畢春艷，薛劍橋，翟兆玲

（淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086）

退黃保肝膠囊是由赤芍、茵陳、白術(shù)、枳殼、梔子、郁金、丹參、金錢草等十五味藥組成，有疏肝健脾，清利濕熱，利膽退黃的作用，用于急慢性黃疸型肝炎。方中茵陳為君藥，具有清利濕熱，利膽退黃[1]的功效，其中綠原酸為其主要成分之一?，F(xiàn)代研究表明綠原酸是一類分布廣泛且有諸多藥理作用的天然化合物，具有抗氧化、抗菌、抗突變和抗癌變、降血脂和降血壓、保護(hù)心血管和中樞神經(jīng)、抑制糖尿病、抗紫外和抗輻射、抗白血病、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞保護(hù)、保肝、抗內(nèi)毒素、抗抑郁和焦慮等多方面的藥理作用[2]。枳殼為臣藥，現(xiàn)代研究表明，枳殼主要含黃酮、生物堿、揮發(fā)油等化學(xué)成分，且具有廣泛的藥理作用，常作為理氣藥，對(duì)脂肪肝引起的轉(zhuǎn)氨酶升高和肝內(nèi)脂肪浸潤(rùn)、肥胖、高脂血癥進(jìn)行治療和調(diào)理[3]。枳殼的藥典主要質(zhì)控成分為柚皮苷和新橙皮苷[1]。為提高退黃保肝膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保障臨床用藥安全，本文采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定該制劑中綠原酸、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），配備SPD-20A UV/VIS檢測(cè)器、LC-solution工作站；Mettler Toledo MS205DU電子天平（梅特勒-托利多公司）；BWS-10恒溫水浴鍋（上海一恒公司）。

1.2 材料

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-201415，含量以96.2%計(jì)），柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)110722-201613，含量以94.3%計(jì)），新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)111857-201102，含量以99.6%計(jì)），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；退黃保肝膠囊3批，批號(hào)分別為170318，170412，170521，均為醫(yī)院制劑；液相用乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為InertSustain C18Superb（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm；柱溫為35 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。臨用時(shí)，精密吸取上述3種對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各1 ml，置5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，加熱回流60 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按照退黃保肝膠囊處方制備不含茵陳、枳殼的樣品，按2.2.2項(xiàng)方法操作，制得陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，陰性樣品在對(duì)照品的保留時(shí)間處，無(wú)色譜峰干擾（見圖1）。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液1，5，10，20，30 μl，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸回歸方程為Y=2×106X-523，r=0.9999，柚皮苷回歸方程為Y=2×106X+388，r=0.9999，新橙皮苷回歸方程為Y=2×106X+436，r=0.9996，結(jié)果表明，綠原酸在0.0387～1.1610 μg、柚皮苷在0.0399～1.1970 μg、新橙皮苷在0.0414～1.2420 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.41%，0.35%，0.36%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)為170318）樣品，按2.2.2項(xiàng)方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果，綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷平均含量分別為1.3398，1.8978，2.2241 mg/g，RSD分別為0.9%，1.0%，1.2%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)為170318）樣品，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于0，6，9，12，18，21，24 h按規(guī)定的色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.19%，0.31%，0.27%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

分別取同一批已知含量的樣品（批號(hào)為170318）約0.5 g，精密稱定，共6份，分別精密加入綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液、柚皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液、新橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液3，5，5 ml，揮干甲醇，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷的平均回收率分別為99.7%，99.3%，99.6%，RSD分別為0.9%，1.3%，1.1%（n=6）。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)分別為170318，170412，170521），分別按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見表1。

表1 供試品中綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定（n=3）

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

分別取綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品溶液在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，最大吸收波長(zhǎng)分別為327，283，283 nm，因在283 nm得到的峰形、峰高最為適宜，故選用283 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

對(duì)比了乙腈-0.4%磷酸溶液（13:87）[1]，乙腈-0.1%磷酸溶液（10:90）[4]，乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）[5]，乙腈-水（20:80）[6]，乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（16:10:74）[7]的分離效果，結(jié)果表明以乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）為流動(dòng)相時(shí)，樣品中各組分的分離度最好，故采用乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）為流動(dòng)相。

3.3 提取溶劑和提取時(shí)間的確定

分別考察了以50%甲醇[7]、70%甲醇、75%甲醇[8]、甲醇[6]、50%乙醇、70% 乙醇[9]、 90%乙醇、乙醇為溶劑的加熱回流提取效果，結(jié)果表明70%甲醇提取效果優(yōu)于其他溶劑。同時(shí)對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明加熱回流60 min能提取完全，故確定用70%甲醇加熱回流提取60 min。