血清4型禽腺病毒fiber-2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性分析

梅 梅，陸吉虎，張雪花，唐應(yīng)華，盧 宇，侯繼波*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所，江蘇 南京210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 教育部禽類(lèi)預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州225009；4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009)

I群禽腺病毒(Fowl adenovirus group I)是一類(lèi)能夠感染雞、鴨、鵝、火雞、鴿等多種禽類(lèi)的DNA病毒[1]，感染雞的I群禽腺病毒包含12個(gè)血清型，其中血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)致病力強(qiáng)，能引起雞的心包積液綜合征(Hydropericardium syndrome，HPS)，病雞常表現(xiàn)食欲不振、羽毛粗亂、嗜睡等癥狀，死亡率30%～90%[2-3]；剖檢病變常以心包積有淡黃色液體、肝臟出血為主[4]。近年來(lái)，我國(guó)山東、安徽、吉林、遼寧、湖北、江西、江蘇等地大面積暴發(fā)該病，給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]，然而目前尚無(wú)商品疫苗及有效預(yù)防措施[7]。

FAdV-4為無(wú)囊膜病毒，表面呈二十面體對(duì)稱(chēng)[8]，fiber-2蛋白是病毒表面重要結(jié)構(gòu)蛋白，由尾部、莖部和頭部組成[9]，fiber-2蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合，以協(xié)助病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞，其對(duì)病毒毒力及組織拓?fù)湫杂兄匾挠绊慬10]。因此，本研究擬利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和懸浮培養(yǎng)工藝克隆和表達(dá)FAdV-4 fiber-2蛋白，并對(duì)其進(jìn)行初步的免疫效力評(píng)價(jià)，為研制FAdV-4亞單位疫苗研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 FAdV-4由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen公司；Sf9細(xì)胞、High Five細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T質(zhì)粒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker、T4連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提質(zhì)粒試劑盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit、BAC基因組提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；轉(zhuǎn)染試劑盒、FITC標(biāo)記羊抗雞IgG(IgG-FITC)、HRP標(biāo)記羊抗雞IgG(IgG-HRP)購(gòu)自Invitrogen公司；FAdV-4陽(yáng)性血清、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞、疫苗增強(qiáng)劑CVCVA5由本研究室制備；SPF雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物公司，并由本實(shí)驗(yàn)室孵化出雛。

1.2 病毒基因組提取和fiber-2基因的擴(kuò)增 根據(jù)NCBI登錄的FadV-4纖突(fiber-2)基因序列(HQ709232.1)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物：F-F1：5'-TATA ACTAGTATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACA/F-F2：5'-TATTTTCGAATTACGGGAGGGAGGCCGC TGGACA-3'。參考文獻(xiàn)[4]提取FadV-4基因組，以其為模板采用Touch-down PCR擴(kuò)增fiber-2基因。PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃60 s、64℃60 s、72℃90 s，10個(gè)循環(huán)；95℃60 s、62℃60 s、72℃90 s，10個(gè)循環(huán)；95℃60 s、60℃60 s、72℃90 s，10個(gè)循環(huán)后，72℃10 min。

1.3 重組桿狀病毒rBV-fiber-2的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增獲得的fiber-2基因與桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1連接后構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-fiber-2，經(jīng)酶切并測(cè)序鑒定。

將鑒定正確的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFast-Bac1-fiber-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2，經(jīng)藍(lán)白斑篩選3代，提取質(zhì)粒后，利用特異性引物F-F2/通用引物M13經(jīng)PCR鑒定。

將重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，27℃培養(yǎng)120 h或至出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，4℃，1 000 r/min，離心5 min，收獲上清，4℃避光保存，即為第一代重組桿狀病毒rBV-fiber-2。

1.4 重組桿狀病毒rBV-fiber-2的間接免疫熒光(IFA)鑒定 將獲得的重組桿狀病毒rBV-fiber-2感染Sf9細(xì)胞，96 h后吸去上清，PBS洗滌，4%多聚甲醛室溫固定后，以FAdV-4陽(yáng)性血清(1∶200)為一抗，以羊抗雞IgG-FITC(1∶400)為二抗，IFA檢測(cè)重組病毒中fiber-2蛋白的表達(dá)；同時(shí)設(shè)野生桿狀病毒(BV-WT)感染的Sf9和正常Sf9細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.5 重組桿狀病毒的western blot鑒定 將重組桿狀病毒rBV-fiber-2感染Sf9細(xì)胞96 h，收獲細(xì)胞和上清，1 000 r/min，離心5 min，取10 μL上清經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后，以FAdV-4陽(yáng)性血清(1∶400)為一抗，以羊抗雞IgG-HRP(1∶2 500)為二抗，western blot法檢測(cè)重組fiber-2蛋白的表達(dá)；同時(shí)設(shè)野生桿狀病毒(BV-WT)感染的Sf9細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.6 重組桿狀病毒rBV-fiber-2的TCID50測(cè)定 將重組桿狀病毒rBV-fiber-2按10倍倍比稀釋(101～109)后感染96孔板中長(zhǎng)成單層的Sf9細(xì)胞，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔，27℃培養(yǎng)120 h，4%多聚甲醛室溫固定30 min，經(jīng)1.5的IFA測(cè)定并經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算病毒效價(jià)。

1.7 重組fiber-2蛋白瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)效價(jià)的測(cè)定 將懸浮細(xì)胞該密度調(diào)整至1×106個(gè)/mL，將重組桿狀病毒MOI 1接種High Five細(xì)胞，27℃，170 r/min，搖床培養(yǎng)96 h，超聲裂解，1 000 r/min，離心5 min，收獲上清，即為重組fiber-2蛋白。

將fiber-2蛋白10倍倍比稀釋(21～25)后，采用AGP進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，同時(shí)設(shè)PBS和野生桿狀病毒BV-WT作陰性對(duì)照。

1.8 重組fiber-2蛋白免疫原性試驗(yàn) 按照常規(guī)方法將重組fiber-2蛋白制備成油乳劑滅活疫苗。將SPF雞分成3組，第一組為重組fiber-2油乳劑疫苗組，第二組為fiber-2油佐劑疫苗配伍免疫增強(qiáng)劑CVCVA5組，均經(jīng)頸部皮下注射，免疫劑量均為0.5 mL/只，第三組為生理鹽水對(duì)照組。分別于免疫后14 d、21 d、28 d采血測(cè)定各組雞血清抗體AGP效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒穿梭載體rBacmid-fiber-2的鑒定結(jié)果 將fiber-2基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1中構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFast-Bac1-fiber-2，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2，利用PCR對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，獲得的目的條帶大小約1 500 bp，與預(yù)期相符(圖1)。表明正確構(gòu)建了重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2。

圖1 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-fiber-2的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant baculoviral shuttler plasmid rBacmid-fiber-2 by PCR

2.2 重組桿狀病毒的IFA鑒定結(jié)果 將重組桿狀病毒rBV-fiber-2感染Sf9細(xì)胞后經(jīng)IFA檢測(cè)。結(jié)果顯示，rBV-fiber-2感染的Sf9細(xì)胞呈現(xiàn)亮綠色熒光，野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞和正常Sf9細(xì)胞均無(wú)亮綠色熒光(圖2)，表明正確構(gòu)建了重組桿狀病毒rBV-fiber-2，且FAdV-4fiber-2基因在Sf9細(xì)胞中得到了表達(dá)。

2.3 重組桿狀病毒的western blot鑒定結(jié)果 將重組桿狀病毒rBV-fiber-2感染Sf9細(xì)胞后采用western blot鑒定。結(jié)果顯示，rBV-fiber-2感染的Sf9細(xì)胞上清在約62 ku處出現(xiàn)一條特異性的蛋白條帶，與預(yù)期相符，陰性對(duì)照未出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶(圖3)，進(jìn)一步表明正確構(gòu)建了重組桿狀病毒rBV-fiber-2，F(xiàn)AdV-4 fiber-2蛋白在Sf9細(xì)胞中得到正確表達(dá)，且具有較好的反應(yīng)原性。

2.4 重組fiber-2蛋白AGP效價(jià)測(cè)定結(jié)果 采用AGP檢測(cè)經(jīng)懸浮細(xì)胞制備的重組fiber-2蛋白的效價(jià)，結(jié)果顯示當(dāng)重組蛋白稀釋度為21～24時(shí)均可以與FAdV-4陽(yáng)性血清產(chǎn)生可見(jiàn)沉淀線，而稀釋度為25的重組蛋白孔、PBS對(duì)照孔和野生桿狀病毒對(duì)照孔均未產(chǎn)生沉淀線(圖4)。表明重組fiber-2蛋白與FAdV-4陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，且AGP效價(jià)為1∶16。

圖2 重組桿狀病毒的IFA鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of fiber-2 in Sf9 cells by IFA

圖3 重組桿狀病毒的western blot鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of fiber-2 by western blot

圖4 AGP測(cè)定重組fiber-2蛋白的效價(jià)Fig.4 Titer of fiber-2 tested by AGP

2.5 免疫后SPF雞血清抗體AGP效價(jià)測(cè)定結(jié)果采用AGP檢測(cè)免疫后SPF雞血清抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，fiber-2油佐劑疫苗組和fiber-2油佐劑疫苗配伍增強(qiáng)劑組90%的SPF雞均可以產(chǎn)生特異性抗體，且隨免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，其血清抗體AGP效價(jià)升高。免疫后28 d，fiber-2油佐劑疫苗組SPF雞血清抗體AGP平均效價(jià)達(dá)4.6 log2(1∶24)，fiber-2油佐劑疫苗配伍增強(qiáng)劑組SPF雞血清抗體AGP平均效價(jià)達(dá)6.7 log2(1∶104)，陰性對(duì)照組SPF雞血清抗體與滅活抗原無(wú)反應(yīng)，不產(chǎn)生沉淀線(圖5)。表明重組fiber-2蛋白具有較好免疫原性，免疫增強(qiáng)劑CVCVA5可以加強(qiáng)該重組蛋白的免疫原性，且當(dāng)抗原AGP效價(jià)達(dá)1∶16時(shí)，可有效誘導(dǎo)機(jī)體抗體的產(chǎn)生。

圖5 免疫沉淀試驗(yàn)測(cè)定血清抗體AGP效價(jià)Fig.5 Titer of sera tested by AGP

3 討論

I群FAdV-4 fiber蛋白是其主要結(jié)構(gòu)蛋白，通過(guò)非共價(jià)鍵與病毒五鄰體蛋白結(jié)合，展示于病毒粒子表面；fiber蛋白包括fiber-1和fiber-2兩個(gè)亞基[11]。研究表明，fiber蛋白與病毒毒力相關(guān)[12]，其通過(guò)與細(xì)胞受體的相互作用，及其在病毒衣殼與宿主細(xì)胞間的粘附過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[13-14]。fiber-2蛋白被認(rèn)為是具有保護(hù)性的免疫原，其具有誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的能力[15-16]，產(chǎn)生的中和抗體能夠?qū)ο俨《靖腥咎峁┯行У谋Ｗo(hù)[15]。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和懸浮細(xì)胞放大培養(yǎng)工藝技術(shù)，具有抗原表達(dá)快、產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)，表達(dá)的蛋白與天然蛋白功能相似。因此，本研究通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和表達(dá)I群FAdV-4 fiber-2蛋白，利用懸浮放大培養(yǎng)工藝大量表達(dá)該重組蛋白，表達(dá)的fiber-2蛋白經(jīng)IFA、western blot鑒定，結(jié)果顯示重組fiber-2蛋白與FAdV-4陽(yáng)性血清能發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，蛋白分子量大小62 ku左右，與2014年Schachner A表達(dá)的重組fiber-2蛋白大小相近[15]。本研究中，通過(guò)AGP檢測(cè)fiber-2重組蛋白效可達(dá)1∶16，表明本研究所用懸浮細(xì)胞放大培養(yǎng)工藝制備的fiber-2蛋白含量較高，足以同陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)并產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)抗原抗體反應(yīng)沉淀線，這一結(jié)果在其他研究公開(kāi)發(fā)表論文中未見(jiàn)報(bào)道。

以重組fiber-2蛋白為抗原免疫SPF雞，利用AGP于免疫后14 d可檢測(cè)到特異性抗體的產(chǎn)生，免疫后28 d特異性抗體平均AGP效價(jià)達(dá)1∶24。血清抗體的分泌表明重組蛋白抗原進(jìn)入機(jī)體后能夠有效刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，證明桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組fiber-2蛋白具有較好的免疫原性，且產(chǎn)生的抗體能夠與FAdV-4發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)沉淀物，進(jìn)一步表明抗原有效刺激免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體。配伍免疫增強(qiáng)劑組SPF雞抗體平均AGP效價(jià)可達(dá)1∶104，與單獨(dú)油佐劑疫苗組差異顯著，表明本研究中配伍的免疫增強(qiáng)劑能顯著提高重組fiber-2蛋白的免疫效力，促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答，提高抗體分泌水平。

綜上，本研究結(jié)果表明重組fiber-2蛋白具有較好免疫原性，其不僅可以作為FAdV-4亞單位疫苗候選抗原，同時(shí)重組fiber-2蛋白的表達(dá)也為深入研究FAdV-4的致病機(jī)理提供基礎(chǔ)材料。