王 震

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 511400)

L-精氨酸是一種重要的半必需氨基酸，在有機(jī)體中參與刺激分泌，促進(jìn)傷口愈合和一氧化氮的合成等多種生化過(guò)程，在食品、醫(yī)藥和保健行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[1]。L-精氨酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)催化、蛋白水解和微生物發(fā)酵，其中微生物發(fā)酵是生產(chǎn)L-精氨酸的主要方法[2]。在過(guò)去20年中，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的方法得到了深入的研究，包括基于基因工程和代謝工程的L-精氨酸工程菌株的構(gòu)建和發(fā)酵工藝優(yōu)化[3-4]。

谷氨酸棒狀桿菌作為L(zhǎng)-精氨酸生產(chǎn)的主要菌類[5]，是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，符合食品生產(chǎn)安全，可用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，然而大部分野生型谷氨酸棒狀桿菌都不具備積累L-精氨酸的能力[6]。在之前的工作中，以野生ATCC14067菌株為基礎(chǔ)，利用基因工程得到了一株具有L-精氨酸生產(chǎn)潛力的菌ATCC14067-SG(簡(jiǎn)寫(xiě)為SG)，SG通過(guò)替換強(qiáng)啟動(dòng)子Peftu過(guò)表達(dá)了argGH、argC和icd基因，argB基因的268位組氨酸突變?yōu)楣劝彼?，并把carA基因的起始密碼子突變成ATG，odhA基因的起始密碼子突變?yōu)镚TG。在利用3 L發(fā)酵罐評(píng)價(jià)SG菌株的L-精氨酸積累能力時(shí)，發(fā)現(xiàn)L-精氨酸的積累產(chǎn)量較低，且伴隨著大量副產(chǎn)物的積累。L-精氨酸的發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)需氧的過(guò)程，溶氧水平的高低不僅關(guān)乎菌體的生長(zhǎng)繁殖速度，對(duì)于代謝產(chǎn)物的積累也具有不可忽略的影響[7]。在1993年，Dominguez等[8]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶氧不足時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌ATCC17965會(huì)積累大量有機(jī)酸，如乙酸、琥珀酸和乳酸。為了減少代謝副產(chǎn)物的積累，提高L-精氨酸產(chǎn)量，筆者研究了5%、20%和35%這3種溶氧水平下，谷氨酸棒狀桿菌SG的生長(zhǎng)與代謝變化，確定了最適合谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵積累L-精氨酸的溶氧方案。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。菌株為前期工作所構(gòu)建的基因工程菌株SG(基于ATCC14067野生菌株，通過(guò)基因改造手段獲得)，華南理工大學(xué)酶學(xué)與酶工程實(shí)驗(yàn)室保種。

1.1.2試劑。腦心浸液，購(gòu)自美國(guó)BD公司；瓊脂、葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母浸膏、NaCl、尿素、K2HPO4、MgSO4、(NH4)2SO4、NaHCO3、乙酸鈉等試劑購(gòu)自廣州普博儀器(紐普諾博生物制品)有限公司；2，4-二硝基氟苯和乙腈購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基。BHI固體平板：腦心浸液37 g/L，瓊脂20 g/L；BHI培養(yǎng)基：腦心浸液37 g/L；種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，酵母浸膏10 g/L，NaCl 2.5 g/L，尿素2 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，大豆蛋白胨2 g/L，硫酸銨3.75 g/L，尿素10.25 g/L，MOPS 42 g/L，磷酸二氫鉀3.1 g/L，磷酸氫二鉀0.4 g/L，七水硫酸鎂0.375 g/L，七水硫酸鐵52 mg/L，氯化鈣14 mg/L，一水硫酸錳30 mg/L，七水硫酸鋅0.8 mg/L，無(wú)水硫酸銅1.96 mg/L，一水氯化鎳0.164 mg/L，生物素1.84 mg/L，PCA 295 mg/L，其中葡萄糖和尿素單獨(dú)滅菌；補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖500 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，(NH4)2SO420 g/L，其中葡萄糖單獨(dú)滅菌。

1.2發(fā)酵參數(shù)控制

1.2.1菌落劃線，活化及轉(zhuǎn)接。將實(shí)驗(yàn)室保存的SG菌株在BHI固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)36 h。挑取單菌落接種至BHI培養(yǎng)基，30 ℃，250 r/min培養(yǎng)12 h。之后轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基，起始OD600控制在0.2左右，30 ℃，250 r/min培養(yǎng)36 h。之后接種至裝有1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，接種量以起始OD600等于0.5來(lái)計(jì)算。

1.2.2發(fā)酵參數(shù)控制。溫度控制在30 ℃，硫酸銨調(diào)控pH穩(wěn)定在6.8，溶氧調(diào)控分為高中低3個(gè)水平，分別為35%、20%和5%(固定通氣量為2 L/min，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)數(shù)來(lái)維持溶氧)。30 h之后以4.5 mL/h的恒定速率補(bǔ)充補(bǔ)料培養(yǎng)基，每6 h取樣。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1生長(zhǎng)檢測(cè)。用OD600表示菌體生長(zhǎng)，取發(fā)酵液利用UV2350型紫外分光光度儀，在波長(zhǎng)600 nm處檢測(cè)吸光值。

1.3.2殘?zhí)菣z測(cè)。利用SBA-40E生物傳感分析儀測(cè)定殘?zhí)恰?/p>

1.3.3氨基酸檢測(cè)。氨基酸的測(cè)定依據(jù)DNFB衍生法[9]。將菌液離心取上清，樣品稀釋5倍，之后取稀釋后的液體150 μL，加入pH 9.07、0.5 moL/L的NaHCO3150 μL，再加入DNFB溶液(準(zhǔn)確吸取1 mL 2，4-二硝基氟苯，用乙腈定容到100 mL)150 μL，混勻，在暗處60 ℃水浴反應(yīng)1 h，反應(yīng)完成后暗處冷卻至室溫，加入1 050 μL pH 7.0的PBS緩沖溶液，暗處?kù)o置10 min，然后14 000 r/min離心10 min以去除雜質(zhì)，最后用有機(jī)濾膜過(guò)濾轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶。標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液的處理同上。流動(dòng)相A溶液為0.05 mol/L的乙酸鈉溶液。稱取無(wú)水乙酸鈉4.1 g，加入超純水990 mL，調(diào)節(jié)pH至6.8，再加入N，N-二甲基甲酰胺10 mL，有機(jī)濾膜過(guò)濾，然后超聲30 min排除氣泡。流動(dòng)相B溶液是乙腈與水按55∶45的體積比配制，流速1 mL/min，檢測(cè)溫度30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。液相型號(hào)為waters e2695，UV檢測(cè)器型號(hào)為Waters 2489，色譜柱為購(gòu)自廣州菲羅門的Gemini NX C18(5 μm × 250 mm)。

1.3.4乳酸檢測(cè)。乳酸檢測(cè)利用液相色譜法。發(fā)酵液離心取上清，用2.5 mmol/L的H2SO4稀釋3倍，并用無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾。乳酸標(biāo)準(zhǔn)液處理如上。流動(dòng)相為2.5 mmol/L的H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為55 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。色譜柱為Carbomix H-NP10，購(gòu)自蘇州賽分科技有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1不同溶氧條件對(duì)SG生長(zhǎng)和L-精氨酸積累的影響谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸是一個(gè)需氧的過(guò)程，氧氣的供應(yīng)對(duì)于谷氨酸棒狀桿菌的生長(zhǎng)和代謝都有顯著的影響。發(fā)酵過(guò)程中的溫度和pH如圖1a、b所示。為了防止發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不足，在發(fā)酵進(jìn)行到30 h時(shí)，以4.5 ml/h的恒定速率補(bǔ)充補(bǔ)料培養(yǎng)基(圖2a)。3種溶氧水平下的溶氧控制、SG的生長(zhǎng)和L-精氨酸積累如圖2b、2c和2d所示，在3種溶氧水平下，SG的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，其中20%溶氧水平的最高OD600要略高于5%溶氧和35%溶氧，且在發(fā)酵到達(dá)最高OD600之后，菌株的生長(zhǎng)波動(dòng)比較平穩(wěn)，說(shuō)明在發(fā)酵的中后期，20%的溶氧有助于保持正常的生理和代謝活性。

L-精氨酸的積累曲線顯示，20%溶氧水平下，SG的L-精氨酸積累要明顯優(yōu)于35%溶氧和5%溶氧，在48 h時(shí)20%溶氧的L-精氨酸積累達(dá)6.38 g/L，為35%溶氧水平的117.28%，5%溶氧水平的140.53%。

圖1 谷氨酸棒狀桿菌SG發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的參數(shù)控制Fig.1 The fermentation parameter control of Corynebacterium glutamicum SG producting L-arginine

圖2 谷氨酸棒狀桿菌SG發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的溶氧、生長(zhǎng)、耗糖及精氨酸積累曲線Fig.2 The DO，growth，sugar consumption and arginine accumulation curve of C. glutamicum SG producting L-arginine

2.2相關(guān)氨基酸和有機(jī)酸的代謝變化為了探究L-精氨酸差異的原因，分析了3種溶氧條件下SG的氨基酸和有機(jī)酸代謝變化，圖3是谷氨酸棒狀桿菌中精氨酸的代謝流程簡(jiǎn)圖，圖4(a～f)是谷氨酸棒狀桿菌代謝途徑中，產(chǎn)量差異較大的6種雜酸的積累曲線。3種溶氧水平中，5%溶氧時(shí)6種雜酸的積累都為最高；在20%和35%這2種溶氧水平下，鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸和乳酸的積累基本保持一致，而對(duì)于谷氨酸和丙氨酸，35%溶氧下的積累會(huì)更高。

在谷氨酸棒狀桿菌中，乳酸和丙氨酸同屬于丙酮酸的代謝產(chǎn)物，而丙酮酸是連接糖酵解途徑和TCA循環(huán)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[10]。乳酸和丙氨酸產(chǎn)量的提高會(huì)導(dǎo)致谷氨酸棒狀桿菌的TCA循環(huán)活力減弱，而賴氨酸合成的增加會(huì)進(jìn)一步分流TCA循環(huán)中流向精氨酸的可利用碳源和能量。谷氨酸和鳥(niǎo)氨酸是L-精氨酸的代謝前提物質(zhì)，其產(chǎn)量的增加表明谷氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-精氨酸的代謝通路受阻[11]。

綜合以上分析，可以推斷出5%溶氧條件下TCA的代謝減弱，草酰乙酸的代謝產(chǎn)物賴氨酸合成增加，同時(shí)谷氨酸轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)氨酸以及鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸的代謝通路受阻導(dǎo)致精氨酸的產(chǎn)量很低。35%溶氧條件下，雖然賴氨酸積累顯著減少，鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-精氨酸的通路正常，但丙氨酸和谷氨酸的積累仍然較高。20%溶氧條件下，丙氨酸、乳酸、賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸的積累都維持在非常低的水平，而谷氨酸雖然積累較多，但相比較其他2種溶氧水平，已經(jīng)有了明顯改善，因此，20%的溶氧條件最適合SG發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸。

圖3 谷氨酸棒狀桿菌中L-精氨酸的代謝流程Fig.3 The metabolic process of L-arginine in C. glutamicum

圖4 谷氨酸棒狀桿菌SG發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的雜酸積累分析Fig.4 Analysis of the accumulation of by-products in L-arginine produced by C. glutamicum SG fermentation

3 結(jié)論

該試驗(yàn)通過(guò)控制溫度、pH等，改變?nèi)苎醯陌l(fā)酵條件，探討了谷氨酸棒狀桿菌SG發(fā)酵生產(chǎn)精氨酸的生長(zhǎng)與代謝規(guī)律，發(fā)現(xiàn)20%溶氧條件下，菌體在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不會(huì)受到代謝副產(chǎn)物的積累而影響菌體正常的生理和代謝活性，菌體在發(fā)酵后期的生長(zhǎng)會(huì)更穩(wěn)定，有利于發(fā)酵產(chǎn)物的積累。且20%溶氧下，菌體發(fā)酵產(chǎn)生的副產(chǎn)物最少，碳源和能源可以更多地用于L-精氨酸的合成，因此L-精氨酸積累最多，得出結(jié)論：20%溶氧最適合于精氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。該試驗(yàn)確定谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵過(guò)程中溶氧的控制策略，建立了基因工程菌株產(chǎn)酸能力的評(píng)價(jià)體系，對(duì)精氨酸的實(shí)際工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)具有參考價(jià)值。