTCTGCTGCTCCATACAA-3'）和檢測VdOAZ基因的引物VdOAZfull-F、VdOAZfull-R 對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行二次篩選，目標(biāo)基因VdOAZ被HPH基因取代的轉(zhuǎn)化子（敲除突變體）只能擴(kuò)增到HPH基因片段，不能擴(kuò)增到VdOAZ基因的目標(biāo)條帶。

為了構(gòu)建VdOAZ基因的互補(bǔ)載體，用引物inEC-OAZ-F（5'-ACAATCGATCCAACCTCTAGAATGTCGCCCATGAAAAACAACA-3'）和inECOAZ-R（5'-TTAAGTGCGGCCGCTGGATCCCTACAGCTCCATGCCCATGAA-3'）從野生型V592基因組DNA 中擴(kuò)增VdOAZ基因全長。然后該將基因全長連接到用XbaⅠ/BamHⅠ酶切線性化的p1300-Neo-oLiC-Cas9-TtrpC 載體中。然后通過ATMT 方法將該載體轉(zhuǎn)化至VdOAZ基因的敲除突變體中。轉(zhuǎn)化子通過G418 抗生素和PCR 方法進(jìn)行篩選。最后，使用引物VdOAZ-qPCR-F （ 5'-CCTGGCTCGAGATCTGGGATTT-3'）和VdOAZ-qPCR-R（5'-AACGTTGCCATCGAAGAATACGAACA-3'），通過實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription-quantitative real time PCR，RT-qPCR）對(duì)目標(biāo)基因VdOAZ在野生型菌株、 敲除突變體菌株和互補(bǔ)菌株中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，對(duì)目標(biāo)基因的敲除和互補(bǔ)進(jìn)行再次確定。

1.4 RT-qPCR分析

VdOAZ基因在野生型菌株V592、VdOAZ敲除突變體和互補(bǔ)菌株中的轉(zhuǎn)錄水平，大麗輪枝菌VdPKAC1（VDAG_06474.1）[20]、VMK1（VDAG_09461.1）[16]、VdNLP1（VDAG_04701.1）[14]、VdNLP2（VDAG_01995.1）[14]、VdCYC8（VDAG_07052）[7]、VGB（JQ665433.1）[21]、VdSge1（VDAG_06298.1）[23-24]、VdHog1（VDAG_08982）[18]、VDH1（VDAG_02273.1）[35]基因在野生型菌株V592、VdOAZ敲除突變體和互補(bǔ)菌株中的轉(zhuǎn)錄水平，以及在1 mmol·L－1Spd 誘導(dǎo)4 h 后VdOAZ、VdPKAC1[20]、VMK1[16]、VdNLP1[14]、VdNLP2[14]、VdSge1[23-24]、VDH1[35]基因在野生型菌株V592 中的轉(zhuǎn)錄水平，均通過RT-qPCR 進(jìn)行測定。根據(jù)方法1.2，提取各菌株的總RNA，并合成cDNA，然后按照PowerUp SYBR Green Master Mix（Life Technologies）試劑盒說明添加樣品，PCR 反應(yīng)在7500 Real Time PCR System（Life Technologies）中進(jìn)行。針對(duì)不同基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物（表1），以β-tubulin基因（DQ266153）作為內(nèi)參基因。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 供試引物Table 1 Primers used in this study

1.5 真菌表型特征的測定

菌落生長速率的測定：以野生型菌株V592為對(duì)照，取直徑5 mm 的菌塊接種于PDA 培養(yǎng)基中央，26 ℃黑暗培養(yǎng)。接種后的第5 天和第15天，分別測量每個(gè)菌株的菌落直徑，計(jì)算菌落的平均生長速率；并在接種后第15 天，拍照記錄菌落形態(tài)，每個(gè)菌株設(shè)5 個(gè)重復(fù)。

產(chǎn)孢量的測定：以野生型菌株V592 為對(duì)照，將1 mL 含量為1.0×106mL－1的分生孢子懸浮液加入到100 mL Czapek-Dox 液體培養(yǎng)基中，26 ℃、200 r·min－1培養(yǎng)7 d，以24 h 的間隔計(jì)數(shù)分生孢子的數(shù)量，每個(gè)菌株設(shè)6 個(gè)重復(fù)。

微菌核量的測定：以野生型菌株V592 為對(duì)照，在PDA 培養(yǎng)基上鋪1 層玻璃紙，取300 μL含量為1.0×107mL－1的分生孢子懸浮液涂布在玻璃紙上，26 ℃黑暗培養(yǎng)14 d，觀察微菌核形成情況[8]；將玻璃紙上的微菌核刮下，置于稱量紙上稱量，得到微菌核的鮮質(zhì)量；然后將其室溫下靜置48 h，稱量干質(zhì)量。每個(gè)菌株設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.6 致病力測定

選取棉花感病品種“軍棉1 號(hào)”用于致病力測定。將棉苗在MS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至3～4片真葉展開時(shí)采用無傷浸根接種法進(jìn)行接種[8]，分別以野生型菌株V592 和無菌水為陽性和陰性對(duì)照。病害分為4 個(gè)等級(jí)：1%～25%的葉片表現(xiàn)萎蔫癥狀為1 級(jí)，26%～50%的葉片表現(xiàn)萎蔫癥狀為2 級(jí)，51%～75%的葉片表現(xiàn)萎蔫癥狀為3級(jí)，76%～100%的葉片表現(xiàn)萎蔫癥狀為4 級(jí)。病情指數(shù)（DI）的計(jì)算公式＝[Σ（各病級(jí)株數(shù)×相應(yīng)病級(jí)）/ 調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)（4）]×100。植株發(fā)病后每2 d 統(tǒng)計(jì)1 次病情指數(shù)，每個(gè)菌株接種3 個(gè)營養(yǎng)缽，每個(gè)營養(yǎng)缽12 棵棉苗。

1.7 感病棉株中真菌生物量測定

為了明確VdOAZ基因?qū)Υ篼愝喼秩炯岸ㄖ材芰Φ挠绊?，?duì)接種了野生型菌株V592、VdOAZ基因敲除突變體和互補(bǔ)菌株的棉株，通過qPCR 進(jìn)行真菌生物量測定。接種后26 d，取棉花的根（紅莖線以下取根5 cm）、莖（棉苗一半株高處取莖5 cm）、葉，分別提取根、莖、葉的總DNA。qPCR 所用引物 [轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）-F（5'-TGTTGCTTCGGCGGCTCGTT-3'）和ITS-R（5'-GCGTTTCGCTGCGTTCTTCA-3'）] 是基于大麗輪枝菌核糖體RNA（Z29511）的ITS1 和ITS2 區(qū)設(shè)計(jì)的。以組成型表達(dá)的β-tubulin基因（DQ266153）作為內(nèi)參基因，對(duì)每個(gè)樣品的總DNA 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VdOAZ 基因的克隆與序列分析

通過克隆測序得到VdOAZ基因全長為1 006 bp，預(yù)測編碼蛋白的cDNA 序列為798 bp。對(duì)2 次測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明VdOAZ基因由3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子分別位于9～161、268～704 和799～1 006位核苷酸，內(nèi)含子分別位于162～267 位核苷酸和705～798 位核苷酸。VdOAZ基因通過2 個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORF）編碼蛋白，ORF1 長度為312 bp，編碼103 個(gè)氨基酸殘基；ORF2 長度為798 bp，通過核糖體在第425 位T堿基＋1 移碼形成，編碼的蛋白含有265 個(gè)氨基酸，具有OAZ 所特有的ODC-AZ 保守結(jié)構(gòu)域，因此只有ORF2 才編碼形成VdOAZ 蛋白。VdOAZ基因與大麗輪枝菌 VdLs.17 的VDAG_00022 基因核苷酸序列相似性為97.9%，VdOAZ 蛋白與大麗輪枝菌 VdLs.17 中VDAG_00022 所編碼的氨基酸序列相似性為98.1%，與其他真菌OAZ 也具有一定的氨基酸序列相似性，與堿菌（Sodiomyces alkalinus）的序列相似性為48.0%，與鐮刀菌（Fusarium langsethiae）的序列相似性為43.5%。

2.2 VdOAZ 基因的敲除與互補(bǔ)驗(yàn)證結(jié)果

利用基因同源重組原理構(gòu)建了針對(duì)VdOAZ基因的敲除載體（圖1-A），通過ATMT 法轉(zhuǎn)化大麗輪枝菌分生孢子和PCR 篩選[34]，將獲得的同源重組轉(zhuǎn)化子，再分別用HPH基因和VdOAZ基因的特異性引物進(jìn)行二次篩選，結(jié)果如圖1-B 所示，3 個(gè)VdOAZ敲除突變體（vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3） 都能擴(kuò)增到588 bp 的HPH基因片段，不能擴(kuò)增到1 006 bp 的VdOAZ基因片段；而野生型菌株V592 只能擴(kuò)增到預(yù)期大小的VdOAZ基因片段。將完整的VdOAZ基因片段轉(zhuǎn)化敲除突變體vdoaz-1，PCR 檢測結(jié)果（圖1-B）顯示，2個(gè)互補(bǔ)菌株（EC-oaz-1 和EC-oaz-2）均能擴(kuò)增到預(yù)期大小的VdOAZ基因片段。

通過RT-qPCR 對(duì)VdOAZ基因在野生型菌株V592、 敲除突變體和互補(bǔ)菌株的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1-C）顯示，VdOAZ基因在vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 中幾乎不表達(dá)，而在互補(bǔ)體菌株EC-oaz-1 和EC-oaz-2 中的表達(dá)明顯恢復(fù)到V592 水平，分別達(dá)到V592 表達(dá)量的102.9%和97.22%。表明VdOAZ基因在vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 中被成功敲除，在互補(bǔ)菌株EC-oaz-1 和EC-oaz-2 中得到互補(bǔ)。

圖1 棉花黃萎病菌VdOAZ基因的敲除Fig.1 Deletion of the VdOAZ gene in V.dahliae isolated from cotton

2.3 VdOAZ 基因敲除突變體菌落形態(tài)與生長速率

培養(yǎng)性狀觀察結(jié)果顯示，3 個(gè)VdOAZ敲除突變體的菌落形態(tài)與野生型菌株V592 和互補(bǔ)菌株的菌落形態(tài)沒有明顯差異，都形成菌核型菌落（圖2），但是3 個(gè)VdOAZ敲除突變體的菌落生長速率顯著低于V592 和互補(bǔ)菌株（圖2，表2），表明VdOAZ基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌生長減慢。

圖2 野生型菌株V592、VdOAZ敲除突變體及互補(bǔ)菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Fig.2 Phenotypic characteristics of the wild type strain V592, VdOAZ gene deletion mutants and complementary strains on PDA medium

表2 VdOAZ 敲除突變體在PDA 培養(yǎng)基上的菌落生長速率Table 2 Colony growth rate of VdOAZ gene deletion mutants on PDA medium

2.4 VdOAZ 敲除突變體的微菌核產(chǎn)量

圖3-A 顯示，接種14 d 后，3 個(gè)VdOAZ敲除突變體vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 形成的黑色微菌核明顯少于野生型菌株V592 和2 個(gè)互補(bǔ)菌株。微菌核鮮質(zhì)量和干質(zhì)量結(jié)果也顯示，3 個(gè)VdOAZ敲除突變體形成的微菌核質(zhì)量極顯著低于V592和2 個(gè)互補(bǔ)菌株（圖3-B）。上述結(jié)果表明，VdOAZ基因不是大麗輪枝菌微菌核形成所必需的基因，但是VdOAZ基因敲除明顯影響大麗輪枝菌微菌核的產(chǎn)量。

2.5 VdOAZ 敲除突變體的產(chǎn)孢量

產(chǎn)孢量測定結(jié)果表明，與野生型菌株V592、互補(bǔ)菌株EC-oaz-1 和EC-oaz-2 相比，敲除突變體vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 的產(chǎn)孢量顯著減少（圖4）。在接種第7 天時(shí)，敲除突變體vdoaz-1、vdoaz-2 和vdoaz-3 的產(chǎn)孢量僅為 V592 的40.76%、45.65%和57.07%，互補(bǔ)菌株EC-oaz-1 和EC-oaz-2 的產(chǎn)孢量可達(dá)到V592 的92.93%和89.67%。結(jié)果表明，VdOAZ基因參與分生孢子的產(chǎn)生。

2.6 VdOAZ 敲除突變體的致病力

分別用野生型菌株V592，敲除突變體vdoaz-1、vdoaz-2、vdoaz-3 和互補(bǔ)菌株EC-oaz-1、EC-oaz-2 接種棉花感病品種“軍棉1 號(hào)”，接種后10 d 時(shí)，所有棉花植株開始表現(xiàn)萎蔫癥狀，表明VdOAZ基因敲除不會(huì)對(duì)棉花黃萎病的發(fā)病有延遲作用。接種后26 d 時(shí)，V592 導(dǎo)致感病棉花葉片萎蔫、脫落，甚至全株枯死，病情指數(shù)達(dá)到94.3；而3 個(gè)敲除突變體在感病棉花上引起的病害癥狀明顯減輕，病情指數(shù)分別為65.0、68.7 和63.3；2 個(gè)互補(bǔ)菌株對(duì)棉花的致病力得到恢復(fù)，病情指數(shù)分別為90.0 和87.3 （圖5-A 和5-B）；表明VdOAZ基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌致病力下降。

接種26 d 后，對(duì)植株內(nèi)的真菌生物量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，在根組織中，3 個(gè)敲除突變體的真菌生物量顯著高于野生型菌株V592 和2 個(gè)互補(bǔ)菌株（圖5-C）；而在莖組織中，3 個(gè)敲除突變體的真菌生物量又顯著低于V592 和2 個(gè)互補(bǔ)菌株，表明VdOAZ基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌在寄主體內(nèi)的擴(kuò)展受阻。

2.7 致病相關(guān)的其他基因在VdOAZ敲除突變體中的表達(dá)

如圖6 所示，與野生型菌株V592 相比，VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2 和VdSge1 在3個(gè)敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，分別是V592 菌株表達(dá)量的15.4 倍、14.7 倍、4.5 倍、3.4 倍和6.9 倍；1 個(gè)基因（VDH1）在3 個(gè)敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于V592 中的表達(dá)量；3 個(gè)基因（VdCYC8、VGB和VdHog1）在3 個(gè)敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量與V592 沒有顯著差異。由于這些上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因與大麗輪枝菌的孢子產(chǎn)生、微菌核形成及毒力相關(guān)，表明VdOAZ基因在參與大麗輪枝菌的孢子產(chǎn)生、 微菌核形成及致病過程中與這些基因有不同的相互作用。

圖3 VdOAZ基因敲除體的微菌核產(chǎn)量Fig.3 Microsclerotia production of VdOAZ gene deletion mutants

圖4 VdOAZ基因敲除突變體產(chǎn)孢量的測定結(jié)果Fig.4 Conidia production of VdOAZ gene deletion mutants

圖5 VdOAZ基因敲除突變體對(duì)棉花致病力與病株真菌生物量的測定結(jié)果Fig.5 Disease severity and fungal biomass in cotton plants infected by the VdOAZ gene deletion mutants

圖6 大麗輪枝菌其他致病基因在VdOAZ基因敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of other genes involved in virulence in V.dahliae in VdOAZ gene deletion mutants

2.8 亞精胺誘導(dǎo)后VdOAZ基因及致病相關(guān)的其他基因的表達(dá)量

以不被誘導(dǎo)的野生型菌株V592 為對(duì)照，上述各基因在Spd 誘導(dǎo)4 h 后的表達(dá)情況如圖7 所示。V592 經(jīng)Spd 誘導(dǎo)培養(yǎng)后，VdOAZ基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)了2.6 倍，VDH1 基因的相對(duì)表達(dá)量有所上調(diào)但不顯著，而VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2、VdSge1 的相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)。表明VdOAZ基因?qū)Χ喟匪降淖兓怯许憫?yīng)的；VdOAZ基因?qū)dPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2 和VdSge1 的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，VdOAZ基因及其負(fù)調(diào)控基因均能響應(yīng)多胺水平的變化。

圖7 亞精胺誘導(dǎo)4h后VdOAZ和大麗輪枝菌致病相關(guān)的其他基因在V592中的相對(duì)表達(dá)Fig.7 Relative expression of VdOAZ gene and other genes involved in virulence of V.dahliae in V592 induced by spermidine for 4 h

3 討論

生物體中，當(dāng)細(xì)胞中多胺濃度過高時(shí)，為了穩(wěn)定細(xì)胞中多胺水平，OAZ 起負(fù)向調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多胺含量的作用[32]。本研究從棉花黃萎病菌中通過克隆測序得到VdOAZ基因全長，序列分析表明，VdOAZ基因在425～427 位核苷酸有1 個(gè)TGA終止密碼子，ORF2 的編碼只有通過核糖體在425 位T 堿基＋1 移碼才可以繼續(xù)翻譯蛋白，且只有通過移碼翻譯的蛋白才具有真核生物OAZ所特有的ODC-AZ 保守結(jié)構(gòu)域，表明ORF2 編碼的VdOAZ 蛋白在大麗輪枝菌中可能具有鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白的功能。本研究將V592 菌株經(jīng)Spd 誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，VdOAZ基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明VdOAZ基因能對(duì)多胺水平變化做出響應(yīng)，間接證明VdOAZ 蛋白具有鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白的功能。然而萵苣大麗輪枝菌VdLs.17 的同源基因（VDAG_00022）在相同位點(diǎn)不存在終止子，暗示這種移碼機(jī)制可能只在部分大麗輪枝菌中存在。這需要對(duì)不同來源的大麗輪枝菌進(jìn)行大量測序才能確定。由于目前有關(guān)OAZ 的研究主要集中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，OAZ 在真菌體內(nèi)是否可以調(diào)節(jié)多胺水平以及調(diào)節(jié)機(jī)制是否與哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的機(jī)制一致也需進(jìn)一步研究。

VdOAZ基因?qū)γ藁S萎病菌生長發(fā)育的影響結(jié)果表明，VdOAZ基因敲除導(dǎo)致棉花黃萎病菌的菌落生長速率降低、產(chǎn)孢量及微菌核產(chǎn)量下降。通過RT-qPCR 對(duì)其他基因在VdOAZ敲除突變體中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，VDH1 基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，由于VDH1 基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌微菌核形成受阻[35]，表明VdOAZ基因在VDH1 基因影響微菌核形成的途徑中具有正向調(diào)控作用。VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2和VdSge1 在VdOAZ敲除突變體中的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，當(dāng)VdOAZ基因受Spd 誘導(dǎo)表達(dá)后，這5 個(gè)基因的表達(dá)又顯著下調(diào)，表明VdOAZ基因?qū)@5 個(gè)基因的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用；其中2 個(gè)基因VdPKAC1 和VMK1 與大麗輪枝菌的微菌核形成和孢子產(chǎn)生相關(guān)，VdPKAC1 基因敲除后，其突變體微菌核產(chǎn)量增加、產(chǎn)孢量減少[20]，VMK1基因敲除的突變體微菌核形成和產(chǎn)孢量均減少[16]。由于VdPKAC1[20]和VMK1[16]基因分別是cAMP信號(hào)途徑和MAPK 信息素調(diào)控途徑的關(guān)鍵基因，因此VdOAZ基因可能通過這2 個(gè)信號(hào)途徑參與微菌核和分生孢子的形成過程。另外，VdNLP1[13]和VdSge1[24]也與大麗輪枝菌的孢子產(chǎn)生有關(guān)，它們的敲除突變體產(chǎn)孢量均明顯低于各自的野生型菌株。因此，VdOAZ基因參與大麗輪枝菌的孢子產(chǎn)生過程可能與這2 個(gè)基因也有關(guān)。

VdOAZ基因敲除導(dǎo)致棉花黃萎病菌致病力顯著降低。qPCR 結(jié)果表明，VdOAZ敲除突變體在棉花根中的生物量顯著高于野生型菌株，但在棉花莖中的生物量卻顯著低于野生型菌株，表明VdOAZ基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌由根向莖的擴(kuò)展受到阻礙，因此推測VdOAZ敲除突變體致病力下降的原因可能與其擴(kuò)展受阻及莖中的生物量下降有關(guān)。另外，在VdOAZ敲除突變體中，轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)明顯上調(diào)的5 個(gè)基因（VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2 和VdSge1） 和轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)下調(diào)的1 個(gè)基因（VDH1）除了與孢子產(chǎn)生和微菌核形成相關(guān)外，均是大麗輪枝菌致病相關(guān)基因，其中VdSge1 基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌致病力喪失[23-24]，VdPKAC1[20]、VMK1[16]、VdNLP1 和VdNLP2[14]基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌致病力減弱，表明VdOAZ基因參與的是1 個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包括cAMP 信號(hào)途徑、MAPK 信息素調(diào)控途徑及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑。VdOAZ基因與這些途徑和基因共同調(diào)節(jié)了大麗輪枝菌的產(chǎn)孢、微菌核形成及致病過程，但是這些基因在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的相互作用機(jī)制還有待深入研究。

已有研究表明，G 蛋白和cAMP 信號(hào)途徑是相互偶聯(lián)的，共同調(diào)控大麗輪枝菌孢子產(chǎn)生、微菌核形成和致病過程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在VdOAZ敲除突變體中，VdPKAC1 基因[20]的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，VGB基因[21]的轉(zhuǎn)錄水平不受影響，表明VdOAZ基因通過負(fù)調(diào)控VdPKAC1 基因的表達(dá)參與cAMP 信號(hào)傳導(dǎo)，但不參與G 蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑。同樣地，基因VMK1[16]和VdHog1[18]分別是MAPK 信息素調(diào)控途徑和MAPK 高滲調(diào)節(jié)途徑的關(guān)鍵基因，在VdOAZ基因敲除突變體中，VMK1 基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，而VdHog1 基因的轉(zhuǎn)錄水平不受影響，表明VdOAZ基因通過負(fù)調(diào)控VMK1 基因的表達(dá)參與MAPK 信息素信號(hào)途徑，但不參與以VdHog1 為中心的MAPK 高滲調(diào)節(jié)途徑。

4 結(jié)論

從棉花黃萎病菌落葉型強(qiáng)致病力菌株中克隆到VdOAZ基因全長，其ORF2 編碼的VdOAZ蛋白具有OAZ 所特有的ODC-AZ 保守結(jié)構(gòu)域，并且VdOAZ基因表達(dá)能夠響應(yīng)多胺水平變化，暗示VdOAZ 蛋白具有OAZ 的功能。VdOAZ基因敲除導(dǎo)致大麗輪枝菌菌落生長速率降低，產(chǎn)孢量和微菌核形成減少，對(duì)寄主的致病力下降，在感病棉花莖中的生物量減少，表明VdOAZ基因與大麗輪枝菌的孢子產(chǎn)生、微菌核形成和致病力相關(guān)；VdOAZ基因負(fù)調(diào)控其他與孢子產(chǎn)生、微菌核形成和致病力相關(guān)基因（VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2 和VdSge1） 的表達(dá)，推測VdOAZ基因通過與cAMP 信號(hào)途徑、MAPK 信息素調(diào)控途徑及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑相互作用影響大麗輪枝菌孢子產(chǎn)生、微菌核形成和致病過程。