申光富 杜 培 余 蕊 謝召峰 羅長琴

肺纖維化是以成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變，嚴(yán)重影響人體呼吸功能[1-2]。尤其是隨著特發(fā)性肺纖維化發(fā)病率和死亡率逐年增加，近年來受到科研工作者越來越多的關(guān)注，但是到目前為止其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。研究表明，成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致肺纖維化病程發(fā)生發(fā)展的主要細(xì)胞，因此研究成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡及其可能的作用機(jī)制對肺纖維化的阻斷具有重要意義[3-4]。MiRNA作為一類小分子非編碼RNA，能夠與靶基因的非編碼區(qū)域結(jié)合，起到抑制甚至降解靶基因mRNA的作用。相關(guān)研究表明，miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。miR21作為miRNA原癌基因的重要成員，在肺纖維細(xì)胞中過表達(dá)，且與肺成纖維細(xì)胞的增殖、遷移等密切相關(guān)，但是其具體作用機(jī)制仍不明了。血管緊張素參與了肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程，AngⅡ、Ang1-7作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)重要的效應(yīng)分子[7-9]，研究其在肺纖維化病程過程中發(fā)揮的作用具有十分重要的意義。鑒于此，本文探討了miR21在肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及對肺成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并進(jìn)一步研究了miR21促進(jìn)肺纖維化的可能機(jī)制。

材料與方法

一、實驗動物

健康1月齡SPF 級Wistar大鼠，體重50～80 g，雌雄各半，購自于北京維通利華有限責(zé)任公司，室溫、12 h︰12 h明暗交替喂養(yǎng)。

二、實驗方法

1. 大鼠原代肺成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)： 腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，在無菌環(huán)境下分離肺組織，剪碎處理后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)：將PBS反復(fù)沖洗過的大鼠肺組織離心5 min，置于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加15%胎牛血清、10 mmol/L的HEPES緩沖液及100 U/ml的青霉素和鏈霉素，于37 ℃、0.05 CO2、飽和濕度環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)液，約4～7 d后可見組織塊周圍有大量細(xì)胞生長。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后離心棄去上清液，PBS清洗3遍。細(xì)胞傳代3次后收集細(xì)胞，以便后續(xù)檢測。

2. 大鼠原代肺成纖維細(xì)胞鑒定： 鑒定大鼠原代肺成纖維細(xì)胞采用甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫熒光法。細(xì)胞爬片完成后，去除培養(yǎng)液，采取4%多聚甲醛將細(xì)胞固定30 min，采用PBS反復(fù)清洗3次，加入0.25%甲苯胺藍(lán)進(jìn)行30 min染色，采用PBS反復(fù)漂洗3次，然后采4%多聚甲醛中進(jìn)行15 min固定后，在室溫的條件下進(jìn)行10 min的消化，采用PBS反復(fù)漂洗3次，在體積分?jǐn)?shù)為5%的BSA 中進(jìn)行45 min封閉，然后添加稀釋好的一抗( 1︰200 稀釋)，在4 ℃的條件下培養(yǎng)16 h。采用PBS沖洗細(xì)胞3次×5 min，添加稀釋好的熒光二抗(山羊抗兔熒光二抗)，室溫孵育1 h。隨后采用PBS反復(fù)清洗3次(避光)，加入DAPI后在顯微鏡下進(jìn)行觀察并進(jìn)行照相記錄。

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染： 轉(zhuǎn)染前1 d，在不含青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中接種細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)50%時可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用riboFECTTMCP分別轉(zhuǎn)染NC、inhibitor(50 mmol)和mimic(50 mmol)：將各組細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約含1×104個細(xì)胞，培養(yǎng)1 d后，加入2微克相關(guān)質(zhì)粒于400微升無血清DMEM培養(yǎng)基中，將PEI︰DNA=3︰1用200微升無血清高糖培養(yǎng)基稀釋，混勻后靜置5 min；然后兩者混合，震蕩15 s；隨后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到相應(yīng)孔中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后置換培養(yǎng)基為胎牛血清完全培養(yǎng)基，胎牛血清濃度為10%?？瞻讓φ战M不做轉(zhuǎn)染處理。

4. CCK8檢測miR21對肺成纖維細(xì)胞增殖的影響： 將處于對數(shù)生長期的大鼠肺成纖維細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約含1×104個細(xì)胞。分為空白對照組、miR21NC陰性對照組、miR21 inhibitor組、miR21 mimic組。培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT液， 37 ℃孵育箱培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液。每孔加入DMSO 150 μl，震蕩培養(yǎng)，采用酶標(biāo)儀對其光密度OD值( 波長 570 nm)進(jìn)行檢測。

5. 采用流式細(xì)胞儀檢測miR21對肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響： 大鼠肺成纖維細(xì)胞接種于 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約含1×104個細(xì)胞。分為空白對照組、miR21NC陰性對照組、miR21 inhibitor組、miR21 mimic組。培養(yǎng)24、48、72 h后，消化收集細(xì)胞。按照KGA107凱基細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用 PBS對各孔進(jìn)行清洗，將清洗的 PBS于離心管收集，然后以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，去除上清，采用預(yù)冷的 PBS 進(jìn)行重懸，舍去上清，反復(fù)操作2次，采取FITC結(jié)合液進(jìn)行重懸，將重懸液移到1.5 ml 離心管中，在避光的條件下添加FITC，30 min 后添加 PI，孵育5 min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

6. RT-PCR法檢測miR21、Ang(1-7)、AngⅡ基因表達(dá)的變化： 各組肺成纖維細(xì)胞中分別加入Trizol試劑，常規(guī)方法提取RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系擴(kuò)增獲得產(chǎn)物cDNA，-20 ℃保存。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測miR21、Ang(1-7)、AngⅡ基因表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸25 s，循環(huán)40次，最后72 ℃延伸60 s。取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物和6μl的DGL-200 Maker同時上樣，于2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增結(jié)果并拍照。

7. 蛋白免疫印跡Western blot分析AngⅡ、NLRP3蛋白表達(dá)水平變化： 配置10%濃度的SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠，將凝膠置于電泳槽上，并將各組成纖維細(xì)胞提取蛋白上樣電泳。電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，室溫封閉1 h。清洗后分別加入稀釋過(1︰1 000)的BAX、p53蛋白抗體，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次5 min；隨后加入HRP標(biāo)記的二抗(1︰500)，37 ℃作用2 h，TBST洗3次×5 min。設(shè)立陰性對照組，以GAPDH單克隆體為一抗，HRP標(biāo)記的IgG為二抗。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、大鼠原代肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)的大鼠原代肺成纖維細(xì)胞呈梭形或星型，胞質(zhì)透亮，核仁呈橢圓形，細(xì)胞鏈接緊密，邊緣光滑。對原代肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行PT-PCR檢測可知，成纖維細(xì)胞高表達(dá)其標(biāo)志性波形蛋白(Vimentin)，而該蛋白在正常肺泡細(xì)胞中基本不表達(dá)，見表1。

二、miR21對肺成纖維細(xì)胞增殖的影響

CCK8檢測結(jié)果顯示，正常肺成纖維細(xì)胞在各時間點(diǎn)均能正常生長，增殖較為平緩。24 h時miR21各轉(zhuǎn)染組增殖情況與空白對照組進(jìn)行比較，不具有明顯的差異(P>0.05)。在 48、72 h時間點(diǎn)，inhibitor、mimic組與NC對照組進(jìn)行比較，inhibitor組OD值明顯降低，mimic組OD值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。NC組與空白對照組在各時間點(diǎn)OD450 值無明顯差異，不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。即下調(diào)miR21表達(dá)后肺成纖維細(xì)胞增殖受到抑制，上調(diào)miR21表達(dá)后肺成纖維細(xì)胞增殖受到促進(jìn)，說明miR21具有促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖的作用，見表2。

表2 miR21對肺成纖維細(xì)胞增殖的影響

三、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測miR21對肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，miR21 NC組在各時間段的細(xì)胞凋亡率分別為(28.20±5.27)%(24 h)、(35.23±4.32)%(48 h)、(38.34±5.57)%(72 h)，與空白對照組無明顯差異(P>0.05)。miR21過表達(dá)組肺成纖維細(xì)胞凋亡率在個時間段均較NC對照組顯著降低，miR21抑制組較NC組在各時間段細(xì)胞凋亡率均顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。即miR21具有顯著抑制肺成纖維細(xì)胞凋亡的作用，見表3。

表3 miR21對肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響

四、miR21對肺成纖維細(xì)胞Ang(1-7)、AngⅡ基因表達(dá)的變化

表4 PCR過程中引物序列設(shè)計

miR21、Ang(1-7)、AngⅡ以及GAPDH引物設(shè)計，見表4。miR21、Ang(1-7)、AngⅡ在肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，見表5及圖1。Real-time PCR基因檢測結(jié)果可知，與空白對照組相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，inhibitor組miR21表達(dá)水平降低，mimic組miR21表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。與miR21 NC組進(jìn)行比較，miR21 inhibitor轉(zhuǎn)染后，上調(diào)了肺成纖維細(xì)胞Ang(1-7)表達(dá)，下調(diào)了AngⅡ表達(dá)；miR21 mimic轉(zhuǎn)染后，下調(diào)了Ang(1-7)表達(dá)，上調(diào)了AngⅡ表達(dá)，差異具有顯著性(P<0.05)，說明miR21具有抑制Ang(1-7)，促進(jìn)AngⅡ表達(dá)的效果。

表5 RT-PCR 檢測miR21、Ang(1-7)、AngⅡ基因表達(dá)情況

圖1RT-PCR 檢測miR21、Ang(1-7)基因表達(dá)情況

五、miR21對肺成纖維細(xì)胞對AngⅡ、NLRP3蛋白表達(dá)水平變化

miR21對肺成纖維細(xì)胞對AngⅡ、NLRP3蛋白表達(dá)水平變化的影響見表6及圖2。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果可知，與空白對照組相比，miR21 NC組在AngⅡ、NLRP3蛋白表達(dá)水平上無顯著差別(P>0.05)。inhibitor轉(zhuǎn)染miR21表達(dá)受到抑制后，均有下調(diào)AngⅡ、NLRP3水平的效果；mimic轉(zhuǎn)染miR過表達(dá)后，均有上調(diào)了AngⅡ、NLRP3水平的效果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，miR21可通過上調(diào)AngⅡ、NLRP3水平促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。

表6 miR21對肺成纖維細(xì)胞對AngⅡ、NLRP3蛋白表達(dá)水平的影響

圖2Western Blot 檢測AngⅡ、NLRP3蛋白表達(dá)情況

討 論

肺纖維化是一種嚴(yán)重的、慢性進(jìn)行的以彌漫性肺泡壁增厚以及大量細(xì)胞外基質(zhì)沉淀為特征的肺疾病，目前尚缺乏有效的治療措施，其具體的發(fā)病機(jī)制仍不明確[10-11]。成纖維細(xì)胞作為導(dǎo)致肺纖維化病程發(fā)生發(fā)展的主要細(xì)胞，廣泛分布于肺間質(zhì)中，負(fù)責(zé)維持肺的正常形態(tài)并具有修復(fù)功能，其對細(xì)胞增殖、凋亡及對肺纖維化的預(yù)防及治療具有重要意義[12-14]。

miR21作為一個典型的miRNA原癌基因，在成纖維細(xì)胞中較正常肺泡細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡[15-17]；血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可促進(jìn)纖維化細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)炎癥體的激活[18-20]； Ang1-7可拮抗AngⅡ的促增殖及促纖維化的作用；NLRP3炎癥體的激活將會進(jìn)一步導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。但是miR21是否通過介導(dǎo)Ang(1-7)調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)PNLR3炎癥體激活，從而達(dá)到抑制或促進(jìn)肺纖維細(xì)胞的增殖尚未見相關(guān)報道。

本文中我們以大鼠原代肺成纖維細(xì)胞為研究對象，CCK8檢測顯示，miR21 mimic轉(zhuǎn)染后，肺成纖維細(xì)胞增殖顯著增高，inhibitor轉(zhuǎn)染后，肺成纖維細(xì)胞增殖顯著降低，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著時間的延長，細(xì)胞的增殖促進(jìn)或抑制作用更加明顯。流式細(xì)胞分析顯示，與NC組相比，轉(zhuǎn)染后miR21過表達(dá)組肺成纖維細(xì)胞凋亡率在各時間段均較對照組顯著降低顯著，miR21抑制組在各時間段細(xì)胞凋亡率均顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此提示，miR21具有顯著促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖、抑制肺成纖維細(xì)胞凋亡的作用。RT-PCR基因檢測顯示，轉(zhuǎn)染miR21 mimic/inhibitor后，miR21的表達(dá)顯著提高/降低，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。miR21 mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染后，具有顯著下調(diào)/上調(diào)Ang(1-7)、上調(diào)/下調(diào)了AngⅡ表達(dá)的作用，說明miR21具有顯著抑制Ang(1-7)，促進(jìn)AngⅡ表達(dá)的效果。蛋白免疫印跡Western Blot分析表明，miR21 mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染后，上調(diào)/下調(diào)了AngⅡ、NLRP3蛋白表達(dá)水平，與NC對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，miR21可介導(dǎo)Ang(1-7)顯著上調(diào)AngⅡ、NLRP3的表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖、抑制其凋亡的目的。

綜上所述，本研究表明miR21具有促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與miR21介導(dǎo)Ang(1-7)對肺成纖維細(xì)胞AngⅡ誘導(dǎo)的NLR3炎性體激活相關(guān)。但是其具體的作用機(jī)制尚不清楚，還需要進(jìn)一步的深入研究。就目前研究結(jié)果表明，miR21可通過調(diào)控Ang(1-7)、AngⅡ、NLRP3表達(dá)在肺纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，這對于肺纖維化的診斷及治療具有十分重要的意義，同時也為肺纖維化的新的治療手段、抗纖維化藥物的研發(fā)提供了一定的實驗數(shù)據(jù)和理論支持。