王 輝，魯國濤，許 曼，曾為俊，邵玉樂，趙麗麗，陳洪巖，劉建華，孟慶文*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，黑龍江哈爾濱150069)

天然免疫是機(jī)體防御病原微生物感染的第一道防線，能夠迅速啟動抵御病原微生物的侵入，在機(jī)體防御機(jī)制中具有重要作用。模式識別受體(PRR)介導(dǎo)感染的識別，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)傳導(dǎo)引起炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，調(diào)節(jié)病原體和感染細(xì)胞的清除[1]。TLR4(Toll Like Receptor 4)屬于Toll樣受體家族，主要識別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁LPS。自1999年Hoshino等發(fā)現(xiàn)TLR4為細(xì)菌LPS的受體以來[2]，其在細(xì)菌方面的研究便逐漸深入。2006年，Montminy等發(fā)現(xiàn)鼠疫桿菌LPS的脂質(zhì)A可刺激TLR4二聚體結(jié)合MD2和CD14通過MyD88途徑完全克服其毒力因子[3]。Kawai等發(fā)現(xiàn)TLR4通過MyD88依賴和非依賴通路誘導(dǎo)促炎因子和I型干擾素(IFN-I)的產(chǎn)生，激活機(jī)體的天然免疫應(yīng)答，清除病原微生物[4]。近幾年發(fā)現(xiàn)TLR4在病毒感染的發(fā)生及逃逸的過程中同樣發(fā)揮重要作用，Lagos等發(fā)現(xiàn)缺乏TLR4的內(nèi)皮細(xì)胞對卡波西肉瘤皰疹病毒(KSHV)感染更為敏感[5]；Haddadi等發(fā)現(xiàn)在禽巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)可抵抗感染性喉氣管炎病毒(ILTV)[6]；Qu等發(fā)現(xiàn)在新城疫病毒(NDV)感染期間，TLR4受體與內(nèi)源性蛋白高遷移率族組B1(HMGB1)相互作用并參與炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，TLR4通過MyD88依賴性途徑傳遞信號激活NF-κB途徑，從而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)[7]。NDV感染被證實引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致過度的細(xì)胞凋亡和組織損傷，關(guān)于雞TLR4對細(xì)菌感染應(yīng)答的研究較多，但其在病毒感染中的作用研究甚少，侯巍等研究發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4參與了雞體對NDV的感染應(yīng)答[8]。另外，Cheng等研究發(fā)現(xiàn)NDV感染過表達(dá)雞TLR3的DF1細(xì)胞，可顯著抑制病毒P蛋白表達(dá)，敲低雞TLR3后顯著增高病毒P蛋白表達(dá)量，表明雞TLR3同樣在NDV感染中起抗病毒作用[9]。

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，是設(shè)計開發(fā)的基因編輯重要工具[10]。該技術(shù)利用基因敲除、敲入及定點突變的方式，近幾年在篩選病毒發(fā)病機(jī)制相關(guān)宿主因子方面發(fā)揮重要功能[11]。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個物種，在宿主抵抗病毒和免疫機(jī)制研究方面取得重要進(jìn)展[12-15]。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建TLR4基因敲除的DF1細(xì)胞系，為在細(xì)胞水平研究禽TLR4基因的抗病毒作用提供了良好的模型；將NDV感染該細(xì)胞并檢測其主要下游接頭蛋白、炎性因子及干擾素轉(zhuǎn)錄水平的變化，在天然免疫應(yīng)答方面初步探究了NDV的致病機(jī)制和為病毒感染的疾病防控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 DF1細(xì)胞、pCAG-Cas9-EGFP質(zhì)粒、pUC19-sgRNA質(zhì)粒及NDV La Sota株均由本實驗室保存。ExTaqDNA聚合酶、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞和DNA Marker購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化及膠回收試劑盒購自Axygen公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；TLR4兔源多克隆抗體購自天德悅(北京)生物科技有限責(zé)任公司；GAPDH抗體購自成都正能生物技術(shù)有限公司；IRDye 680LT羊抗兔IgG購自LICOR公司；SYBR Green qPCR SuperMix購自TransStart公司；MTS試劑盒購自Promega公司。

1.2 sgRNA及相關(guān)鑒定引物的設(shè)計與合成 雞TLR4為I型跨膜蛋白，分為胞外、胞內(nèi)和跨膜3個部分。利用哈佛大學(xué)張峰實驗室提供的網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu)在胞外區(qū)的第二外顯子處選擇得分較高、特異性較好的2條sgRNA，并命名為TLR4-sgRNA1和TLR4-sgRNA2，在正義鏈模板的5'端添加CACC，反義鏈模板的5'端添加AAAC，與BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補(bǔ)。并根據(jù)敲除靶點位置設(shè)計PCR鑒定引物chTLR4-S。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非靶位點發(fā)生錯配也有發(fā)生切割的可能性稱為脫靶(Off-target)。根據(jù)網(wǎng)站提供的潛在脫靶位點設(shè)計合成3對鑒定引物TLR4-OT-1、TLR4-OT-2和TLR4-OT-3。表1為設(shè)計的PCR檢測引物序列。

表1 TLR4基因PCR檢測引物序列Table 1 PCR primer sequence of TLR4 gene

1.3 pUC19-TLR4-sgRNA1/2載體的構(gòu)建與鑒定利用BbsⅠ酶切pUC19-U6-sgRNA質(zhì)粒，電泳后回收線性化質(zhì)粒。利用表1的TLR4-sgRNA1和TLR4-sgRNA2寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈；將回收的線性化質(zhì)粒與退火產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，提取質(zhì)粒、測序比對。構(gòu)建的pUC19-TLR4-sgRNA1和pUC19-TLR4-sgRNA2分別與pCAGCas9-EGFP質(zhì)粒構(gòu)成雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)。

1.4 TLR4-/-DF1細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定 待6孔板中的野生型(Wild type，WT)DF1細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，將構(gòu)建的pUC19-TLR4-sgRNA1、pUC19-TLR4-sgRNA2分別與pCAG-Cas9-EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至WT DF1細(xì)胞；36 h～48 h后，倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，流式細(xì)胞儀分選GFP表達(dá)的DF1細(xì)胞至96孔板，每孔1個細(xì)胞；待細(xì)胞傳代時提取部分細(xì)胞基因組DNA，采用表1的chTLR4-S引物PCR擴(kuò)增雞TLR4基因；產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，回收純化后測序比對，篩選TLR4基因敲除的DF1細(xì)胞系。

1.5 TLR4-/-DF1細(xì)胞的TLR4蛋白表達(dá)檢測 將篩選的細(xì)胞傳至六孔板中，長滿后使用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，裂解細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。電泳完畢后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用5%的脫脂奶粉封閉，以兔源TLR4多克隆抗體(1∶500)和兔源GAPDH抗體(1∶5 000)為一抗，羊抗兔IgG(IgG-HRP)(1∶15 000)為二抗，western blot檢測TLR4-/-DF1細(xì)胞的TLR4蛋白表達(dá)。

1.6 TLR4-/-DF1細(xì)胞增殖速度分析 按照MTS試劑盒操作說明書對TLR4-/-DF1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖速度測定。

1.7 TLR4-/-DF1細(xì)胞的脫靶檢測 提取TLR4-/-DF1細(xì)胞基因組DNA，以表1中的TLR4-OT-1、TLR4-OT-2和TLR4-OT-3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳觀察是否出現(xiàn)非靶點切割。

1.8 NDV感染TLR4-/-DF1細(xì)胞及NDV拷貝數(shù)的檢測 將MOI 2的NDV La Sota株感染六孔板中的TLR4-/-和WT DF1細(xì)胞，1 h后，換維持液繼續(xù)培養(yǎng)。感染6 h、16 h和36 h后收集細(xì)胞上清液離心去除細(xì)胞碎片后提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用表2中根據(jù)GenBank NDV的F蛋白基因設(shè)計的NDV絕對熒光定量檢測引物擴(kuò)增上清液中病毒基因，以構(gòu)建的NDV質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算病毒基因拷貝數(shù)。

表2 熒光定量PCR檢測引物序列Table 2 Real-time PCR primer sequence

1.9 NDV感染TLR4-/-DF1細(xì)胞后下游接頭蛋白MyD88轉(zhuǎn)錄水平檢測 收集感染后6 h、16 h和24 h的TLR4-/-DF1細(xì)胞提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用表2中根據(jù)GenBank雞下游接頭蛋白MyD88基因設(shè)計的熒光定量引物檢測感染細(xì)胞中該基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.10 TLR4-/-DF1細(xì)胞NDV感染后細(xì)胞因子、干擾素轉(zhuǎn)錄水平檢測 利用表2中根據(jù)GenBank雞細(xì)胞因子IL-1β和IL-8、干擾素IFN-α和IFN-β基因設(shè)計的熒光定量檢測引物檢測感染細(xì)胞中以上基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 用Prism 6統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，*：p<0.05表示差異性顯著，**：p<0.01表示差異性極顯著。

2 結(jié)果

2.1 雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及共轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞將設(shè)計合成的雞TLR4sgRNA退火形成雙鏈，插入BbsⅠ酶切的線性化pUC19-sgRNA質(zhì)粒中，提質(zhì)粒測序。將測序結(jié)果與設(shè)計的sgRNA比對，結(jié)果顯示2條sgRNA均已分別插入線性化pUC19-sgRNA質(zhì)粒中。表明重組質(zhì)粒載體pUC19-TLR4-sgRNA1和pUC19-TLR4-sgRNA2正確構(gòu)建。將2種重組質(zhì)粒載體分別與pCAG-Cas9-EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，以空白載體作為陰性對照。使用倒置熒光顯微鏡觀察可見，轉(zhuǎn)染后的DF1細(xì)胞多數(shù)表達(dá)綠色熒光，對照組不表達(dá)綠色熒光(圖1)。表明pCAG-Cas9-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入DF1細(xì)胞。

2.2 TLR4-/-DF1細(xì)胞的鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞儀分選表達(dá)綠色熒光GFP的DF1細(xì)胞，傳代后提取細(xì)胞基因組，使用表1中chTLR4-S引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示28號樣品條帶小于WT對照，且未出現(xiàn)與WT相同大小的條帶(圖2A)，通過測序比對，確認(rèn)28號細(xì)胞比WT細(xì)胞的TLR4基因缺失74 bp(圖2B)，能夠造成移碼突變，命名為TLR4-1-28。表明通過初步篩選得到1株TLR4-/-DF1細(xì)胞。

圖1 雙質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞Fig.1 Transfection of double plasmid system into DF1 cells

圖2 TLR4基因的PCR擴(kuò)增(A)及測序結(jié)果(B)Fig.2 PCR amplification of TLR4gene(A)and results of sequencing(B)

2.3 TLR4-/-DF1細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果將TLR4-1-28傳代培養(yǎng)，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行western blot檢測，結(jié)果顯示TLR4-1-28細(xì)胞沒有目的條帶，而WT細(xì)胞有90 ku的目的條帶(圖3)，表明TLR4-/-DF1細(xì)胞TLR4蛋白不表達(dá)，得到一株TLR4-/-DF1細(xì)胞。

2.4 TLR4-/-DF1細(xì)胞與WT DF1細(xì)胞增殖速度比較 采用MTS試劑盒檢測細(xì)胞的增殖速度，結(jié)果顯示，TLR4-/-DF1細(xì)胞與WT DF1細(xì)胞的生長速度無顯著差異(圖4)。表明，TLR4基因的部分缺失不影響細(xì)胞的生長。

2.5 TLR4-/-DF1細(xì)胞脫靶檢測結(jié)果 采用表1中的TLR4-OT-1、TLR4-OT-2和TLR4-OT-3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增TLR4-1-28細(xì)胞基因組DNA，結(jié)果顯示TLR4-/-DF1細(xì)胞與WT細(xì)胞條帶大小相同(圖5)，無非特異性切割。表明TLR4-/-DF1細(xì)胞檢測的3處潛在脫靶的位點均未出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。

圖3 Western blot檢測TLR4-/-DF1細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 The expression of TLR4 protein in TLR4-/-DF1 cells was detected by western blot

圖4 TLR4-/-DF1細(xì)胞與WT DF1細(xì)胞的生長曲線Fig.4 The growth curves of TLR4-/-DF1 cells and WT DF1 cells

圖5 TLR4-/-DF1細(xì)胞脫靶的PCR檢測結(jié)果Fig.5 Detection of the off-target effect inTLR4-/-DF1 cells using PCR

2.6 TLR4-/-DF1細(xì)胞感染NDV的病毒拷貝數(shù)結(jié)果采用表2中的NDV引物經(jīng)絕對熒光定量PCR擴(kuò)增NDV感染后的TLR4-/-DF1細(xì)胞cDNA，結(jié)果顯示NDV感染后16 h，TLR4-/-細(xì)胞與WT細(xì)胞相比病毒復(fù)制量顯著升高(p<0.01)(圖6)。

2.7 TLR4-/-DF1細(xì)胞感染NDV后TLR4下游接頭蛋白MyD88轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果 采用表2中的MyD88引物經(jīng)相對熒光定量PCR擴(kuò)增感染NDV的TLR4-/-DF1細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，結(jié)果顯示感染后6 h及24 hTLR4-/-細(xì)胞與WT細(xì)胞相比MyD88轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(p<0.05)，16 h其轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異(圖7)。結(jié)果表明，敲除TLR4能在一定程度上影響主要下游接頭蛋白MyD88的轉(zhuǎn)錄水平。

圖6 NDV感染后TLR4-/-DF1細(xì)胞中病毒拷貝數(shù)檢測結(jié)果Fig.6 Detection of viral gene copy number inTLR4-/-DF1 cell upon NDV infection

2.8 TLR4-/-DF1細(xì)胞感染NDV后細(xì)胞因子及干擾素轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果 采用表2中的IL-1β、IL-8、IFN-α、IFN-β引物經(jīng)相對熒光定量PCR擴(kuò)增感染NDV的TLR4-/-DF1細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，結(jié)果顯示W(wǎng)T及TLR4-/-DF1細(xì)胞中IL-1β及IL-8轉(zhuǎn)錄水平在感染后16 h顯著上升(p<0.01)，24 h時顯著下降至起始水平(圖8A、8B)。WT及TLR4-/-DF1細(xì)胞中IFN-I轉(zhuǎn)錄水平在感染后16 h顯著上升(p<0.05)，24 h時顯著下降至起始水平；同一時間點TLR4-/-細(xì)胞與WT細(xì)胞相比IFN轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低(p<0.05)(圖8C、8D)。以上結(jié)果表明，敲除TLR4能在一定程度上促進(jìn)NDV的增殖，影響主要細(xì)胞因子及干擾素的轉(zhuǎn)錄水平。

圖7 NDV感染后TLR4-/-DF1中MyD88轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果Fig.7 Detection of the transcription of MyD88 inTLR4-/-DF1 cells upon NDV infection

圖8 NDV感染后TLR4-/-DF1中IL-1β、IL-8、IFN-α及IFN-β轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果Fig.8 Detection of the transcription of IL-1β,IL-8,IFN-α,and IFN-β inTLR4-/-DF1 cells upon NDV infection

3 討論

TLR4主要通過依賴MyD88途徑，一方面激活NF-κB，誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥或免疫調(diào)節(jié)功能；另一方面激活I(lǐng)RF3/7，誘導(dǎo)IFN-Ⅰ和ISGs的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒作用[16]。本研究利用熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)DF1細(xì)胞中TLR4缺失后感染的NDV復(fù)制量顯著升高，感染后16 h時升高了2.95倍；同一時間檢測到IFN-Ⅰ(IFN-α和IFN-β)的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，接頭蛋白MyD88的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。由以上結(jié)果表明TLR4可抑制NDV復(fù)制，推測TLR4可能是通過誘導(dǎo)MyD88依賴途徑產(chǎn)生IFN-Ⅰ(IFN-α和IFN-β)，從而清除NDV。

NDV感染雞后引起脾、淋巴結(jié)及外周血中炎性細(xì)胞因子的強(qiáng)烈表達(dá)，引起感染雞急性的高死亡率[5]。本研究中熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)NDV感染TLR4-/-DF1后促炎性因子IL-1β和IL-8轉(zhuǎn)錄水平顯著或極顯著降低，IL-1β轉(zhuǎn)錄水平分別降低了44.8%、48.5%及43.8%，IL-8水平分別降低了30.1%、62.5%及49.1%。表明TLR4在NDV感染的細(xì)胞中引起的強(qiáng)烈炎性反應(yīng)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，因此TLR4可作為在控制病毒感染后引起強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)方面開發(fā)抗病毒藥物的重要靶點，推測可在臨床應(yīng)用TLR4阻斷劑減輕NDV感染后的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，降低急性死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失。

CRISPR技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于宿主及細(xì)菌、病毒基因組或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并對其進(jìn)行精確修飾的技術(shù)。但該系統(tǒng)仍然存在需要改進(jìn)的方面，其可能存在的脫靶風(fēng)險影響了該技術(shù)的深入研究，增加了其用于疾病治療的風(fēng)險，阻礙了臨床的進(jìn)一步應(yīng)用[17]。針對此風(fēng)險本研究對構(gòu)建的TLR4-/-DF1細(xì)胞進(jìn)行了脫靶效應(yīng)分析，根據(jù)哈佛大學(xué)張峰實驗室的sgRNA設(shè)計工具(http://crispr.mit.edu)提供的潛在脫靶位點設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)脫靶狀況，表明敲除前期分析TLR4基因序列并按照專業(yè)網(wǎng)站及設(shè)計原則對sgRNA進(jìn)行設(shè)計并篩選的重要性和有效性。表明本實驗中通過篩選特異性高的sgRNA、優(yōu)化Cas9及sgRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例及不使用病毒載體等手段可有效降低脫靶效應(yīng)，除此之外還可對Cas9蛋白進(jìn)行改造產(chǎn)生切口酶或滅活的dCas9進(jìn)行多位點同時編輯、利用Cas9/sgRNA核糖核蛋白(Riboncleoproteins，RNPs)遞送系統(tǒng)以及修飾sgRNA來降低脫靶效應(yīng)[12]。既保證CRISPR系統(tǒng)的高編輯效率，同時降低脫靶效應(yīng)，這將是CRISPR/Cas9技術(shù)走向臨床應(yīng)用必須解決的問題。

本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的TLR4-/-DF1細(xì)胞的NDV感染實驗證明，TLR4在NDV感染后引起的強(qiáng)烈炎性反應(yīng)及識別和清除病毒中發(fā)揮了重要的作用。本研究構(gòu)建的細(xì)胞系可為禽病天然免疫防控研究提供新的思路。為了探究其他模式識別受體和下游接頭蛋白是否對TLR4先天免疫應(yīng)答途徑起協(xié)同及代償作用，本實驗下一步可繼續(xù)研究其他相關(guān)因子的表達(dá)情況，進(jìn)一步揭示TLR4在病毒感染和清除中的功能。