趙曉曉， 謝坤良， 賈冬冬， 張舒夢， 孟 敏， 孫風麗， 張 超， 奚亞軍

(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院， 陜西 楊凌 712100)

柳枝稷(Panicumvirgatum)是多年生暖季型C4叢生草本植物，原產(chǎn)于北美，主要用于水土保持，或作為優(yōu)良牧草和觀賞植物。因其木質(zhì)纖維素含量高、生物質(zhì)產(chǎn)量大、生態(tài)適應(yīng)性強，近年來成為國際上公認的能源模式作物而得到深入研究[1-3]，研究內(nèi)容涉及生理學、遺傳學、生態(tài)學等[4-8]多方面。柳枝稷在我國無論作為牧草、水土保持植物還是能源作物都具有廣闊的種植前景[9-11]，但種子質(zhì)量差與休眠等因素影響柳枝稷的成功建植[12]。幼穗分化過程的起始意味著植株從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，開始花芽的產(chǎn)生和結(jié)實器官的形成[13]，結(jié)實器官的特點直接影響到種子產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀[14]，但關(guān)于柳枝稷幼穗分化的研究在國內(nèi)外少見報道。另一方面，大幅度提高生物質(zhì)產(chǎn)量是能源用柳枝稷品種選育的主要目標[15]，有研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)生長期的延長與開花期的推遲使得柳枝稷表現(xiàn)出更高的生物量[16]，去除穗部可提高莖生物量分配比例進而柳枝稷生物量顯著增加[17]。幼穗分化是營養(yǎng)生長與生殖生長的轉(zhuǎn)折點，柳枝稷幼穗分化過程的探索對于柳枝稷的生長發(fā)育調(diào)控、栽培管理及品種選育都具有重要意義。柳枝稷屬于禾本科，為圓錐花序，研究人員已經(jīng)對多種禾本科草類的幼穗分化過程進行了觀察與論述，包括糖蜜草(Melinisminutiflora)、早熟禾(Poapratensi)、高羊茅(Festucaarundinacea)等[18-20]花序類型與柳枝稷相同的禾草及多花黑麥草(Ldliummultiflorum)、披堿草(Elymusdahuricus)、狗牙根(Cynodondactylon)等[21-23]與柳枝稷花序類型不同的禾草，它們的幼穗分化特點及分化時期為柳枝稷幼穗分化規(guī)律的探索提供了參考。本研究觀察了柳枝稷幼穗分化過程中的內(nèi)部解剖特點及對應(yīng)的外部形態(tài)特征并記錄了植株的生長時期與物候期等，旨在為柳枝稷生殖生長特性與種子形成發(fā)育規(guī)律的揭示及其栽培管理調(diào)控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

供試材料為柳枝稷低地型品種“Alamo”，該材料種植在西北農(nóng)林科技大學北校區(qū)試驗田(108.06° E，34.29° N)，試驗?zāi)甓葹樯诘谌辍?018年5月22日觀察到供試材料的第三伸長節(jié)可見，此后每隔2～3天取15個生長發(fā)育較一致的分蘗，記錄葉齡、葉齡余數(shù)、可見葉數(shù)及幼穗長度等植株形態(tài)指標后于體視顯微鏡(OLYMPUS)下解剖，觀察其生長錐發(fā)育情況并拍照；植株進入孕穗期后取花序不同部位單個小穗解剖觀察；植株抽穗后選取特定分蘗掛牌，每天觀察其開花規(guī)律，直至整個花序開花結(jié)束。幼穗分化時期的劃分以幼穗上部分化狀態(tài)為準。某期柳枝稷花序相對生長速率(Relative growth rate，RGR)的計算公式為：RGR= (L2- L1) /t，式中L2為某期結(jié)束時的花序長度，L1為某期開始時的長度，t為某期歷時時間，數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2013錄入并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼穗分化過程

根據(jù)柳枝稷幼穗分化各階段形態(tài)特點(如圖1)，參考禾本科花序發(fā)育過程的分期標準[18-20,23-25]，將柳枝稷幼穗分化過程分為9個時期，各時期主要形態(tài)特點描述如下：

2.1.1苞原基分化期 營養(yǎng)生長錐不斷分化葉原基，生長點呈半圓球形，被葉原基包裹覆蓋(圖1-A)。5月28日取材發(fā)現(xiàn)生長錐不再分化葉原基，頂部伸長，略高于最后一片葉原基，(圖1-B)剝開葉原基可見生長錐基部出現(xiàn)一圈突起即第一苞原基(圖1-1a)。第一苞原基的出現(xiàn)標志著花序分化的開始。隨著生長錐不斷伸長繼而分化出第二苞、第三苞……整個生長錐呈圓柱形，可見層層環(huán)狀突起(圖1-1b)。

2.1.2枝梗原基分化期 苞原基腋部向外突出形成1次枝梗原基并逐漸從下到上分化直至生長錐的頂部，生長錐不斷伸長，1次枝梗原基的數(shù)目不斷增多(圖1-2a)；在1次枝梗原基分化后期，生長錐基部的1次枝梗原基基部又產(chǎn)生半球狀突起即2次枝梗原基，仍然從下到上分化(圖1-2b)；當生長錐上部分化出2次枝梗原基時，其基部的2次枝梗原基再次產(chǎn)生突起漸次向上分化，即3次枝梗原基。整個幼穗花序呈錐體由許多突起組成，將生長錐頂部環(huán)在中央(圖1-2c)。

2.1.3小穗分化期 花序頂部枝梗發(fā)育較快，不久便分化出小穗原基，隨后漸次向下分化，單個枝梗上則是從基部開始依次向上分化。隨著小穗原基不斷增長，花序頂部率先分化出的小穗原基基部很快便會分化出穎片原基，包括外穎原基和內(nèi)穎原基。小穗排列緊密，花序呈明顯穗狀(圖1-3a,3b)。

2.1.4小花原基分化期 首先在內(nèi)穎原基上部分化出第一小花即不育花的外稃原基及其小花原基，爾后在第一小花的小花原基上方分化出第二小花即可育花的外稃原基及其小花原基，內(nèi)稃尚未開始分化。外穎生長速度較快，長出刺芒并高于小花原基，小穗梗開始伸長(圖l-4a,4b)。

從整個幼穗花序來看，頂端的小穗較早分化出小花原基，然后向下依次分化；在單個枝梗上，依然是最頂端小穗最早分化出小花原基，爾后漸次向下分化，發(fā)育順序與分化順序相同。

2.1.5雌雄蕊原基分化期 當外穎在小花頂部逐漸閉合時，可育花的小花原基表面形成3個半球狀突起即雄蕊原基，其包圍著中央的雌蕊原基，可育花雌雄蕊的發(fā)育早于不育花并始終領(lǐng)先不育花雌雄蕊的發(fā)育。雌雄蕊原基直徑不斷增大呈圓球形，內(nèi)穎開始伸長，其頂端同樣具有刺芒，小穗、小穗梗及枝梗的長度顯著增加(圖1-5a-5c)。

2.1.6藥隔形成期 雄蕊橫向增長，由圓球形變得寬扁，頂部向下縱裂似一條“淺溝”將其一分為二。內(nèi)穎與外穎繼續(xù)伸長，外穎可見明顯中脈(圖1-6a-6c)。

2.1.7花藥四分期 雄蕊頂部呈“十”字樣再次縱向裂變，花藥雛形可見。外稃開始伸長，其對側(cè)產(chǎn)生內(nèi)稃原基，不育花內(nèi)外稃發(fā)育早于可育花(圖1-7a-7c)。

2.1.8花藥伸長期 第一階段，花藥縱向伸長呈四棱柱狀，雌蕊頂部凹陷產(chǎn)生兩個突起，內(nèi)稃開始伸長，內(nèi)穎長度逐漸超過外穎，頂端刺芒由白色變?yōu)樽仙?圖1-8a-8c)；第二階段，可育花花藥顏色由半透明變?yōu)辄S綠色，不育花花藥仍呈半透明，雌蕊二叉狀柱頭形成，此時漿片明顯可見呈半透明且多汁，不育花雌蕊退化，內(nèi)外穎邊緣由綠色變?yōu)樽仙?圖1-8d-8f)；第三階段，花藥與柱頭顯著伸長，可育花花藥長度約為其寬度的3倍以上，花藥顏色再次發(fā)生改變，可育花花藥鵝黃色，不育花花藥黃綠色，內(nèi)外稃未完全閉合，內(nèi)外穎著色加深，小穗長度達到最大(圖1-8g-8i)。植株處于抽穗期，枝梗排列緊密，花序呈穗狀(圖1-C)。

2.1.9羽狀柱頭形成期 第一階段，雌蕊二叉狀柱頭端部產(chǎn)生顆粒狀突起，子房增大，兩個花柱間距明顯，可育花花藥由鵝黃色變?yōu)榻瘘S色，不育花花藥由黃綠色變?yōu)轾Z黃色(圖1-9a-9c)；第二階段，柱頭上的突起逐漸伸長為細毛，毛間粘連、緊湊，不育花與可育花花藥均呈金黃色(圖1-9d-9f)；第三階段，柱頭上的細毛進一步伸長，均勻、松散分布，白色羽狀柱頭成形，花柱彎曲，可育花花藥約為不育花花藥的1.3-1.5倍。漿片白色、革質(zhì)化，內(nèi)外稃逐漸閉合，小穗明顯增粗(圖1-9g-9i)?；ㄐ蛑Ｓ擅芗o湊變得松散，依次向外螺旋展開，呈圓錐形(圖1-C)。分化完全的小穗與小花的結(jié)構(gòu)組成如圖1-D所示。

隨后雌雄蕊逐漸發(fā)育成熟，羽狀柱頭的篷松細毛由白色變?yōu)樽仙?，不育花花藥與可育花花藥近等長，花藥、子房增大使得內(nèi)外穎不再閉合，植株進入開花期，可育花先于不育花開花，其內(nèi)外稃張開，花絲將花藥頂出穎殼以散粉，柱頭向兩側(cè)伸展接受花粉(圖1-a-e)。

圖1 柳枝稷幼穗分化過程Fig.1 The spike differentiation progress in switchgrass注：A營養(yǎng)生長錐；B生殖生長錐；1a苞原基分化期；1b苞原基繼續(xù)分化過程；2a一次枝梗原基分化期；2b二次枝梗原基分化期；2c三次枝梗原基分化期；3a小穗分化期；3b幼穗局部放大可見小穗原基；4a-4b小花原基分化期的幼穗及幼穗局部放大可見小花原基；5a-5c雌雄蕊原基分化期的花序、小穗及小穗解剖后可見雌雄蕊原基突起；6a-6c藥隔形成期植株頂部、小穗及雄蕊的形態(tài)；7a-7c花藥四分期植株頂部、小穗及雄蕊的形態(tài)；8a-8c花藥伸長期第一階段的小穗、雄蕊及雌蕊；8d-8f花藥伸長期第二階段的小穗、雄蕊及雌蕊；8g-8i花藥伸長期第三階段的小穗、雄蕊及雌蕊；9a-9c羽狀柱頭形成期第一階段的小穗、雄蕊及雌蕊；9d-9f羽狀柱頭形成期第二階段的小穗、雄蕊及雌蕊；9g-9i羽狀柱頭形成期第三階段的小穗、雄蕊及雌蕊；C抽穗期花序形態(tài)的變化；D柳枝稷小穗的結(jié)構(gòu)；a-b開花期的雌蕊與雄蕊；c枝梗最頂端小穗可育花開花；d單個小穗中可育花先開花，不育花內(nèi)外稃仍閉合；e枝梗最頂端小穗不育花與下位小穗可育花開花Note:A Nutrient growth cone;B Reproductive growth cone;1a Differentiation stage of bract primordia;1b Continued differentiation stage of bract primordia;2a Differentiation stage of primary branch primordia;2b Differentiation stage of secondary branch primordia;2c Differentiation stage third branch primordia;3a Differentiation stage of spikelet;3b Spikelet primordia (local enlargement);4a-4b The spike and its local enlargement in differentiation stage of floret primordia;5a-5c Differentiation stage of stamen and pistil primordia;6a-6c Stamen connective formation stage;7a-7c Anther quarters stage;8a-8c The first subphase of anther elongation;8d-8f The second subphase of anther elongation;8g-8i The third subphase of anther elongation;9a-9c The first subphase of feathery stigma formation;9d-9f The second subphase of feathery stigma formation;9g-9i The third subphase of feathery stigma formation;C Changes of inflorescence during heading stage;D Spikelet structure of switchgrass；a-b Mature stamen and pistil in blooming stage;d-e Flowering sequence

綜上所述，柳枝稷幼穗分化過程的主要分期特征及分化時間見表1：本研究發(fā)現(xiàn)小花原基分化期及其之前各分化期持續(xù)時間為10天，雌雄蕊原基分化期至花藥四分期的每個時期只需6天即可完成分化，花藥伸長期與羽狀柱頭形成期所需分化時間均為12天，可見柳枝稷幼穗分化過程是一個先慢后快又逐漸變慢的過程，柳枝稷幼穗分化起始至開花約需3個月。

表1 柳枝稷幼穗分化過程的分期及各期主要特征Table 1 Spike differentiation stages and their major characteristics in switchgrass

本研究記錄了柳枝稷幼穗分化各時期的花序長度等植株形態(tài)指標，為了更好地闡明植株的生長狀態(tài)，我們參照多年生牧草生長時期的劃分[26]標明了柳枝稷幼穗發(fā)育各時期所處的生長時期(En:Elongation-Stem elongation，伸長階段莖發(fā)育狀態(tài)；Rn:Reproductive-Floral development，繁殖階段花序發(fā)育狀態(tài))，同時也劃定了物候期，以期從大田植株的外觀形態(tài)大致判斷柳枝稷幼穗分化進程。由表2可發(fā)現(xiàn)柳枝稷雌雄蕊原基分化期之前的發(fā)育在拔節(jié)期完成，植株從E4節(jié)伸長至E6節(jié)，葉齡、葉齡余數(shù)及可見葉數(shù)變化明顯，但幼穗生長速度較慢，長度不足5 mm；從雌雄蕊原基分化期開始，植株進入孕穗期，花序長度迅速增加，小穗也逐漸增大，葉齡在花藥四分期達最大值，此時植株開始抽穗，花序繼續(xù)伸長生長，R0至R2階段伴隨著E7、E8的伸長。所以，柳枝稷幼穗分化前期葉齡、葉齡余數(shù)及可見葉數(shù)能在一定程度上反應(yīng)幼穗分化進程，柳枝稷幼穗分化中后期主要是花序及小穗的長度(表2)與形態(tài)(圖1-8,9,C)可輔助判斷幼穗分化所處時期。

表2 柳枝稷幼穗分化各時期對應(yīng)的植株形態(tài)Table 2 Corresponding plant morphology of spike differentiation stage in switchgrass

注：葉齡：以展開葉的數(shù)目計，展開葉以葉片與葉鞘交界處的葉枕露出為準；可見葉數(shù)：植株已經(jīng)長出并能夠看見的葉片數(shù)目

Note:Leaf age:The number of unfurled leaves whose collar were visible;Visible leaves number:The number of visible leaves that the plant had grown

為了衡量柳枝稷花序在幼穗分化各期的生長速率變化，我們以柳枝稷幼穗分化時期為橫坐標，以柳枝稷花序的相對生長速率為縱坐標，得到如圖2所示的花序生長曲線，可發(fā)現(xiàn)柳枝稷花序在分化初期即苞原基分化期至小花原基分化期生長較慢，而在雌雄蕊原基形成期花序相對生長速率迅速增大并在整個孕穗期保持穩(wěn)定，隨后在花藥伸長期相對生長速率達到最大值，在羽狀柱頭形成期又逐漸變小，所以柳枝稷的花序呈慢-快-慢的“S”形曲線生長。

圖2 柳枝稷幼穗分化過程中花序相對生長速率的變化Fig.2 Changes in relative growth rate of the inflorescence during the spike differentiation progress in switchgrass

2.2 小花開花習性

從整個花序來看，頂端小花即直接著生在花梗上的小花先開花，再漸次向下開放，上位枝梗開花早于下位枝梗，但上位枝梗小花開花后下位枝梗隨即開花，鄰近的各1次枝梗之間其開花時間是重疊的；在單個1次枝梗上，1次枝梗上位小花先開花，隨后1次枝梗下位小花與各2次枝梗上位小花開花，接著各2次枝梗下位小花與3次枝梗上位小花也依次向下開放，但下位枝梗上位小花早于上位枝梗下位小花的開放，3次枝梗上的下位小花最晚開花，說明單個小枝梗上，小花仍然是從上到下依次開花；對于每個小穗來說，依然是上部可育花先于基部不育花開花。開花期中下部各次枝梗上均有小花退化干枯的現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

3.1 柳枝稷幼穗分化時期的劃分及鑒定

許多學者對禾本科糧食作物、牧草及草坪草的幼穗分化過程進行了研究，只是劃分的標準不一：付娟等[24]依據(jù)生長錐外部形態(tài)特點以及枝梗和小穗的細胞學形態(tài)特點將水稻(Oryzasativa)幼穗分化過程分為4個時期；王俊英等[25]依據(jù)小麥(Triticumaestiuum)小花發(fā)育過程的內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)和對應(yīng)的穗部性狀與外部形態(tài)如始伸節(jié)間等，將小麥小花分化過程分為8個時期；李煜祥等[18]依據(jù)幼穗發(fā)育程度將糖蜜草幼穗分化過程分為9個時期并記錄了與之對應(yīng)的幼穗長度和葉齡余數(shù)；劉露等[19-20]將高羊茅和草地早熟禾的幼穗分化過程分為5個時期并對其開花習性和發(fā)育各階段所處的物候期進行了詳細觀察；程曉麗等[23]通過對莖尖發(fā)育動態(tài)的觀察，將狗牙根花序分化過程分為8個時期并記錄了各時期取樣時生殖枝上展開的葉片數(shù)。柳枝稷與同為圓錐花序的水稻、糖蜜草、高羊茅及草地早熟禾幼穗分化過程相似，但水稻與糖蜜草分化時期的劃分既有幼穗外觀形態(tài)又有細胞學層次；高羊茅與草地早熟禾的雌雄蕊形成期概括了雌雄蕊原基開始分化到最后成熟；而小麥與狗牙根雖然與柳枝稷花序類型不同，但對小花分化期及以后的發(fā)育階段有著較為詳細的敘述。綜合以上禾本科物種的幼穗形態(tài)描述及柳枝稷幼穗發(fā)育的形態(tài)特點，本研究將柳枝稷幼穗分化過程分為9個時期：苞原基分化期、枝梗原基分化期、小穗分化期、小花原基分化期、雌雄蕊原基分化期、藥隔形成期、花藥四分期、花藥伸長期、羽狀柱頭形成期。

幼穗發(fā)育初期體積較小，肉眼難以觀測，必須借助解剖鏡與顯微鏡辨別，這在生產(chǎn)實踐上難以廣泛應(yīng)用，我們可以借助生殖器官與營養(yǎng)器官發(fā)育的相關(guān)性及發(fā)育階段所處的物候期來輔助判斷幼穗分化時期[13,22]。宮玉麟[27]以葉齡指數(shù)鑒定大麥幼穗分化進程；王俊英等[25]則記錄了與小麥小花分化過程對應(yīng)的穗長、葉齡余數(shù)、始伸節(jié)間及生育期等外部形態(tài)特征；謝菲等[22]研究了披堿草幼穗分化與物候期、幼穗長度、株高等植株形態(tài)的關(guān)系。在本實驗中，柳枝稷幼穗分化前期，植株處于拔節(jié)期(包括苞原基分化期至小花原基分化期計4個時期)與孕穗期(包括雌雄蕊原基分化期與藥隔形成期)，葉齡、葉齡余數(shù)及可見葉數(shù)隨幼穗分化過程的進行變化顯著，因而可作為柳枝稷幼穗分化進程的辨別依據(jù)，在植株達到最大葉齡時(花藥四分期)植株開始抽穗，我們便可從花序與小穗的長度及形態(tài)來判別柳枝稷幼穗分化進程(花藥伸長期至羽狀柱頭形成期計2個時期)。

3.2 柳枝稷幼穗分化的特點

柳枝稷幼穗分化是一個先慢后快又變慢的過程，同花序的相對生長速率變化趨勢相同，可見柳枝稷花序的分化與生長規(guī)律一致。柳枝稷幼穗分化起始于E4拔節(jié)期，而高羊茅[20]與草地早熟禾[19]起始于返青期，但三個物種的小穗分化期與穎花原基分化期都在拔節(jié)期完成且都是從雌雄蕊原基分化期開始進入孕穗期，所以三者的幼穗分化規(guī)律是相似的。柳枝稷小花的分化、發(fā)育及開花順序，無論花序整體還是單個枝梗，都是從上向下依次進行的，這與糖蜜草、早熟禾及高羊茅[18-20]等有所不同，糖蜜草等花序頂端枝梗上的小穗先分化出小花原基，然后逐步向下，單一枝梗上，小花原基卻從下而上分化，但最頂端小穗上的小花原基先發(fā)育，然后從下向上發(fā)育，即頂端數(shù)第二小花發(fā)育最晚，且它們的開花順序與其小花發(fā)育順序一致。另外，柳枝稷每個小穗僅含兩朵小花，即第一小花不育花與第二小花可育花，同糖蜜草小花分化規(guī)律一致，但早熟禾與高羊茅是有多朵小花分化的。糖蜜草等的花期約1周，而柳枝稷花序較大，花期可達3～4周，且花序不同部位分化發(fā)育程度差距較大，當花序頂部開花時，其基部枝梗上小穗的小花剛進入花藥伸長期，因而在本研究中柳枝稷幼穗分化各期的劃分標準以花序上部分化狀態(tài)為準。