高德英，曹佳雯, 3，孫小寶，周可鑫，張鐵濤，王謙

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基于異肽鍵連接的分子粘合劑研究進展

高德英1，曹佳雯1, 3，孫小寶1，周可鑫1，張鐵濤2，王謙1

1 浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112 3 浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310012

高德英, 曹佳雯, 孫小寶, 等. 基于異肽鍵連接的分子粘合劑研究進展. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(4): 607–615.Gao DY, Cao JW, Sun XB, et al. Advances in isopeptide bond-mediated molecular superglue. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 607–615.

異肽鍵分子粘合劑是多肽鏈中的賴氨酸 (Lys) 殘基和天冬酰胺或天冬氨酸 (Asn/Asp) 殘基側(cè)鏈自發(fā)結(jié)合形成的不可逆共價鍵，具有良好的特異性和穩(wěn)定性。該反應(yīng)可在極短的時間完成，且不需要特定的理化環(huán)境和催化劑。文中結(jié)合近年來國內(nèi)外學(xué)者對異肽鍵分子粘合劑的研究進展，綜述了異肽鍵分子粘合劑的來源、類型、形成機制及其介導(dǎo)的分子環(huán)化和蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并討論了其在合成疫苗、水凝膠和細(xì)菌納米生物反應(yīng)器等領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

異肽鍵，分子環(huán)化，機制，SpyTag/SpyCatcher，應(yīng)用

蛋白質(zhì)因其高效性和特異性在工業(yè)催化、食品制造、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。然而，由于蛋白質(zhì)對熱、抑制劑等耐受能力較差，導(dǎo)致易降解、穩(wěn)定性較差，限制了其在工業(yè)加工和特定環(huán)節(jié)中的應(yīng)用。因此，如何提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性成為近年來的研究熱點。傳統(tǒng)提升酶穩(wěn)定性的方法主要包括篩選耐熱突變體、化學(xué)修飾、添加穩(wěn)定劑、改變離子濃度以及包被技術(shù)等。這些方法雖然能夠提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，但往往盲目性較大，收效甚微[1]。早前，有研究人員在細(xì)菌、植物、真菌和動物上發(fā)現(xiàn)一類環(huán)狀蛋白質(zhì)。與常規(guī)線性蛋白質(zhì)相比，環(huán)狀蛋白質(zhì)具有更高的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[2-3]。

通常，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是由蛋白質(zhì)分子中氨基酸主鏈及側(cè)鏈之間的相互作用和蛋白質(zhì)分子與周圍溶液環(huán)境作用的綜合效應(yīng)共同決定，包括疏水作用力、鹽鍵、氫鍵、范德華力以及在三級結(jié)構(gòu)中形成的親水表面及內(nèi)部疏水核心等。因此，蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性與其氨基酸組成及空間構(gòu)象有著重要關(guān)聯(lián)[4-5]。

異肽鍵 (Isopeptide bond) 是指蛋白質(zhì)序列中氨基酸之間至少有一個非α位的氨基或羧基參與形成的酰胺鍵，廣泛存在于革蘭氏陽性菌的菌毛蛋白中。牛津大學(xué)的Mark Howarth團隊圍繞異肽鍵和蛋白質(zhì)分子環(huán)化開展了系統(tǒng)的研究工作。他們重點分析了環(huán)化蛋白的熱穩(wěn)定性及其穩(wěn)定性機制，進一步優(yōu)化了異肽鍵的形成條件，發(fā)現(xiàn)異肽鍵在極短的時間 (小于10 min) 即可形成，且不需要特定的理化環(huán)境和催化劑[6-8]。此外，他們還對利用熱變性純化環(huán)化蛋白進行了探索[9]。之后，研究人員進一步采用SpyTag/SpyCatcher系統(tǒng)設(shè)計了多種大分子的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并研究其分子穩(wěn)定性機制[10]。由于異肽鍵具備良好的熱穩(wěn)定性和抗逆能力，近年來，人們探索了異肽鍵的形成機制，并利用異肽鍵作為分子粘合劑在合成疫苗、細(xì)菌納米生物反應(yīng)器、人工代謝通路及蛋白質(zhì)水凝膠等領(lǐng)域的應(yīng)用開展了一系列研究工作。

1 異肽鍵分子粘合劑的類型

自然界中發(fā)現(xiàn)的異肽鍵通常是通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶[11]、泛素連接酶[12]或轉(zhuǎn)肽酶[13]催化形成。通過Lys側(cè)鏈氨基與Asn側(cè)鏈酰胺基或Asp側(cè)鏈羧基自發(fā)結(jié)合形成的共價鍵，具有較高的特異性和穩(wěn)定性[6-7]。人們最早在HK97噬菌體衣殼蛋白組裝過程中發(fā)現(xiàn)可以自發(fā)形成的異肽鍵[14]。2007年，Kang等[15]首次在革蘭氏陽性菌釀膿鏈球菌菌毛蛋白 (Pilin) Spy0128中發(fā)現(xiàn)分子內(nèi)可自發(fā)形成的異肽鍵。根據(jù)物種來源和肽段性質(zhì)的差異，目前常見的異肽鍵分子粘合劑主要分為isopeptag-N/pilin-N (PilinRing-N)、isopeptag/pilin-C (PilinRing-C)、SnoopTag/ SnoopCatcher (SnoopRing) 和SpyTag/SpyCatcher (SpyRing)。

PilinRing作為第一代分子粘合劑最初在革蘭氏陽性菌釀膿鏈球菌菌毛蛋白 (Pilin) Spy0128 (PDB登錄號：3B2M) 中觀察并分離得到[16]。Spy0128包含兩個異肽鍵結(jié)構(gòu)域，即攜帶Asn殘基的Pilin-N和攜帶Lys殘基的N端結(jié)構(gòu)域以及攜帶Lys殘基的Pilin-C和攜帶Asn殘基的C端結(jié)構(gòu)域 (圖1)。之后，研究人員進一步發(fā)現(xiàn)來自于肺炎鏈球菌粘著物RrgA (PDB登錄號：2WW8) 的SnoopRing，在SnoopTag和SnoopCatcher肽段上分別攜帶Lys殘基和Asn殘基[17]。最近，研究人員從釀膿鏈球菌纖連蛋白CnaB2 (PDB登錄號：2X5P) 中發(fā)現(xiàn)第二代分子粘合劑SpyRing[7,18]。其中，SpyTag和SpyCatcher肽段分別攜帶形成異肽鍵的Asp殘基和Lys殘基。由于SpyTag/SpyCatcher形成的異肽鍵結(jié)合穩(wěn)定、肽鏈較短且反應(yīng)迅速，引起研究人員的廣泛關(guān)注。

圖1 異肽鍵介導(dǎo)的多肽連接[16]

2 異肽鍵的形成機制

從異肽鍵的形成機制來看，異肽鍵分子粘合劑的反應(yīng)可以分為脫氨和脫水兩種形式。PilinRing、SnoopRing等第一代分子粘合劑的形成主要包括兩個過程：首先未質(zhì)子化的Lys氨基組以N為基礎(chǔ)，親和攻擊Asn的Cγ，Glu作為反應(yīng)催化劑協(xié)同兩個質(zhì)子轉(zhuǎn)移；之后，自發(fā)形成異肽鍵并釋放氨分子[19]。第二代分子粘合劑SpyRing形成異肽鍵的機制與PilinRing相似，首先是Lys親核性攻擊Asp，隨后Glu協(xié)同質(zhì)子轉(zhuǎn)移，最后形成酰胺鍵并釋放出水分子[20]。

異肽鍵分子粘合劑的自發(fā)反應(yīng)十分高效。以SpyTag和SpyCatcher為例，兩個肽段分別以10 μmol/L的濃度進行混合，反應(yīng)半衰期約為1 min (=1.4×103/(mol/L·s))[20]。為了探究異肽鍵在復(fù)雜環(huán)境中的形成情況，研究人員測試了環(huán)境因素 (不同pH、溫度、時間、緩沖液) 及兩個短肽的比例對異肽鍵形成的影響。結(jié)果顯示，異肽鍵的形成不需要特殊的理化環(huán)境，SpyTag和SpyCatcher兩個肽段在25 ℃、pH 7.0的條件下反應(yīng)15 min的結(jié)合率達到80%以上[7]，且增加SpyTag肽段的摩爾濃度有助于反應(yīng)的徹底進行[8]。

為了驗證Lys、Asn/Asp和Glu是形成異肽鍵的關(guān)鍵殘基，Howarth團隊對這幾個氨基酸依次進行點突變 (KA/NA/DA/EQ)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其中的任意一個氨基酸發(fā)生突變，均不能形成異肽鍵[7,9,21-22]。該突變結(jié)果從側(cè)面驗證了Lys、Asn/Asp和Glu是異肽鍵形成機制中的關(guān)鍵氨基酸。

此外，若將幾種不同的肽段混合，它們相互之間是否會產(chǎn)生交叉反應(yīng)呢？研究表明，SpyRing與SnoopRing相互之間并無交叉反應(yīng)[8]。雖然SnoopTag含有Lys殘基，SpyTag帶有Asp殘基，但兩個肽段并不包含發(fā)揮質(zhì)子轉(zhuǎn)移作用的Glu殘基，因此無法形成異肽鍵。近期，本課題組通過實驗測試了isopeptag-N/pilin-N (PilinRing) 和Spying及isopeptag-N/pilin-N (PilinRing) 和SnoopRing之間同樣沒有發(fā)生交叉反應(yīng)。關(guān)于isopeptag/pilin-C (PilinRing) 與其他肽段是否產(chǎn)生交叉反應(yīng)仍有待驗證。

3 異肽鍵介導(dǎo)的分子環(huán)化

環(huán)肽(Cyclic peptide) 是一類天然存在的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的多肽分子[1-2]。由于環(huán)化結(jié)構(gòu)具有良好的分子穩(wěn)定性，人們采用基因工程、蛋白質(zhì)工程等方法研發(fā)出多種分子環(huán)化技術(shù)，如蛋白質(zhì)反式剪接 (Protein trans-splicing，PTS)[23-24]、內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白表達連接 (Expressed protein ligation，EPL)[25]、轉(zhuǎn)肽酶 (Sortase) 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽作用 (Sortagging)[26-27]等。雖然這些環(huán)化方式可以提高蛋白的穩(wěn)定性，但實現(xiàn)上述連接方式通常需要復(fù)雜的反應(yīng)條件或特定催化劑的參與，且反應(yīng)效率較低，甚至存在剪接的不可控性、缺乏通用性、產(chǎn)物復(fù)雜、得率較低等問題[28-29]。

超強分子粘合劑由于其特異性、穩(wěn)定性且反應(yīng)快速的優(yōu)勢，為蛋白質(zhì)環(huán)化開辟了新思路。近年來，利用異肽鍵介導(dǎo)的分子粘合劑對蛋白質(zhì)進行分子修飾，取得了較大進展 (表1) 。2015年，Schoene等[9]將SnoopTag/SnoopCatcher和isopeptag/pilin-C系統(tǒng)應(yīng)用于β-內(nèi)酰胺酶的分子環(huán)化，發(fā)現(xiàn)野生酶在55 ℃條件下發(fā)生聚沉、可溶性蛋白顯著減少，導(dǎo)致活性快速喪失，而環(huán)化蛋白活性則幾乎不受影響。差示掃描量熱法 (Differential scanning calorimetry) 分析線性和環(huán)化蛋白的溶解溫度，與線性蛋白相比，環(huán)化蛋白的m值顯著上升。野生植酸酶在55 ℃以上的環(huán)境中加熱10 min可溶性蛋白活性開始降低，而SpyTag/SpyCatcher環(huán)化的植酸酶在90 ℃才開始略微下降，且活性影響較小。圓二色譜 (Circular dichroism) 檢測結(jié)果顯示，與野生型植酸酶相比，環(huán)化后的植酸酶二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性顯著增加。Wang等[30]將SpyTag/ SpyCatcher用于介導(dǎo)地衣聚糖酶的環(huán)化，經(jīng)熱處理后，環(huán)化蛋白的活性顯著高于線性蛋白。此外，有研究發(fā)現(xiàn)SpyTag/SpyCatcher環(huán)化增強了螢火蟲熒光素酶的熱穩(wěn)定性，同時其生物活性不受影響[32]。以上各研究團隊的結(jié)果可以得出同樣的結(jié)論，即環(huán)化后蛋白的熱穩(wěn)定性、抗逆能力顯著提高。

基于環(huán)化蛋白的耐熱性，環(huán)化方式可以用于鑒定目標(biāo)蛋白的存在及純化目標(biāo)蛋白。與一般蛋白純化方式相比，該方法雖然會損失部分酶活性，但操作簡便快速，檢測及純化效果依然可觀[9]。本實驗室長期致力于工業(yè)酶的分子改良，已成功構(gòu)建了多種不同構(gòu)象的酶分子，并對環(huán)化蛋白的熱穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進行研究，為后續(xù)研發(fā)多功能復(fù)合酶打下了良好的基礎(chǔ)。然而，利用異肽鍵連接的分子粘合劑并非“無痕” (Not traceless)[7]，對蛋白質(zhì)進行分子環(huán)化時需要在其末端加上SpyTag/SpyCatcher肽段。雖然實際操作時通常在各功能結(jié)構(gòu)域之間加入連接肽來減少空間構(gòu)象造成的相互干擾，但目前關(guān)于SpyTag/SpyCatcher肽段的插入是否會影響蛋白催化性質(zhì)并沒有一致的結(jié)論。有研究表明，環(huán)化前后熒光素酶和β-內(nèi)酰胺酶的m值沒有顯著變化[9,32]，而環(huán)化前后的木聚糖酶和地衣聚糖酶的動力學(xué)參數(shù)則表現(xiàn)出顯著性差異[30,36]。此外，異肽鍵并未達到接近擴散極限 (Diffusion limit) 的反應(yīng)速率 (如生物素-鏈霉親和素)[43]。SpyTag/SpyCatcher僅在微摩爾級和更高濃度肽段間發(fā)生反應(yīng)，從而限制了其應(yīng)用范圍。

表1 基于異肽鍵連接的分子粘合劑的應(yīng)用

4 基于異肽鍵分子粘合劑的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

21世紀(jì)以來，生物技術(shù)和高分子化學(xué)均取得了很大發(fā)展。然而，要實現(xiàn)對高分子的序列、尺寸、組裝過程和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的全面精確控制仍是人們面臨的一大挑戰(zhàn)。近期，利用可基因編碼的SpyTag/SpyCatcher合成類彈性蛋白 (Elastin-like proteins，ELPs)，為蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的開發(fā)提供了新思路。

北京大學(xué)的張文彬研究員將SpyTag和SpyCatcher基因插入類彈性蛋白基因中，以便在原位進行轉(zhuǎn)錄后的拓?fù)湫揎?。利用帶有SpyTag和SpyCatcher不同標(biāo)簽的彈性蛋白在體外組合，獲得蝌蚪型、三臂星型和H型等多種蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[10]。研究人員同時探討了不同表達速度對環(huán)化蛋白大小的影響，表達速度較慢時只形成單環(huán)，而快速表達時，既有單環(huán)也有多環(huán)的形成，這一結(jié)果為構(gòu)建目標(biāo)環(huán)化蛋白提供了依據(jù)。隨后張文彬團隊將SpyTag/SpyCatcher用于蛋白質(zhì)索烴的細(xì)胞合成，其研究結(jié)果表明，較之線性突變及循環(huán)單體蛋白，蛋白質(zhì)索烴結(jié)構(gòu)具有更好的穩(wěn)定性[34]。最近，該團隊進一步開發(fā)出高效的、基因編碼的、機械聯(lián)鎖的SpyX模塊 (AXB和BXA)，用于體內(nèi)工程蛋白質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[33]。包含SpyX模塊的融合蛋白的表達導(dǎo)致了多種機械聯(lián)鎖蛋白拓?fù)涞男纬?，包括蛋白質(zhì)鏈狀結(jié)構(gòu)、專性二聚體和恒星蛋白。在蛋白質(zhì)工程中使用SpyX模塊有很多優(yōu)勢：形成的專性二聚體在較低濃度下也不會電離；可以簡單地通過直接表達來形成星型蛋白質(zhì)；可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，如增強抗胰蛋白酶酶解的能力。SpyX模塊擴大了蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的范圍，成為進一步設(shè)計蛋白質(zhì)功能特性的通用平臺。該團隊基于SpyTag/ SpyCatcher和固有無序蛋白 (Intrinsically disordered proteins，IDPs) 高電荷密度的屬性，進一步改造天然SpyCatcher短肽，使其帶有大量電荷，發(fā)現(xiàn)帶有大量電荷的SpyCatcher (-) 短肽仍然可以與SpyTag形成異肽鍵[44]。此外，SpyCatcher (-) 短肽還能絡(luò)合相反電荷的聚合物，實現(xiàn)展開和折疊態(tài)雙態(tài)的轉(zhuǎn)變等功能，大大擴寬了生物材料體內(nèi)外的合成。

5 異肽鍵分子粘合劑的應(yīng)用

5.1 合成疫苗

合成疫苗是疫苗開發(fā)歷史上的一個里程碑，與傳統(tǒng)減毒或滅活疫苗相比，合成疫苗更加安全。第一代合成疫苗主要是基于DNA重組技術(shù)和基因操縱，不僅耗費大量時間，而且成本高昂[37]。

病毒樣顆粒 (Virus-like particle，VLPs) 是非傳染性的自組裝納米粒子，在醫(yī)學(xué)和納米技術(shù)中發(fā)揮重要作用，特別是在疫苗接種方面。然而，通過基因融合或化學(xué)修飾，對目標(biāo)抗原進行修飾，往往會導(dǎo)致衣殼的錯誤組裝或抗原錯誤折疊，從而阻礙保護性免疫的產(chǎn)生。近年來，Howarth團隊將分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher用于疫苗接種，通過將SpyCatcher融合了噬菌體蛋白AP205 (AP205 CP3)、SpyTag與瘧疾抗原 (CIDR和Pfs25) 混合后與SpyCatcher-AP205共價耦合，可以顯著提高抗原免疫原性[21]。Singh等[45]利用SpyTag- Pfs48/45與SpyCatcher-AP205共價結(jié)合，同樣使抗原免疫原性得到提高。該團隊進一步驗證了表皮生長因子受體和端粒酶中與癌癥相關(guān)的肽鏈的耦合。注射用瘧疾抗原修飾的SpyCatcher-VLPs，在一次免疫后就能有效地誘導(dǎo)抗體反應(yīng)[21]。此外，通過多聚體支架或類病毒顆粒增強細(xì)胞信號也可以增強免疫反應(yīng)不佳的抗原的免疫應(yīng)答[27]。SpyTag/SpyCatcher蛋白質(zhì)組裝技術(shù)產(chǎn)生的新疫苗在發(fā)揮個體功能的同時，還可以有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)。這種蛋白質(zhì)組裝策略可能對高通量抗原篩選或疫苗的快速產(chǎn)生具有重要理論與實踐意義[37,46]。另有研究人員將SpyTag/SpyCatcher用于設(shè)計抗體標(biāo)記，成功實現(xiàn)在亞納米級范圍內(nèi)展示細(xì)胞毒性位點的抗體藥物復(fù)合體，從而擴展了特定抗體的結(jié)合位點[47]。

5.2 細(xì)菌納米生物反應(yīng)器

迄今為止，研究涉及的所有革蘭氏陽性或陰性細(xì)菌，都是從其表面產(chǎn)生外膜囊泡 (Outer membrane vesicles，OMVs)[48]，致病細(xì)菌菌株毒性因子通過外膜囊泡感染宿主細(xì)胞?；谶@種感染途徑，研究人員結(jié)合分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher系統(tǒng)開發(fā)了一種使細(xì)菌能夠同時生產(chǎn)、包裝和分泌活性酶的新方法。OmpA是一種高度表達的細(xì)菌重組蛋白，與細(xì)菌膜上小分子的運輸有關(guān)[49]。來自缺陷短波單胞菌的磷酸三酯酶 (Phosphotriesterase，PTE) 含有Zn/Zn活性位點，能通過水解反應(yīng)將芳基磷酸酯轉(zhuǎn)化為無毒的二基磷酸和芳醇，從而分解有機磷酸酯。然而，磷酸三酯酶存在水解效率低、易失活等缺陷，制約了其在有機磷降解中的應(yīng)用。針對這一問題，研究人員設(shè)計了OmpA-SpyTag和SpyCatcher-PTE兩種構(gòu)象蛋白，通過異肽鍵實現(xiàn)共價結(jié)合。這種共價表達的途徑不僅提高了PTE的生產(chǎn)水平，也提高了其穩(wěn)定性，為有機磷污染區(qū)域的環(huán)境修復(fù)提供了一個很好的模型[44]。這項研究的結(jié)果還可應(yīng)用于設(shè)計類似的蛋白質(zhì)包裝策略，用于不同的藥物輸送、醫(yī)學(xué)診斷等。Giessen等[40]將SpyTag/SpyCatcher用于構(gòu)建MS2噬菌體衣殼的體內(nèi)封裝系統(tǒng)，為生成高度穩(wěn)定的多酶納米反應(yīng)器提供了一種簡單而有效的方法。

研究人員將SpyTag/SpyCatcher系統(tǒng)用于工程催化生物膜，利用大腸桿菌的纖維系統(tǒng)來創(chuàng)建一個功能性的納米纖維網(wǎng)絡(luò)，進行酶的共價固定。將一個α-淀粉酶與SpyCatcher進行重組，并將其固定在大腸桿菌的纖維上與SpyTag進行共價結(jié)合。這種酶化的改良生物膜可以在廣泛的pH值和有機溶劑條件下維持其活性。此外，與其他依賴于高細(xì)胞代謝的基于生物膜的催化劑相比，改良后的生物膜在細(xì)胞死亡后仍然保持活躍狀態(tài)。這一研究將在綠色生物催化領(lǐng)域發(fā)揮廣泛作用，如藥物合成、廢水中的藥物分解、地下水中污染物的去除和生物能源的生產(chǎn)等[37]。

5.3 水凝膠

由于蛋白質(zhì)水凝膠的生物友好性、潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及精確控制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的能力，以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的水凝膠已經(jīng)引起了研究人員的極大關(guān)注。由合成聚合物或天然生物分子組成的傳統(tǒng)的水凝膠，機械性質(zhì)較弱，制約其在不同領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。近年來，基于分子粘合劑SpyTag/ SpyCatcher良好的特異性和穩(wěn)定性，研究人員將其用于蛋白質(zhì)水凝膠的研究。Gao等[38]設(shè)計了SpyTag/SpyCatcher介導(dǎo)的串聯(lián)模塊化蛋白質(zhì)水凝膠。結(jié)果表明，帶有SpyTag/SpyCatcher模塊化的蛋白質(zhì)可以迅速相互反應(yīng)，從而形成柔軟的、化學(xué)交聯(lián)的蛋白質(zhì)水凝膠。該團隊成功地使用這些水凝膠來封裝和培養(yǎng)3D的人類肺纖維細(xì)胞并將其作為藥物輸送的容器。Wang等[39]利用SpyTag/ SpyCatcher研發(fā)出腺苷鈷胺素 (B12) 依賴的光反應(yīng)蛋白水凝膠，并將其應(yīng)用于控制干細(xì)胞蛋白質(zhì)的釋放，將刺激反應(yīng)的蛋白質(zhì)直接組裝到水凝膠中，提供了一種設(shè)計可動態(tài)調(diào)節(jié)材料的通用策略。

5.4 人工代謝通路

隨著生物工程及酶工程的迅速發(fā)展，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛。工業(yè)酶普及的同時，酶穩(wěn)定性和催化活性低的問題不容忽視。針對這一問題，研究人員利用分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher來設(shè)計人工代謝通路，提高工業(yè)酶的應(yīng)用價值。蛋白質(zhì)支架可以實現(xiàn)多酶復(fù)合體的超分子結(jié)構(gòu)，但是蛋白質(zhì)支架需要特定的結(jié)合域，存在不同結(jié)合域的交叉反應(yīng)及不同物種親和力不高的問題[50]，SpyTag/ SpyCatcher的特異性結(jié)合及異肽鍵的穩(wěn)定性可以改善蛋白質(zhì)支架的親和力和穩(wěn)定性。此外，在還原條件下共價二硫鍵很容易分離，是可逆反應(yīng)[16]。而分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher是基因編碼的不可逆的共價結(jié)合，更有利于構(gòu)建穩(wěn)定的多酶復(fù)合體。

6 結(jié)語

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，有關(guān)分子粘合劑的研究成果豐碩。近年來，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了PilinRing、SnoopRing及SpyRing幾種類型的分子粘合劑，并針對異肽鍵的形成機理開展了深入研究，為后續(xù)分子粘合劑的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性較差，制約了其在工業(yè)催化、食品制造、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。長期以來，如何有效提升蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性一直是科研工作者關(guān)注的焦點?；诋愲逆I連接的分子粘合劑具備良好的穩(wěn)定性及特異性，使其在多個領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，可基因編碼、修飾的SpyTag/ SpyCatcher系統(tǒng)，為人工多價疫苗、納米生物反應(yīng)器、蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的開發(fā)等提供了新思路。

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Advances in isopeptide bond-mediated molecular superglue

Deying Gao1, Jiawen Cao1, 3, Xiaobao Sun1, Kexin Zhou1, Tietao Zhang2, and Qian Wang1

1 College of Biological & Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, Zhejiang, China 2 Institute of Special Wild Economic Animals and Plants, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, Jilin, China 3 College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310012, Zhejiang, China

Isopeptide bond-mediated molecular superglue is the irreversible covalent bond spontaneously formed by the side chains of lysine (Lys) and asparagine/aspartic acid (Asn/Asp) residues. The peptide-peptide interaction is specific, stable, and can be achieved quickly without any particular physicochemical factor. In the light of recent progress by domestic and foreign researchers, here we summarize the origin, assembly system and mechanism of isopeptide bond reaction, as well as the molecular cyclization and protein topological structure mediated by it. The prospect for its application in synthetic vaccine, hydrogel and bacterial nanobiological reactor is further discussed.

isopeptide bond, molecular cyclization, mechanism, SpyTag/SpyCatcher, application

10.13345/j.cjb.180303

July 20, 2018;

September 14, 2018

National Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program (No. 201710876020), Zhejiang Provincial Top Key Discipline of Bioengineering (No. KF2016010).

Qian Wang. Tel: +86-574-88222391; E-mail: wangq@zwu.edu.cn

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃 (No. 201710876020)，浙江省生物工程重中之重學(xué)科開放基金 (No. KF2016010) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)