吳炳男，陳 麗，張?jiān)讫垼?婷，陸昌瑞

（東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201600）

PPR蛋白（pentatricopeptide repeat protein）是由多個以35個氨基酸組成的PPR模體為重復(fù)單位串聯(lián)排列組成的一類蛋白質(zhì)[1]，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的陸生植物中最大的蛋白質(zhì)家族之一[2-5]，參與RNA的剪接、編輯、穩(wěn)定和翻譯等重要生理過程[6]。DYW亞族是PPR蛋白家族中具有RNA編輯功能的一類蛋白質(zhì)，從結(jié)構(gòu)上可分為N端PPR串聯(lián)模體和C端E、E+及DYW結(jié)構(gòu)域[7-10]。N端PPR串聯(lián)模體中每兩個PPR模體反向平行形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，多個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)串聯(lián)排列形成一個凹腔，可與RNA堿基結(jié)合，具有識別底物RNA功能[11-15]。C端的DYW結(jié)構(gòu)域因其尾端具有保守的D-Y-W三肽而得名[1]，與RNA編輯過程中胞苷脫氨作用（C-U）有關(guān)，在其一級序列中包含HXE、CXXCH兩個典型的鋅指結(jié)構(gòu)序列[16]。在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中，DYW結(jié)構(gòu)域十分不穩(wěn)定，且溶解度很低。所以通過基因重組方式體外獲得大量、穩(wěn)定的DYW結(jié)構(gòu)域蛋白片段存在很大難度[17]。

Zn2+通過與鋅指結(jié)構(gòu)位點(diǎn)氨基酸結(jié)合從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，當(dāng)去除鋅指結(jié)構(gòu)的Zn2+后，結(jié)構(gòu)變得松散；而重新加入Zn2+之后，鋅指結(jié)構(gòu)又可逐漸恢復(fù)并穩(wěn)定[18]。因此，在一些體外重組蛋白表達(dá)中，通過添加Zn2+可提高相應(yīng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量[19]。本實(shí)驗(yàn)以DYW族PPR蛋白OTP82的鋅指結(jié)構(gòu)域作為研究對象，利用ppSUMO原核表達(dá)系統(tǒng)制備該蛋白，通過在培養(yǎng)過程中添加Zn2+，提高了外源表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，并對Zn2+的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，驗(yàn)證了Zn2+可在蛋白表達(dá)時直接作用于鋅指結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，幫助蛋白表達(dá)和折疊，并維持鋅指結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

1 儀器及材料

1.1 儀器

JN-02C低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀（JNBIO）；BIO-DL移液槍（Therom Fisher）；5810 R低溫道速離心機(jī)（Eppendorf）；Gen Pure UF超純水機(jī)（Therom Fisher）；Bio Mate 3S分光光度計(jì)（Therom Fisher）；Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽（Bio-Rad）；Mini-Sub cell GT水平電泳儀（Bio-Rad）；Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad）；Chemi DocTM XRS + Image LabTMsoftware（Bio-Rad）。

1.2 材料

菌株E.coliRosetta（DE3）、DH5α，ppSUMO表達(dá)載體，基因（otp82-dyw）均為本實(shí)驗(yàn)室自有保存；培養(yǎng)基，限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，Pfu DNA擴(kuò)增聚合酶，質(zhì)粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒，Ni-TED親和純化介質(zhì)，PCR產(chǎn)物純化試劑盒，卡那霉素，氯霉素，異丙基硫代半乳糖苷（ITPG）等[生工生物工程（上海）]。水為超純水。

1.3 引物

引物名稱及序列見表1，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物名稱及序列

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 抗生素及誘導(dǎo)劑儲存液的配制 取卡那霉素2 g，加入超純水溶解后定容至40 ml。過濾除菌后得到濃度為50 mg/ml的抗生素儲存液；相同方法配制25 mg/ml氯霉素儲存液；1 mol/L誘導(dǎo)劑IPTG儲存液。

2.1.2 親和純化緩沖液的配制 Buffer A（重懸液）：取1 mol/L Tris-HCl儲存液（pH 8.0）20 ml，1 mol/L NaCl儲存液200 ml，1 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）儲存液1 ml，甘油50 ml，混合后加入超純水至800 ml后，調(diào)pH至8.0，超純水定容至1 L。Buffer B（平衡液）：取1 mol/L Tris-HCl儲存液（pH 8.0）20 ml，1 mol/L NaCl儲存液200 ml，1 mol/L DTT 儲存液1 ml，甘油50 ml，1 mol/L咪唑儲存液20 ml，混合后加入超純水至800 ml，調(diào)pH至8.0，超純水定容至1 L。Buffer W（漂洗液）：取1 mol/L Tris-HCl儲存液（pH 8.0）20 ml，1 mol/L NaCl儲存液200 ml，1 mol/L DTT 儲存液1 ml，甘油50 ml，1 mol/L咪唑儲存液50 ml，混合后加入超純水至800 ml，調(diào)pH至8.0，超純水定容至1 L。Buffer E（洗脫液）：取1 mol/L Tris-HCl儲存液（pH 8.0）20 ml，1 mol/L NaCl儲存液200 ml，1 mol/L DTT 儲存液1 ml，甘油50 ml，1 mol/L咪唑儲存液250 ml，混合后加入超純水至800 ml，調(diào)pH至8.0，超純水定容至1 L。

2.2 克隆構(gòu)建、定點(diǎn)突變與菌株保存

2.2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 取模板基因（otp82-dyw）質(zhì)粒1 μl，加入濃度為10 μmol/ml的上下游引物Primer F、Primer R各1 μl，然后加入5 μl 10×PCR Buffer及1 μl dNTP和1 μl Pfu酶，用水補(bǔ)齊至50 μl，進(jìn)行PCR反應(yīng)（95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；最終延伸10 min）。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。利用限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I酶切PCR產(chǎn)物及ppSUMO載體（37 ℃，3 h），并采用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。使用T4 DNA連接酶將酶切后的載體與插入片段連接起來（16 ℃，過夜），并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素的抗性平板上過夜培養(yǎng)。挑取平板上的單克隆菌落，提取質(zhì)粒并測序鑒定。

2.2.2 定點(diǎn)突變 取野生型基因序列（otp82-dyw）為模板，將突變引物Primer-M1F與下游引物Primer R各1 μl加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)（95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；最終延伸10 min）。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到突變株M1基因片段。將突變引物（Primer-M2F、Primer R或Primer F、Primer-M1R）各1 μl加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件同上。然后將得到的兩組產(chǎn)物等比例混合后，取2 μl作為模板，利用引物Primer F/R各1 μl進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到突變株M2基因片段。然后利用相同方法構(gòu)建表達(dá)克隆，并進(jìn)行測序。

2.2.3 轉(zhuǎn)化及菌種保存 將測序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)涂板37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆菌落37 ℃過夜培養(yǎng)，得到表達(dá)單克隆菌株。將培養(yǎng)好的菌液加入等體積80%甘油后，-80 ℃保存。

2.3 外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將37 ℃過夜培養(yǎng)的表達(dá)克隆菌株菌液按1:100的比例接入卡那霉素及氯霉素雙抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。OD600=0.6時加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，16 ℃，225 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。5000 r/min離心收集菌體，加入Buffer A重懸（重懸菌液濃度為10%）。將菌體重懸液高壓勻漿破碎3次，條件為4 ℃，1300 MPa。細(xì)胞勻漿液20 000 r/min速離心，收集上清。采用Ni-TED進(jìn)行目標(biāo)蛋白的親和純化。首先，重力柱中的親和純化介質(zhì)用5倍柱體積的Buffer B平衡。后加入上清，使上清流經(jīng)親和介質(zhì)2次。之后用30倍柱體積的Buffer W漂洗。最后用5倍柱體積的Buffer E洗脫目標(biāo)蛋白。各個步驟留取蛋白樣品進(jìn)行Bradford法濃度檢測及SDS-PAGE、Western-Blot檢測。

2.4 快速誘導(dǎo)表達(dá)

將37 ℃過夜培養(yǎng)的表達(dá)克隆菌株菌液按1:100的比例接入LB培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)OD600=0.6時取1 ml培養(yǎng)液留樣。之后加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，37 ℃，225 r/min誘導(dǎo)3 h。取1 ml培養(yǎng)液留樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

2.5 表達(dá)菌株加Zn2+培養(yǎng)

將37 ℃過夜培養(yǎng)的表達(dá)克隆菌株菌液按1:100的比例接入卡那霉素及氯霉素雙抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)OD600=0.6時加入IPTG溶液至終濃度為0.1 mmol/L，并加入ZnCl2溶液至終濃度分別為0，0.125，0.25，0.375，0.5，1 mmol/L。16 ℃，225 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。5000 r/min離心收集菌體備用。

2.6 親和純化

將同一份含Zn2+的上清分成3等份，并在其中加入EDTA使其終濃度分別為0，10，20 mmol/L。將含不同濃度EDTA的上清分別用1 ml Ni-TED（EDTA耐受型）親和純化介質(zhì)進(jìn)行純化，并對蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

2.7 Zn2+作用時間探索

分別在培養(yǎng)、誘導(dǎo)及細(xì)胞破碎時添加Zn2+至終濃度為1 mol/L。高壓破碎細(xì)胞后，14 000 r/min、4 ℃離心1 h。取上清留取樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

2.8 不同二價離子作用對比

將37 ℃過夜培養(yǎng)的表達(dá)克隆菌株菌液按1:100的比例接入卡那霉素及氯霉素雙抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。OD600=0.6時加入IPTG溶液至終濃度為0.1 mmol/L，并分別加入ZnCl2、MnCl2及NiSO4溶液至終濃度為1 mmol/L。16 ℃，225 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。取全細(xì)胞留樣，進(jìn)行SDS-PAGE及Western-Blot檢測。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度Zn2+對鋅指結(jié)構(gòu)蛋白穩(wěn)定性的影響

通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建蛋白表達(dá)質(zhì)粒ppSUMOOTP82-DYW質(zhì)粒（ppSUMO-OD）。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到目的蛋白His-SUMO-OTP82-DYW（HSOD）。其理論相對分子質(zhì)量（Mr）為21.8×103，目的蛋白示意圖見圖1 A，蛋白中含保守的鋅指結(jié)構(gòu)位點(diǎn)HXE、CXXCH，并在目的蛋白N端添加His-SUMO融合標(biāo)簽，用于目的蛋白的表達(dá)及純化。

誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1 B、C。不添加Zn2+時，全細(xì)胞樣品中目的蛋白降解嚴(yán)重。添加Zn2+后，目的蛋白降解情況被抑制，目的蛋白穩(wěn)定性隨Zn2+濃度的提高而提高。當(dāng)Zn2+濃度達(dá)到1 mmol/L時，目的蛋白最為穩(wěn)定。Zn2+濃度超過1 mmol/L后，表達(dá)菌株生長受到明顯抑制，Zn2+濃度超過1.5 mmol/L后，表達(dá)菌株生長停滯。圖1 D、E表明Zn2+同樣可增加上清中可溶性目的蛋白的穩(wěn)定性。綜上，Zn2+可有效提高鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定性。

圖1 Zn2+對鋅指結(jié)構(gòu)蛋白穩(wěn)定性的影響

3.2 Zn2+對目的蛋白親和純化效果的影響

通過添加Zn2+，目的蛋白的穩(wěn)定性得到了明顯提升。然而高濃度的Zn2+會影響組氨酸標(biāo)簽（6×His）與親和介質(zhì)的親和能力，使柱結(jié)合效率降低，需添加金屬離子螯合劑EDTA去除過量的Zn2+，從而提高柱結(jié)合效率。結(jié)果見圖2。由圖2可見，不添加EDTA的洗脫液樣品中沒有出現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶，證明目的蛋白在高濃度的Zn2+存在時難以與親和介質(zhì)結(jié)合；添加EDTA后，目標(biāo)蛋白與親和介質(zhì)的結(jié)合效率明顯提高，洗脫液樣品中出現(xiàn)明顯目的蛋白條帶，且EDTA濃度為10 mmol/L時結(jié)合效果及純化效果最佳；EDTA濃度達(dá)到20 mmol/L 時，因過量EDTA的競爭性抑制作用，導(dǎo)致目的蛋白與Ni2+的結(jié)合能力降低。因此，上清中添加10 mmol/L的EDTA可有效地增加目的蛋白的親和純化效率。

圖2 Zn2+對目的蛋白親和純化效果的影響

3.3 最優(yōu)條件下融合蛋白親和純化效果

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論，確定誘導(dǎo)表達(dá)時Zn2+添加濃度為1.0 mmol/L；親和純化時上清液中EDTA添加濃度為10 mmol/L。在此條件下，進(jìn)行了融合蛋白HSOD誘導(dǎo)表達(dá)及親和純化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，融合蛋白的降解情況得到了明顯抑制。蛋白純度及純化效率也有了明顯提高（見圖3）。利用考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行灰度分析，得蛋白純度約63%。經(jīng)計(jì)算得到目標(biāo)蛋白得率為每升菌液7.96 mg。

圖3 最優(yōu)條件下目的蛋白的親和純化效果

3.4 Zn2+穩(wěn)定鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的機(jī)制初探

發(fā)現(xiàn)Zn2+可明顯提高OTP82蛋白DYW鋅指結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性之后，對Zn2+添加時間、Zn2+作用位點(diǎn)及Zn2+作用的特異性進(jìn)行了初步探索。

3.4.1 Zn2+作用于蛋白表達(dá)過程 Zn2+作用時間點(diǎn)的探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，在全細(xì)胞樣品中，相比于不添加Zn2+的樣品，培養(yǎng)及誘導(dǎo)時添加Zn2+均可顯著提高目的蛋白穩(wěn)定性；而在上清樣品中，破碎時添加Zn2+后，目的蛋白的降解情況并未得到改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Zn2+在鋅指結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)時幫助蛋白表達(dá)，并穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。

圖4 Zn2+作用時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 不同二價離子對鋅指結(jié)構(gòu)蛋白穩(wěn)定性的影響

3.4.2 不同二價離子對鋅指結(jié)構(gòu)蛋白穩(wěn)定性的影響Zn2+，Mn2+及Ni2+作用結(jié)果見圖5。雖然Zn2+、Mn2+及Ni2+同為過渡金屬的二價離子，但添加Mn2+、Ni2+均無法穩(wěn)定目的蛋白，僅Zn2+可有效提高鋅指結(jié)構(gòu)蛋白穩(wěn)定性。

3.4.3 Zn2+作用位點(diǎn)的探索 對兩個保守鋅指位點(diǎn)進(jìn)行丙氨酸突變得到突變株M1（HXE→AXA）、M2（CXXCH→AXXAA），見圖6A。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果見圖6 B、C。全細(xì)胞樣品中，由于突變株破壞了部分鋅指結(jié)構(gòu)，Zn2+對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響要明顯弱于野生型菌株。因此，Zn2+只可有效地穩(wěn)定鋅指結(jié)構(gòu)完整的蛋白質(zhì)。綜上所述，Zn2+作用于鋅指結(jié)構(gòu)。

圖6 Zn2+作用位點(diǎn)的探索

4 討論

鋅指蛋白作為生物界中最重要的功能性蛋白之一，一直是科學(xué)界的研究熱點(diǎn)。如何對其進(jìn)行大量、穩(wěn)定的體外表達(dá)純化也成為鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)及功能研究的前提。本文以O(shè)TP82蛋白中的保守鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)檠芯繉ο螅C明Zn2+在鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的體外表達(dá)過程中扮演重要角色。這為其他鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的體外表達(dá)提供了重要參考及依據(jù)。

研究中通過添加適量的EDTA，消除過量Zn2+對組氨酸標(biāo)簽親和純化效率的負(fù)面影響。這也為其他鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的組氨酸標(biāo)簽親和純化或其他需添加金屬離子的蛋白質(zhì)組氨酸標(biāo)簽親和純化過程的優(yōu)化提供新的思路。

Zn2+的作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Zn2+濃度及鋅指結(jié)構(gòu)的完整性都直接影響鋅指蛋白的穩(wěn)定性。這也說明在鋅指蛋白的表達(dá)及純化體系中，需添加適量的Zn2+以保持蛋白的穩(wěn)定。同時，也提示Zn2+在鋅指蛋白行使功能方面具有重要作用。

鋅指蛋白是真核生物中最豐富的轉(zhuǎn)錄因子之一，在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過程中發(fā)揮重要作用。而鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)及功能研究又依賴于體外高效、穩(wěn)定的表達(dá)、純化。因此，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)及功能方面的研究有重要的借鑒意義。

5 結(jié)論

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在蛋白原核表達(dá)體系中添加Zn2+可有效提高OTP82蛋白鋅指結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性。親和純化條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞上清中添加10 mmol/L EDTA可有效提高融合蛋白HSOD的組氨酸標(biāo)簽與親和介質(zhì)的結(jié)合效率。Zn2+對鋅指結(jié)構(gòu)蛋白穩(wěn)定性影響機(jī)制探究結(jié)果顯示，Zn2+作用于鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)過程，并穩(wěn)定其高級結(jié)構(gòu)。與Mn2+等二價離子的對比實(shí)驗(yàn)證實(shí)，只有Zn2+可有效提高鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定性。蛋白中保守的鋅指結(jié)構(gòu)位點(diǎn)突變后，Zn2+無法顯著提升鋅指蛋白的穩(wěn)定性，表明Zn2+通過鋅指結(jié)構(gòu)位點(diǎn)提高鋅指結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。