王 佩，段明珠，黃 貝，熊 靜，梁 英，黃文樹(shù),2,3

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021;3.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén) 361005)

0 引言

抗菌肽(antimicrobial peptides)又稱宿主防御肽，是生物體天然免疫系統(tǒng)的重要成分，廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，是一類廣譜抗微生物活性的多肽[1-3]。殺菌/滲透性增強(qiáng)蛋白(Bactericidal/permeability increasing protein,BPI) 是一類重要的抗菌肽，是Weiss等[4]1975年從兔子中性粒細(xì)胞中首次分離出來(lái)的，是一種可迅速殺死大腸桿菌(Escherichiacoli)的多肽。1977年，Weiss等[5]從人類的中性粒細(xì)胞中也分離得到了該抗菌肽，其 Isoelectric Point(pI)值為9.8，分子質(zhì)量為58～60 ku，當(dāng)pH值達(dá)到7.0時(shí)，其殺菌和增強(qiáng)滲透性活性均最大，可殺死革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌和沙門(mén)氏菌(Salmonellaspp.)，因此，命名為殺菌/滲透性增強(qiáng)蛋白。哺乳動(dòng)物BPI是一類胞外蛋白質(zhì)[6]，其N端富含精氨酸和賴氨酸，以及兩個(gè)位置保守的半胱氨酸。精氨酸和賴氨酸均為陽(yáng)離子氨基酸，可與含有帶負(fù)電荷的LPS結(jié)合，從而殺菌，或結(jié)合/中和內(nèi)毒素[7]。其C端和N端中間有脯氨酸富集中心連接，該區(qū)域可促進(jìn)BPI 分子與LPS 結(jié)合，并介導(dǎo)BPI-LPS 復(fù)合物向特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)[8-9]。BPI被學(xué)者稱為未來(lái)的“超級(jí)抗生素”[10]。

除BPI外，哺乳動(dòng)物的脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)也可識(shí)別LPS，二者均屬于脂質(zhì)轉(zhuǎn)移和脂多糖結(jié)合蛋白家族成員[11]。人類的LBP和BPI序列相似性高達(dá)45%，其晶體結(jié)構(gòu)相似[12-13]。LBP是一種胞漿蛋白質(zhì)，與細(xì)菌脂多糖特別是類脂A高度親和[14]。在LPS刺激的炎癥反應(yīng)中LBP表達(dá)量增多，且可調(diào)節(jié)LPS顆粒使其與吞噬細(xì)胞表面的CD14結(jié)合[14]。

在哺乳動(dòng)物中BPI和LBP的基因序列和功能明顯不同，但是，在硬骨魚(yú)類中目前尚無(wú)法明確區(qū)分BPI和LBP[15-16]， 因此，常以BPI/LBP表示。迄今為止，已在多種硬骨魚(yú)中克隆和鑒定了BPI/LBP基因，如虹鱒(Onchorhynchusmykiss)[17]、錦鯉(Cyprinuscarpio)[18]、大西洋鱈(Gadusmorhua)[19]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[20]、香魚(yú)(Plecoglossusaltivelisaltivelis)[15]、大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)[21]、條石鯛(Oplegnathusfasciatus)[22]、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)[16]和團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[23]等。與哺乳動(dòng)物BPI基因主要在中性粒細(xì)胞和各種黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)不同，魚(yú)類BPI/LBP基因的組織表達(dá)模式較多樣。如鯉科魚(yú)類：草魚(yú)BPI在鰓中表達(dá)量最高，其次是頭腎和中腎[16]；錦鯉BPI基因在肝臟和脾臟中表達(dá)量最高[18]；團(tuán)頭魴BPI/LBP基因在腎臟中表達(dá)量最高[23]。又如石鯛科魚(yú)類：條石鯛BPI-1在脾臟和肝臟中表達(dá)量最高，BPI-2在腎臟中表達(dá)量最高[22]。此外，外源刺激物刺激后，魚(yú)類BPI轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化規(guī)律也不同。如受LPS刺激3 h后，錦鯉肝臟和頭腎中的BPI均微弱上調(diào)[18]，而受LPS刺激2 h后，團(tuán)頭魴脾臟中BPI/LBP上調(diào)達(dá)到最高值[23]。

日本鰻鱺(Anguillajaponica)是我國(guó)重要的養(yǎng)殖魚(yú)類[24]。然而，細(xì)菌性疾病一直困擾著鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。迄今為止，關(guān)于鰻鱺的抗細(xì)菌免疫應(yīng)答的研究較為缺乏。BPI是重要的抗細(xì)菌免疫因子，是魚(yú)類天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，目前未見(jiàn)鰻鱺屬BPI的相關(guān)研究。基于此，本研究運(yùn)用SMARTerTMRACE技術(shù)，從日本鰻鱺中克隆、鑒定BPI基因序列，并進(jìn)一步利用Real-time PCR技術(shù)，研究在正常養(yǎng)殖和人工免疫物刺激下，BPI基因在日本鰻鱺體內(nèi)表達(dá)量變化的規(guī)律，以期為闡析鰻鱺BPI/LBP基因的分類、命名及其結(jié)構(gòu)功能等提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

日本鰻鱺((203±53)g)，購(gòu)于福建省集美大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。于水溫(28±2)℃暫養(yǎng)1周后，采集日本鰻鱺血液、鰓、心臟、肝臟、胃、腸、脾臟、頭腎、中腎、鰾、性腺和皮膚等組織/器官用于試驗(yàn)。

免疫刺激試驗(yàn)： 腹腔注射，設(shè)PBS對(duì)照組、LPS刺激組(0.01 mg/g，Sigma)、Poly I:C刺激組(0.01 mg/g，Sigma)、遲緩愛(ài)德華氏菌刺激組(2×105cfu/g)，在注射后8 h、16 h、24 h和72 h采樣。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取鰻鱺8尾。

1.2 BPI基因cDNA序列的克隆

將約100 mg日本鰻鱺肝臟組織用Trizol?Rreagent試劑盒提取其總RNA，具體操作參考相關(guān)研究[25]。用瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法(NanoDrop2000，美國(guó)Thermo)檢測(cè)所提取總RNA的完整性和純度，即RNA 的28 S和18 S條帶清晰且D260/D280為1.8～2.0時(shí)，方可用于下一步實(shí)驗(yàn)。隨后，總RNA經(jīng)RNase-free DNase I(New England Biolabs Inc，美國(guó))處理，反轉(zhuǎn)錄(SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，Clontech，美國(guó))獲得第一鏈模板。

通過(guò)分析已制備的日本鰻鱺肝臟和腎臟cDNA文庫(kù)，獲得BPI基因的EST序列，設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得BPI基因的5′和3′末端cDNA序列，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物，再經(jīng)PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其全長(zhǎng)cDNA序列。

1.3 BPI基因組序列的擴(kuò)增

取日本鰻鱺的肌肉，參照MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒(TaKaRa，日本)說(shuō)明書(shū)，提取日本鰻鱺基因組DNA。根據(jù)已經(jīng)獲得的基因全長(zhǎng)cDNA 序列設(shè)計(jì)特異性引物(見(jiàn)表1)，擴(kuò)增BPI的基因組DNA。

1.4 Real-time PCR

取4 μg健康日本鰻鱺組織的總RNA，經(jīng)DNA酶處理及反轉(zhuǎn)錄(GoScripTMReverse Transcription System，Promega，美國(guó))用以制備Real-time PCR模板，用RNAase free water稀釋一定倍數(shù)后保存、備用。

以β-actin為內(nèi)參基因，在 LightCycler 480 II實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)與分析。qPCR反應(yīng)體系如下：2× LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix 10.0 μL，稀釋后的cDNA模板4.0 μL，正、反向引物 (10 μmol·L-1)各0.5 μL，PCR-Grade water 5.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)采集溫度為81℃。反應(yīng)結(jié)束后分析產(chǎn)物的溶解曲線，判斷其特異性。以β-actin作為內(nèi)參基因，梯度稀釋已知拷貝數(shù)的AJBPI和β-actin質(zhì)粒樣品及組織/器官樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)而計(jì)算各基因的擴(kuò)增效率。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站中的Blast進(jìn)行序列比對(duì)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；通過(guò)ExPASy的翻譯工具獲得BPI的氨基酸序列(http://web.expasy.org/translate/)，再用ExPASy預(yù)測(cè)BPI氨基酸的分子量和pI值(http://web.expasy.org/compute_pi/)；用SignalP 4.1 Server程序分析信號(hào)肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；用Pfam程序分析BPI的結(jié)構(gòu)域(http://pfam.xfam.org/)；利用DNAman軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)；應(yīng)用MEAG5.0軟件，采用鄰位相接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel和Spss18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，用單因素變量方差分析法 (ANOVA)分析LPS、Poly I:C和E.tarda刺激后樣品間的表達(dá)量差異，利用 Dunnettt-Test (2-sided) 進(jìn)行多重比對(duì)。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SEM) 的方式表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。利用GraphPad.Prism.v5.0軟件進(jìn)行作圖。

表1 引物序列

說(shuō)明：直下劃線部分位于前一個(gè)外顯子，加粗波浪線的部分位于后一個(gè)外顯子

Notes:Nucleotides sequence underlined is located in the former exon，that with wavy line is located in the latter exon

2 結(jié)果

2.1 日本鰻鱺AJBPI基因序列分析

從日本鰻鱺的肝臟和腎臟cDNA文庫(kù)中篩選到兩條BPI的EST序列，通過(guò)RACE、PCR克隆和序列拼接，獲得日本鰻鱺兩條BPI的cDNA序列，分別命名為AJBPI-1和AJBPI-2。AJBPI-1 cDNA全長(zhǎng)1617 bp，包括5′UTR 207 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF) 1278 bp(編碼425個(gè)氨基酸殘基)，3′UTR 132 bp(見(jiàn)圖1)，預(yù)測(cè)其前體肽分子質(zhì)量為46.26 ku，pI值為8.58。AJBPI-2 cDNA全長(zhǎng)1911 bp，包括5′UTR 93 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)1422 bp(編碼473個(gè)氨基酸殘基)，3′UTR 396 bp(見(jiàn)圖2)，預(yù)測(cè)其前體肽分子質(zhì)量為51.74 ku，pI值為10.11。通過(guò)Phyre2對(duì)抗菌肽AJBPI-1和AJBPI-2二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明二者主要由β-折疊構(gòu)成，其含量分別高達(dá)53%和48%，該結(jié)構(gòu)有利于AJBPI抗菌肽構(gòu)象的穩(wěn)定；其次為α-螺旋，其含量分別為21%和26%。通過(guò)SWISS-MODEL預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽AJBPI-1和AJBPI-2的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，即它們均有“桶狀結(jié)構(gòu)單元”，該桶狀結(jié)構(gòu)單元由N-和C-末端氨基酸殘基中心的β-折疊連接(見(jiàn)圖3)。

通過(guò)對(duì)兩種AJBPI的N端氨基酸殘基分析可知，AJBPI-1含精氨酸和賴氨酸數(shù)量分別為4和8，少于AJBPI-2(12和35)(見(jiàn)圖1、2和表 2)。

表2 魚(yú)類BPI的序列信息

物種Species登錄號(hào)Aaccessionno.基因Gene類型TypeN端賴氨酸個(gè)數(shù)The number oflysines atN-terminalN端精氨酸個(gè)數(shù)The number ofarginines atN-terminalpI值Isoelectricpoint與AJBPI-1的相似性或一致性/%Similaritywith AJBPI-1與AJBPI-2的相似性或一致性/%Similariwith AJBPI-2日本鰻鱺Anguilla japonica—BPI-1I488.58100/10044.70/32.70大西洋鮭Salmo salarACI33182.1BPII745.4856.47/44.4750.10/36.78條石鯛Oplegnathus fasciatusBAM21037.1BPII1044.6556.00/44.4749.47/35.94大黃魚(yú)Larimichthys croceaABO32254.1BPII1145.1351.29/40.0046.82/34.11日本鰻鱺Anguilla japonica—BPI-2II201510.1144.70/32.70100/100團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephalaAIT76553.1BPI/LBPII1648.8548.47/33.8873.78/64.40斑點(diǎn)叉尾Ictaluru spunctatusAAX20011.1BPI/LBPII1778.1948.7/35.5273.99/63.84錦鯉Cyprinus carpioBAC56095.1BPI/LBPII1958.8250.35/34.3574.84/65.11牙鲆Paralichthys olivaceusACV74252.1BPI/LBPII1769.5950.35/36.0073.78/64.27虹鱒Oncorhynchus mykissBAB91244.1BPI/LBP-2II1969.3450.11/36.2376.53/67.65虹鱒Oncorhynchus mykissBAB91243.1BPI/LBP-1II1499.0748.70/35.0577.58/68.71香魚(yú)Plecoglossus altivelis altivelisBAH11125.1BPI/LBPII19159.6752.00/36.2377.91/69.21胡瓜魚(yú)Osmerus mordaxACO09816.1BPIII1279.6151.29/35.5279.14/70.00條石鯛Oplegnathus fasciatusBAM21038.1BPI/LBPII231510.1849.88/35.2976.95/66.80大西洋鱈Gadus morhuaAAM52335.1BPI/LBP-1II181210.0249.41/34.1168.28/57.50大西洋鱈 Gadus morhuaAAM52336.1BPI/LBP-2II181210.0549.17/33.8868.07/57.29

從兩棲類、硬骨魚(yú)類及哺乳動(dòng)物中選取代表種的BPI序列(GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表3)，進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示：所有物種BPI都具有保守的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一對(duì)位置固定的二硫鍵，以及脯氨酸富集中心結(jié)構(gòu)域。序列相似性比對(duì)結(jié)果顯示，AJBPI-1序列與大西洋鮭相似性最高(56.47%)，其次為條石鯛(56.0%)；AJBPI-2序列與胡瓜魚(yú)相似性最高(79.14%)，其次為香魚(yú)(77.91% )(見(jiàn)表2)。利用MEAG4.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Jones Taylor Thornton model,JTT模型)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示：哺乳動(dòng)物聚為一大支，硬骨魚(yú)類聚為另一大支。其中硬骨魚(yú)類又分為兩小支：AJBPI-1與大西洋鮭、條石鯛和大黃魚(yú)的陰離子BPI基因聚為一支；AJBPI-2與虹鱒等陽(yáng)離子BPI基因聚為一支(見(jiàn)圖4)。

表3 其他物種的登錄號(hào)

2.2 AJBPI-1和AJBPI-2基因在不同組織中的分布

利用Real-time方法分析AJBPI-1和AJBPI-2在正常鰻鱺不同組織中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示：二者在日本鰻鱺肝臟、腸、皮膚、心臟、血液、胃、頭腎、中腎、脾臟、鰓等組織/器官表達(dá)中均有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，尤其是在肝臟、中腎、脾臟、頭腎、皮膚、血液中表達(dá)量較高。AJBPI-1在肝臟中轉(zhuǎn)錄表達(dá)量最高，是β-actin的0.075倍；而AJBPI-2，在頭腎和中腎中表達(dá)量較高，是β-actin的0.44倍。中腎、頭腎和血液中的AJBPI-2極顯著高于AJBPI-1(P<0.001)，而肝臟中的AJBPI-1卻極顯著高于AJBPI-2(P<0.01)(見(jiàn)圖5)。

2.3 免疫刺激后AJBPI-1和AJBPI-2的基因表達(dá)變化

為了研究不同刺激物刺激后對(duì)AJBPI-1和AJBPI-2基因表達(dá)情況的影響，本實(shí)驗(yàn)用LPS、Poly I:C和E.tarda分別刺激日本鰻鱺。結(jié)果顯示：

脾臟中，經(jīng)Poly I:C和E.tarda刺激后，AJBPI-1的表達(dá)量均迅速達(dá)到最高值，分別為PBS對(duì)照的4.0倍和3.3倍，刺激后16 h，AJBPI-2的表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)，分別為PBS對(duì)照組的2.3倍和1.7倍。經(jīng)LPS刺激后，AJBPI-1和AJBPI-2的表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P>0.05)(見(jiàn)圖6)。

鰓中，經(jīng)LPS、Poly I:C和E.tarda刺激后，AJBPI-2的表達(dá)量均有上調(diào)。其中，LPS和Poly I:C刺激后24 h，AJBPI-2表達(dá)量最高，分別為PBS對(duì)照組的2.5倍和17.0倍；E.tarda刺激后18 h，AJBPI-2表達(dá)量最高，為PBS對(duì)照組的7.0倍。而該三種刺激物刺激后，AJBPI-1的表達(dá)量均無(wú)顯著變化(P>0.05)(見(jiàn)圖6)。

中腎中，經(jīng)LPS和Poly I:C刺激后16 h，AJBPI-1和AJBPI-2的表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)。其中，LPS刺激后，AJBPI-1和AJBPI-2分別為PBS對(duì)照組的3.0倍和2.0倍；而Poly I:C刺激后，AJBPI-1 和AJBPI-2均為PBS對(duì)照組的2.2倍。然而，E.tarda刺激后，中腎中AJBPI-2的表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05)(見(jiàn)圖6)。

3 討論

BPI是一類含有LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域和脯氨酸富集區(qū)的陽(yáng)離子抗菌肽。它通過(guò)LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域與革蘭氏陰性菌的脂多糖發(fā)生結(jié)合[26]，從而發(fā)揮抗菌作用。

魚(yú)類I型BPI主要在中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)。如條石鯛BPI-1基因在肝臟、脾臟中高表達(dá)[22]，大黃魚(yú)BPI基因在肝臟、頭腎、心臟中高表達(dá)[21]。本研究的AJBPI-1在所檢測(cè)的各個(gè)組織中均有表達(dá)，且在肝臟、頭腎和脾臟中高表達(dá)。這表明日本鰻鱺BPI-1基因的組織分布與上述魚(yú)類BPI基因的組織分布相似。異源性抗原物質(zhì)如LPS、病毒和細(xì)菌刺激可顯著誘導(dǎo)魚(yú)類BPI基因的表達(dá)。如E.tarda和真鯛虹彩病毒(red sea bream iridovirus，RSIV)誘導(dǎo)后，條石鯛BPI-1基因在頭腎中表達(dá)量顯著上調(diào)[22]。受溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和諾卡氏菌(Nocardiaseriolae)刺激后，大黃魚(yú)頭腎、脾臟、腸道、腎臟、鰓和肌肉中BPI基因的表達(dá)量顯著上調(diào)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，用LPS、Poly I:C和E.tarda分別刺激日本鰻鱺中腎、脾臟和鰓時(shí)，中腎中AJBPI-1的表達(dá)量均有顯著上調(diào)；在Poly I:C和E.tarda刺激下脾臟中AJBPI-1的表達(dá)量具有顯著性變化，而鰓中AJBPI-1的表達(dá)量均無(wú)顯著變化。根據(jù)以上結(jié)果可知，BPI-1主要在脾臟、腎臟等造血器官中高表達(dá)。

綜上所述，本研究從日本鰻鱺中克隆、鑒定了兩類AJBPI基因。AJBPI在所檢測(cè)的組織中均有不同程度的表達(dá)，用LPS、Poly I:C和E.tarda分別刺激時(shí)日本鰻鱺中的腎、鰓和脾臟中的AJBPI均有不同響應(yīng)。該研究結(jié)果顯示AJBPI可能參與日本鰻鱺的抗細(xì)菌和抗病毒免疫，而且它將為魚(yú)類的BPI/LBP基因的命名、分類及其功能分析等提供一定的理論依據(jù)。