盧 菲， 王世杰， 陳 祥， 白仲虎， 楊艷坤

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122； 2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122； 3. 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122)

葉酸是一種B族維生素，在人腦部發(fā)育過程中起重要作用，孕初期組織快速增長，大量補(bǔ)充葉酸，可有效預(yù)防新生兒神經(jīng)管畸形等疾病[1-2]。葉酸可以輔助體內(nèi)一碳單位的轉(zhuǎn)移并維持同型半胱氨酸的平衡，已有研究明確表明葉酸能夠醫(yī)治高同型半胱氨酸敗血癥，從而降低了患者腦卒中的發(fā)病率[3]。在我國實(shí)施的葉酸干預(yù)重大研究，確定了預(yù)防神經(jīng)管缺陷最佳的葉酸增補(bǔ)劑量，為全世界制定預(yù)防出生缺陷的公共衛(wèi)生政策提供了科學(xué)依據(jù)。結(jié)合當(dāng)前的形勢要求，我們研究出更加簡易、準(zhǔn)確且易推廣的葉酸檢測技術(shù)。

目前在應(yīng)用中的葉酸檢測方法有微生物法、相關(guān)的儀器分析法以及免疫法。微生物法耗時(shí)長不穩(wěn)定，儀器分析雖靈敏準(zhǔn)確但儀器費(fèi)用昂貴，樣品前處理復(fù)雜污染大且需培訓(xùn)專業(yè)人員操作，局限性大[4-5]。其中化學(xué)發(fā)光免疫分析法因具有化學(xué)發(fā)光的高靈敏度、線性范圍大和免疫分析的靈活的選擇性，逐漸成為發(fā)展趨勢[6-7]。

本試劑盒的研制旨在解決這些弊端并建立一種高效精準(zhǔn)的葉酸檢測方法，所以研究出了一種生物素-親和素(Biotin-Avidin—System，BAS)反應(yīng)體系[8]，以生物素-鏈霉親和素包被微孔板，使生物素化的葉酸結(jié)合蛋白能夠結(jié)合到微孔板上，葉酸酶標(biāo)辣根過氧化物酶(FA-HRP)與待測血清中的葉酸競爭結(jié)合到結(jié)合蛋白上，檢測發(fā)光信號值。因?yàn)橛H和素與生物素間結(jié)合專一效率高，能提高反應(yīng)的靈敏度且縮短反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)本研究創(chuàng)新地研制出了新的樣本處理試劑和方法，使血清葉酸在液體環(huán)境中能夠充分快速地釋放，簡化了前期樣本的處理工序。在本研究中，前期我們使用的多為進(jìn)口葉酸結(jié)合蛋白，因?yàn)槠浜茈y通過基因表達(dá)得到，價(jià)格昂貴，所以在完成本試劑盒時(shí)也對葉酸結(jié)合蛋白進(jìn)行了牛奶中的提取、純化方面的創(chuàng)新以及對其親和力進(jìn)行了驗(yàn)證，葉酸結(jié)合蛋白與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對多藥和耐藥性的醫(yī)藥研究變革有著重大指導(dǎo)意義[9]，后期我們自主提取和純化后，得到了較高親和力的葉酸結(jié)合蛋白，大大縮減了成本。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用化學(xué)發(fā)光板購于美國Costar公司。生物素化試劑盒和FA-HRP由江蘇拜明生物技術(shù)有限公司提供。上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院和復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)隨機(jī)選取了200例臨床血清樣本及參比試劑檢測值。葉酸質(zhì)控品購自美國伯樂公司，實(shí)驗(yàn)前期葉酸結(jié)合蛋白購于美國scripps研究所。參比試劑盒為美國Beckman(貝克曼)公司生產(chǎn)的葉酸測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)。

1.2 儀器

廈門天中達(dá)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，檢測儀器型號為TZD-CL-200S。洗板機(jī)購于英國Anthos公司，型號為Fluido2。平板震蕩儀購于上海漢林，型號為Mix-1500。電熱恒溫培養(yǎng)箱購于上海三發(fā)。Sorvall ST16R離心機(jī)和脫鹽柱購于美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 包被板的制備

制備生物素化牛血清白蛋白(BSA-Biotin)：稱取BSA 10 mg，用pH 7.0的1 mL磷酸緩沖液溶解；用生物化試劑盒完成生物素化后用緩沖液連續(xù)洗脫，去除游離的生物素，得到包被所用的BSA-Biotin。

包被：制備好的BSA-Biotin溶于包被液中，混勻。移液200 μL連續(xù)加入每個(gè)板孔中，37℃恒溫箱孵育2 h后，用含有Tween-20的PBSY洗液洗板4次。然后將鏈霉親和素用包被液溶解以同樣方式加入每孔中，最后加入封閉液進(jìn)行37℃恒溫箱孵育，30 min后拍板吹干，密封。

1.3.2 校準(zhǔn)品的配制

首先復(fù)溶中檢驗(yàn)的葉酸對照品(100248—201203)，得到理論濃度為2.5、5、10和25 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)，用參比試劑盒貝克曼公司的葉酸檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)進(jìn)行參考和賦值，然后裝瓶置于4℃保存。

1.3.3 最佳辣根過氧化物酶標(biāo)葉酸(FA-HRP)、生物素化葉酸結(jié)合蛋白(FBP-Biotin)工作濃度的確定

因本研究采用競爭法即當(dāng)FBP-Biotin或FA-HRP一方濃度相對過高或過低時(shí)都會對校準(zhǔn)品曲線的形態(tài)造成影響，導(dǎo)致曲線梯度不分明，測值不準(zhǔn)確等，所以要確定FA-HRP和FBP-Biotin的最佳動(dòng)態(tài)濃度對需要從檢測校準(zhǔn)品和質(zhì)控品兩方面來入手。為減小非特異性吸附和底物等系統(tǒng)誤差對實(shí)驗(yàn)信號值的影響，校準(zhǔn)品最低信號值最好保持在50 000以上，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)后，選擇在濃度區(qū)間FA-HRP(0.1～0.3 μg/mL)、FBP-Biotin(0.2～0.6 μg/mL)篩選最佳工作濃度，對每一組濃度對作3組平行的校準(zhǔn)品曲線和質(zhì)控的測值，取校準(zhǔn)品信號平均值作標(biāo)準(zhǔn)曲線用實(shí)測的質(zhì)控信號代入標(biāo)準(zhǔn)曲線反算質(zhì)控濃度，觀察校準(zhǔn)品信號值梯度和反算質(zhì)控品的準(zhǔn)確度來選取最佳濃度對。

1.3.4 葉酸結(jié)合蛋白(FBP)的提取純化及親和力驗(yàn)證

前期FBP來源主要為國外進(jìn)口，成本較高，后期FBP主要來源為牛奶中提取純化。牛奶中有較多的FBP，且對血液中葉酸的主要活性形式具有較高的親和力，研究改良后的牛奶中FBP提取方法為：取HCl 調(diào)節(jié)新鮮牛奶至pH 3.0，4℃放置2 h；然后用NaOH調(diào)節(jié)至pH 4.8，40℃水浴30 min，紗布過濾后取稍渾濁的上清液，用離心機(jī)5000 r/min離心2 h，用0.22 μm濾膜過濾得澄清淡黃色溶液。期間可同時(shí)制備純化所用的FBP親和柱：取5 mL的EAH Sepharose 4B，用一定濃度的HCl和NaOH處理后，作為填料；取葉酸3 mg溶解于碳酸氫鈉溶液中，加入填料中沖洗偶聯(lián)并不斷用鹽酸調(diào)節(jié)pH值，至填料呈明黃色；向填料加入醋酸鈉和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 6，反應(yīng)2 h后清洗填料，蛋白純化儀AKTA裝柱然后將處理后的牛奶溶液上柱純化，收取完成。

FBP親和力檢測方法：選擇進(jìn)口FBP為對照組，純化所得FBP為實(shí)驗(yàn)組，二者使用相同的包被工藝，工作濃度都為0.5 μg/mL包被于同一塊空白發(fā)光板上，再每孔加入相同的過量FA-HRP，比較兩組的發(fā)光信號值。 兩組實(shí)驗(yàn)于同一塊發(fā)光板，相當(dāng)于每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)48次。

1.3.5 樣本前處理方法

通過查找文獻(xiàn)確定強(qiáng)堿環(huán)境才能讓血清中的葉酸小分子與其結(jié)合蛋白分開，本研究選擇以硼酸為緩沖體系的強(qiáng)堿溶液作為變性劑[10-11]，二硫蘇糖醇(DTT)既具有變性作用還可以抗氧化，但在堿性條件下不穩(wěn)定，所以需另配制成穩(wěn)定劑，處理樣本前將變性劑與穩(wěn)定劑以1∶20的體積比混合制成樣本提取劑。由于整個(gè)酶促反應(yīng)體系在接近pH中性的環(huán)境中進(jìn)行[12]，因此在樣本處理后需要用中和劑將樣本pH調(diào)回中性，所以最后每離心管加入與樣品等量中和劑，樣品即處理完畢，待檢。

2 結(jié)果

2.1 包被工作液濃度的確定

化學(xué)發(fā)光板(SAC板)上加入不同濃度(1～10 μg/mL)BSA-Biotin的包被液后，再加入過量的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-HRP)，檢測結(jié)果見圖1。表明BSA-Biotin在6 μg/mL時(shí)在SAC板上的結(jié)合量已經(jīng)達(dá)到飽和。后續(xù)實(shí)驗(yàn)即選用6 μg/mL作為BSA-Biotin的濃度。確定此濃度后，再加入不同濃度(2～14 μg/mL)的鏈霉親和素(SA)制備成不同的錨定蛋白液，用高濃度生物素作為樣本檢測，結(jié)果見圖2。表明SA包被濃度超過12 μg/mL后檢測信號強(qiáng)度已達(dá)到飽和，因此理論上12 μg/mL為最佳包被濃度。

2.2 校準(zhǔn)品的賦值及校準(zhǔn)曲線的繪制

貝克曼公司的葉酸檢測試劑盒賦值本研究校準(zhǔn)品結(jié)果見表1。以實(shí)測值為準(zhǔn)，定義葉酸校準(zhǔn)品1～5的濃度分別為0、2.52、4.91、10.28和25.49 ng/mL。校準(zhǔn)曲線以校準(zhǔn)品濃度為X軸，所測信號值(RLU)為Y軸(見圖3)，校準(zhǔn)曲線線性系數(shù)R2=0.9997。

表1 校準(zhǔn)品賦值結(jié)果

圖1不同濃度包被BSA-Biotin對應(yīng)檢測信號(RLU)

Figure 1 The RLU of different BSA-Biotin concentrations

圖2 不同濃度鏈酶親和素對應(yīng)檢測信號

圖3 葉酸(FA)校準(zhǔn)品曲線

2.3 最佳FA-HRP、生物素化FBP工作濃度的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，當(dāng)生物素化FBP濃度為0.4 μg/mL，F(xiàn)A-HRP濃度為0.3 μg/mL時(shí)校準(zhǔn)品信號值梯度適宜，測量質(zhì)控品偏差小，均小于10%滿足檢測要求。

表2 濃度篩選結(jié)果

2.4 FBP親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由來源為進(jìn)口的FBP作為對照組，實(shí)驗(yàn)純化所得的FBP作為實(shí)驗(yàn)組，相同條件下發(fā)光值(RLU)對比結(jié)果如表3所示。兩組CV基本接近，說明包板誤差小，結(jié)果可信。相同條件下實(shí)驗(yàn)組RLU平均值為6 996 210，對照組為4 189 347，兩組比值約為1.67，可說明本研究實(shí)驗(yàn)純化所得的FBP較進(jìn)口FBP親和能力高，可替代。

表3 質(zhì)控品檢測結(jié)果

表4 試劑盒準(zhǔn)確度檢測

2.5 試劑盒的性能驗(yàn)證

2.5.1 最低檢出限

根據(jù)行業(yè)公認(rèn)的最低檢測限方法通過平行3次測定10孔0 ng/mL 葉酸校準(zhǔn)品，得到直接數(shù)據(jù)相對發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，以及平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。利用劑量-反應(yīng)曲線計(jì)算出(M-2SD)對應(yīng)的濃度值為最低檢出限[13]。本試劑盒線性測量范圍為1.5～50 ng/mL，靈敏度為1 ng/mL，均居于國內(nèi)領(lǐng)先。

2.5.2 準(zhǔn)確度

根據(jù)精確度性能指標(biāo)的相關(guān)方法，用標(biāo)定濃度為2.5 ng/mL和15 ng/mL的伯樂質(zhì)控品平行進(jìn)行10次檢測，其檢測結(jié)果見表4，理論值與實(shí)測值的相對偏差均在±10%范圍內(nèi)，證明本試劑盒準(zhǔn)確度符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

2.5.3 精密度

對高中低濃度(15、7和2.5 ng/mL)的伯樂質(zhì)控進(jìn)行隨機(jī)3個(gè)批次的平行10次檢測實(shí)驗(yàn)，各質(zhì)控檢測的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV%)結(jié)果如表5，批內(nèi)精密度小于10%，批間精密度小于15%，試劑盒精密度已能充分滿足檢驗(yàn)要求。

表5 批內(nèi)及批間精密度

2.5.4 熱穩(wěn)定性

將試劑盒各組分放置37℃下進(jìn)行3、6和10 d的熱加速實(shí)驗(yàn)，并與4℃冷藏條件下進(jìn)行檢測對比，校準(zhǔn)品的RLU下降幅度低于10%，伯樂質(zhì)控品結(jié)果均穩(wěn)定，批內(nèi)和批間精密度分別為2.1%～9.1%，8.2%～9.6%批內(nèi)和批間精密度檢測均小于10%，熱加速穩(wěn)定性測試指標(biāo)合格，說明本試劑盒可在2℃～8℃存放有效期可達(dá)到16個(gè)月，結(jié)果見表6。

表6 熱穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5.5 試劑盒的臨床應(yīng)用

臨床實(shí)驗(yàn)200份血清樣本的檢測結(jié)果如圖4。本試劑盒與參比試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R2=0.9847，說明兩者的測定一致性高，可以替代參比試劑盒。

圖4 本試劑盒與參比試劑盒檢測血清樣本測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前血清的葉酸前處理面臨一個(gè)較大的困難，微生物法耗時(shí)較長且血清成分復(fù)雜，易產(chǎn)生不良代謝物影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，熒光免疫分析等對血清葉酸的損耗較大，實(shí)驗(yàn)誤差大。目前市場上流通較多的為葉酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，雖能大量檢測樣本但前處理樣本時(shí)需借助渦輪儀等儀器，方法復(fù)雜且反應(yīng)時(shí)間長，線性窄誤差大，漏檢現(xiàn)象頻繁。同類型的化學(xué)發(fā)光試劑盒則樣品處理時(shí)間長，多為40 min以上，且存在葉酸釋放不充分、準(zhǔn)確度不高等問題。本研究創(chuàng)新地采用了生物素-親和素(BAS)反應(yīng)體系，成功將傳統(tǒng)的試劑與儀器處理相結(jié)合的復(fù)雜的樣品前處理，自主研發(fā)為純液體環(huán)境的試劑處理，并且快速充分地將葉酸小分子從血清樣本中提取出來。通過變性劑、穩(wěn)定劑和中和劑3種試劑的合理搭配，將前處理時(shí)間縮短到了20 min內(nèi)，所用試劑安全、環(huán)保，使臨床操作更加安全便捷。并且改良了葉酸結(jié)合蛋白的提純方法，得到較高親和力的實(shí)用型蛋白，降低了整體的成本。研制成品的試劑盒的各項(xiàng)性能指標(biāo)經(jīng)驗(yàn)證：最低檢出限為1 ng/mL，熱加速試驗(yàn)下變異系數(shù)仍可保持在10%以內(nèi)，有效期可達(dá)16個(gè)月，各項(xiàng)指標(biāo)均居于國內(nèi)領(lǐng)先水平，同時(shí)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本試劑盒與參比試劑盒(Beckman)的檢測結(jié)果呈高度相關(guān)性。此研究為本試劑盒的臨床應(yīng)用提供了理論支持，適用于大批量檢測，可替代國外同類試劑盒。

結(jié)合目前的市場發(fā)展，本研究可結(jié)合維生素B12、鐵蛋白、維生素D的檢測，研發(fā)相關(guān)儀器取代人工，完善孕婦的產(chǎn)前檢測等相關(guān)項(xiàng)目。磁珠是一種新興的反應(yīng)載體和方式，它操作簡單，用時(shí)更短，可以大幅度提高分析檢測的靈敏度。本研究具有很大的進(jìn)步空間，可以借助磁珠這一平臺進(jìn)一步研發(fā)，擴(kuò)大檢測量并縮短反應(yīng)時(shí)間，提高檢測的準(zhǔn)確程度，更加貼合市場需求。