張雯婧，于孟飛，劉貝貝，劉慶華

（中南民族大學 生命科學學院；武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430074）

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和可變重塑為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，影響全球3 億多患者［1］，給政府、基礎醫(yī)療部門、家庭、患者和護理人員帶來了巨大的負擔［2］。哮喘的癥狀包括喘息、呼吸短促、胸悶和咳嗽，其主要原因是氣道高反應（airway hyper-responsiveness，AHR）。氣道高反應是指非特異性刺激在正常人呈無反應狀態(tài)或反應程度較輕，而在某些人卻引起了明顯的支氣管狹窄，其機制尚不明確［3］。目前治療氣道高反應的藥物主要是β2受體激動劑，這類藥物具有嚴重的不良反應，如心悸、震顫、頭痛［4］、心肌梗死、充血性心力衰竭、心臟驟停和心源性猝死以及危及生命的哮喘發(fā)作［5］、脫敏［6］。因此，哮喘氣道高反應的機制及治療方法亟待研究。

已知高K+導致膜去極化，激活L-型電壓依賴性Ca2+通道（L-type voltage-dependent calcium channel，LVDCC），然后介導Ca2+流入以引發(fā)持續(xù)收縮［7］。因此，本研究利用高K+誘發(fā)去極化導致收縮，離體模擬這一復雜在體過程，此方法可幫助我們快速地篩選抑制氣道平滑肌收縮的藥物。

研究發(fā)現，大黃酸（1，8-二羥基-3-羧基蒽醌，Rhein）減少α-平滑肌肌動蛋白的表達［8］，抑制大鼠離體子宮平滑肌的自發(fā)收縮活動［9］，這提示大黃酸可能對氣管平滑肌的收縮有影響。本文利用上述篩選平臺研究大黃酸抑制小鼠氣管平滑肌收縮效應及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8 周齡SPF 級BALB/C♂小鼠，合格證號：42000600027283，42000600027161。購于湖北省實驗動物研究中心（湖北武漢），飼養(yǎng)于中南民族大學實驗動物中心。實驗前7 d，小鼠自由采食，以適應環(huán)境。

1.1.2 藥品與試劑 大黃酸（上海源葉生物，HPLC ≥98%，批號：T30A8F42628），氯化鈉、氯化鉀、六水合氯化鎂、鹽酸、氫氧化鈉、無水氯化鈣、葡萄糖、二甲基亞砜（DMSO）等購于國藥集團化學試劑有限公司。HEPES、硝苯地平（Nifedipine）、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶、牛血清蛋白、二硫蘇糖醇購于美國Sig?ma-Aldrich。Fura-2，AM（Invitrogen，批號：1179866，美國）。

1.1.3 儀器 JH-2 型張力換能器（北京航天醫(yī)學工程研究所），HV-4 離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)（成都泰盟），EPC-10 膜片鉗放大器（HEKA，Lambrecht，德國），TILL 成像系統(tǒng)（FEI Munich GmbH，德國），倒置顯微鏡（OLYMPUS IMAGING，日本）。

1.2 方法

1.2.1 藥物與溶液配置 取適量硝苯地平溶于DMSO 制成濃度為10 mmol/L 母液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩４簏S酸溶于DMSO 配置成100 mmol/L 母液，超聲振蕩30 min 后，4 ℃保存?zhèn)溆?。生理鹽溶液（PSS）：135 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L 葡萄糖（pH = 7.40）。氣管平滑肌及其單細胞分離液：120 mmol/L NaCl，1.2 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L CaCl2，5.2 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES，11 mmol/L 葡 萄糖，0.6 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L NaHCO3（pH =7.10）。將木瓜蛋白酶和二硫蘇糖醇一起溶于1 g/L 牛血清蛋白中配置終濃度為2 g/L 和0.3 g/L，膠原蛋白酶溶于1 g/L 牛血清蛋白中配置終濃度為1 g/L。

1.2.2氣管環(huán)的制備 用頸部脫臼法處死小鼠，剪下氣管，去除附著組織，從氣管遠端剪取4～5 mm 氣管環(huán)，用兩個三角掛鉤穿過氣管環(huán)，掛鉤上端連接張力換能器，下端固定于離體器官灌流槽的底部，將氣管環(huán)前負荷設置為3 mN。槽內充入氧飽和的PSS，保持恒溫37 ℃，每15 min 更換一次PSS，共換液4次，完成預平衡。用80 mmol/L K+對氣管環(huán)進行預刺激，待張力達到平臺期后，用PSS 換液，待氣管環(huán)張力達到基線，25 min 后進行同樣的預收縮，共完成3 次，然后開始正式實驗。

1.2.3 大黃酸最佳藥物濃度的確定 向灌流槽中加入不同體積的大黃酸母液，使灌流槽中的大黃酸濃度累積達到1.00、3.16、10.00、31.60、100.00、177.80 和200.00 μmol/L（以藥理學（lg（濃度，mol/L））設定濃度梯度）。對照劑是DMSO。以80 mmol/L K+引起的最大收縮為參考標準計算舒張的程度。

1.2.4 氣管平滑肌細胞的分離 剪取小鼠氣管平滑肌，置入在37 ℃木瓜蛋白酶中20 min，再移入37 ℃膠原蛋白酶中7 min，然后運用機械力將單個平滑肌細胞分離下來，置冰上備用。

1.2.5 膜片鉗記錄LVDCC 電流 以Ba2+作為電荷載體測LVDCC 電流。玻璃電極與細胞膜形成高阻抗封接，給予較高負壓破膜，形成全細胞記錄方式，將細胞鉗制在-70 mV，之后記錄LVDCC 電流。

1.2.6 細胞內鈣測量 2.5 μmol/L Fura-2，AM 在灌流槽中孵育細胞20 min，然后灌流洗去多余染料。利用TILL 鈣成像系統(tǒng)采集對應激發(fā)波長340 nm 和380 nm 的熒光強度，曝光時間為50 ms，間隔時間為1 s，獲取340 nm 和380 nm 熒光強度的比率，用以代表細胞內鈣水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

數據采用Origin 9.0（OriginLab，美國）進行t-test 數據分析，數據用均數± 標準差（xˉ±SD）表示,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大黃酸抑制高鉀收縮

使用高鉀預先收縮了小鼠離體氣管環(huán)，待收縮達到平臺后，大黃酸被累積加入灌流槽中，氣管平滑肌的收縮被劑量依賴性地抑制（圖1A，n= 6），半抑制濃度（EC50）為（28.4 ± 3.4）μmol/L，最大舒張百分比為（92.7 ± 8.0）%，在對照實驗中未觀察到此現象（圖1B，n= 6）。除去大黃酸后，再次使用高鉀收縮，張力值又恢復至第一次預收縮張力值的（92.8 ± 10.7）%（n= 4），大黃酸量效曲線如圖1C 所示。此外，本研究發(fā)現大黃酸對靜息氣管環(huán)無影響（圖1D，n= 4）。該實驗結果提示：大黃酸抑制了高鉀誘導的小鼠氣管環(huán)平滑肌的收縮。

圖1 大黃酸抑制小鼠氣管環(huán)的收縮Fig.1 Inhibition effects of rhein on mouse tracheal ring contraction

2.2 大黃酸抑制收縮的機制

已知高鉀導致膜去極化，其激活L-型電壓依賴性Ca2+通道（LVDCC），該通道介導Ca2+流入引發(fā)持續(xù)收縮。因此，我們觀察了硝苯地平對高鉀收縮的影響。結果顯示高鉀誘導的預收縮被硝苯地平完全抑制。最大舒張百分比為（97.3 ± 1.6）%（圖2，n= 7），表明高鉀誘導的收縮完全依賴于LVDCC 介導的Ca2+流入。

圖2 硝苯地平抑制高鉀引發(fā)的收縮Fig.2 Inhibition effects of nifedipine on contraction induced by high K+

為了確認Ca2+流入，我們使用圖3A 所示程序記錄了LVDCC 介導的電流，電流被硝苯地平完全阻斷（圖3B），同時被大黃酸幾乎阻斷（圖3C），說明大黃酸抑制LVDCC，顯而易見，由LVDCC 導致的Ca2+內流應該會隨之被抑制。

圖3 大黃酸抑制LVDCC 介導的電流Fig.3 Inhibition effects of rhein on LVDCC-mediated currents

這一推測，由細胞內Ca2+直接測量所證實。80 mmol/L K+誘發(fā)細胞內鈣一過性迅速升高，然后維持在一個較高的平臺水平，Ratio（340/380）為（0.44 ± 0.05），加入177.80 μmol/L 大黃酸后，平臺恢復至基線水平，Ratio（340/380）為（0.28 ± 0.02）（圖4，n= 12）。以上結果表明，大黃酸抑制LVDCC 后，Ca2+內流停止。

圖4 大黃酸抑制氣道平滑肌細胞內Ca2+濃度Fig.4 Inhibition effects of rhein on intracellular calcium concentration in tracheal smooth muscle cells

本研究進一步在氣道平滑肌上驗證了上述結論。高鉀在無外Ca2+條件下未引起平滑肌的收縮，當外Ca2+濃度恢復到2 mmol/L 后，立即產生收縮，并被177.80 μmol/L 大黃酸抑制（見圖5），最大舒張百分比為（88.1 ± 2.1）%（n= 6）,揭示高鉀收縮是Ca2+內流所致，此Ca2+內流被大黃酸抑制，然后出現了平滑肌舒張。

圖5 大黃酸抑制高K+引發(fā)的鈣內流Fig.5 Inhibition effects of rhein on calcium influx caused by high K+

3 討論

哮喘是呼吸系統(tǒng)中最常見的疾病之一，其基本特征是氣道平滑肌細胞的收縮異常，這種收縮異常既是哮喘癥狀又是其惡化的原因，因此抑制氣道平滑肌異常過度收縮是治療哮喘的關鍵。雖然大黃酸沒有改變靜息肌張力，但舒張了預收縮的張力。因此，本文著重闡明這一現象的機制。硝苯地平是LVDCC 的選擇性阻斷劑，顯著抑制高K+誘導的氣管平滑肌的收縮。在實驗完成前后校準并測量了灌洗槽內的pH，pH 與對照相比無明顯差異，排除了pH 值對鈣離子通道的影響。而大黃酸引起的舒張是由于抑制LVDCC 所致。在平滑肌中，L-型Ca2+通道被認為是主要的Ca2+流入途徑［10］，LVDCC 的開放引起細胞外Ca2+大量流入，由此其引發(fā)的鈣離子內流使得平滑肌收縮，大黃酸抑制LVDCC，阻止鈣離子內流，導致了舒張，以上實驗結果驗證了本文的假設。

大黃酸作為天然蒽醌類化合物在豆科、蓼科、蕓香科、百合科中廣泛存在，大黃、番瀉葉、決明子、何首烏、蘆薈等中藥材中均含有，其在抗腫瘤、抗炎方面作用突出［11］。已有研究報道其對子宮平滑肌具有抑制作用，此作用可能是由細胞內的前列腺素的合成與釋放，或細胞膜上LVDCC 所介導［9］。本研究發(fā)現大黃酸對小鼠氣管平滑肌收縮具有抑制作用，原因是其抑制了細胞膜上LVDCC。這一結果為開發(fā)大黃酸作為一種新的氣管擴張劑提供了依據。已知大黃酸可減少α-平滑肌肌動蛋白的表達［8］，是否這是抑制平滑肌收縮的另一原因，還需要進一步的檢驗。將不同濃度大黃酸與氣管環(huán)共同孵育培養(yǎng)24 h 后，對α-平滑肌肌動蛋白進行mRNA 和蛋白水平的檢測，這是接下來需要進行的研究。

致謝：本實驗是在中南民族大學醫(yī)學生物研究所完成，對在此實驗中參與及幫助的同學及老師表示由衷的感謝。