王小莉，張雪娟，張 欣，劉慶華，張小民

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.太原市食品藥品檢驗(yàn)所，山西太原030006）

昆蟲不像哺乳動(dòng)物那樣擁有完善的免疫系統(tǒng)，血淋巴是其參與免疫反應(yīng)的主要執(zhí)行者，在抵抗外源物的入侵過程中發(fā)揮重要的作用[1-2]。在生物體內(nèi)，氧化應(yīng)激是機(jī)體進(jìn)行自我保護(hù)的一種方式，因?yàn)闄C(jī)體生命活動(dòng)過程中會(huì)伴隨自由基的產(chǎn)生與消除，二者之間只有保持動(dòng)態(tài)平衡，才能保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。如果二者之間的平衡被打破，機(jī)體將會(huì)受到損傷或?qū)е滤劳?。有研究表明，昆蟲體內(nèi)存在超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等保護(hù)酶[3-4]。生物體受到刺激后，將導(dǎo)致機(jī)體中抗氧化物酶系的動(dòng)態(tài)平衡被打破，使得自由基的數(shù)量增加，從而引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)。SOD是一種以自由基為底物的抗氧化酶，與POD共同作用，清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基，保護(hù)機(jī)體免受傷害[5-6]。張奎花等[5]研究表明，采用異小桿線蟲感染菜青蟲（Pieris rapae）后，體內(nèi)SOD活性呈先升高后降低的變化趨勢，POD活性呈先降低后升高的變化趨勢；靳曉敏等[6]研究表明，采用2種菊酯類農(nóng)藥感染鯉血清后，體內(nèi)SOD活性呈下降趨勢，CAT活性呈先升高后降低的變化趨勢。可見，氧化應(yīng)激在免疫防御過程中也發(fā)揮重要作用。

本研究通過給稻蝗（Oxya chinensis）注射枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），并測定不同時(shí)間段稻蝗血淋巴中SOD和POD的活性，旨在為進(jìn)一步研究稻蝗的免疫反應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試?yán)ハx為中華稻蝗成蟲，于2017年9月11日采自山西省太原市晉源區(qū)（112°48′E，37°73′N）。

供試枯草芽孢桿菌菌種、金黃色葡萄球菌菌種由山西大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；昆蟲超氧化物歧化酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒、昆蟲過氧化物酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)方法 將從田間采回的稻蝗成蟲放置在90 cm×60 cm×60 cm的養(yǎng)蟲籠內(nèi)，喂食新鮮的狗尾巴草，每天換草1～2次；飼養(yǎng)期間每隔4 h在籠外灑水以保持濕度，持續(xù)飼養(yǎng)7 d。

1.2.2 菌液的配制 取LB瓊脂斜面培養(yǎng)48 h的枯草芽孢桿菌一支和LB瓊脂斜面培養(yǎng)72 h的金黃色葡萄球菌一支，每種菌均用10 mL的無菌水分2次將斜面菌苔完全洗下，分別倒入含有玻璃珠的三角瓶中，做好標(biāo)簽，充分振蕩，使菌落分散。吸取配好的菌液置于血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，若濃度過高，則稀釋至菌液濃度大致為1×105個(gè)/mL。

1.2.3 供試蟲處理 試驗(yàn)當(dāng)天，7：00給飼養(yǎng)7 d的稻蝗成蟲分別注射1×105個(gè)/mL枯草芽孢桿菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液，每只稻蝗注射20 μL，每種菌液注射100只，注射完依次放置在相應(yīng)的30 cm×30 cm×30 cm的養(yǎng)蟲籠內(nèi)，做好標(biāo)簽；再取30只稻蝗放置在另一個(gè)籠中作為空白對(duì)照。在注射 4，8，12，24，48 h 時(shí)取血，將所取稻蝗的血淋巴放入PC管中，貼上標(biāo)簽，放置在-80℃的冰箱中備用。

1.2.4 血淋巴中SOD和POD的酶活性測定 利用試劑盒測定血淋巴中SOD和POD的酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。采用單因素方差分析法分析試驗(yàn)組與空白對(duì)照組間的差異顯著性（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染菌后稻蝗血細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化

由圖1可知，試驗(yàn)組SOD活性整體高于對(duì)照組，SOD活性隨注射菌液后時(shí)間的延長呈先升高后降低的變化趨勢，其中，枯草芽孢桿菌組在12 h時(shí)活性達(dá)到最高，金黃色葡萄球菌組在8 h時(shí)活性達(dá)到最高。與空白對(duì)照組相比，枯草芽孢桿菌組在8，12，24 h 時(shí)表現(xiàn)出明顯的差異性（P＜0.05），金黃色葡萄球菌組在8 h時(shí)表現(xiàn)出明顯的差異性（P＜0.05），其他時(shí)間段試驗(yàn)組的SOD活性均與對(duì)照組間無明顯的差異性（P＞0.05）。

2.2 感染菌后稻蝗血細(xì)胞中過氧化物酶（POD）活性的變化

由圖2可知，試驗(yàn)組POD活性均高于對(duì)照組，活性變化不穩(wěn)定。與空白對(duì)照組相比，枯草芽孢桿菌組在8，24，48 h時(shí)POD活性表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）；金黃色葡萄球菌組POD活性在4，24，48 h時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），其余時(shí)間段與對(duì)照組相比均無明顯差異（P＞0.05）。

3 結(jié)論與討論

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶是氧化應(yīng)激保護(hù)酶系統(tǒng)中重要的成分[9]。正常情況下，以上3種酶協(xié)調(diào)一致參與細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除，使生物體的自由基維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行[10-11]。若自由基的清除功能出現(xiàn)異常，會(huì)使機(jī)體受到自由基的損傷[8]。受到異物刺激后，昆蟲體內(nèi)自由基的清除將出現(xiàn)故障，自由基增多，使昆蟲生化反應(yīng)和生理功能紊亂，機(jī)體出現(xiàn)病理性變化。因而，研究昆蟲的抗氧化酶系具有重要的意義。當(dāng)機(jī)體中自由基數(shù)量增加時(shí)，SOD催化O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，再由CAT或POD將H2O2分解成H2O和O2，這樣有毒性的自由基會(huì)轉(zhuǎn)化成無毒的H2O和O2，從而達(dá)到清除自由基的目的[12-17]。姬國紅等[18]研究線蟲感染菜青蟲（Pieris rapae）后體內(nèi)SOD和POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。張玨鋒等[19]研究表明，綠僵菌感染褐飛虱后，褐飛虱體內(nèi)的SOD活性和POD活性均顯著升高。李嘉豐等[20]研究表明，黑斑病侵染五味子后，導(dǎo)致五味子體內(nèi)的SOD和POD酶活性顯著提高。

本研究中，稻蝗感染菌種后其血細(xì)胞中SOD活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，原因可能是由于菌種對(duì)稻蝗血細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致血細(xì)胞中自由基數(shù)量增加，從而使血細(xì)胞中SOD活性增加，用于清除菌種對(duì)稻蝗血細(xì)胞的氧化損傷；稻蝗感染菌種后POD活性變化不穩(wěn)定，POD主要用于清除SOD作用過程中產(chǎn)生的H2O2，使自由基變成無毒害作用的H2O和O2。綜合2種酶活性可知，2種菌均可引起血細(xì)胞抗氧化酶活性的變化，其中，枯草芽孢桿菌對(duì)稻蝗血細(xì)胞抗氧化酶的活性影響較大。受到菌種感染后，稻蝗血細(xì)胞產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，其迅速啟動(dòng)血細(xì)胞中SOD和POD清除自由基，消除自由基對(duì)機(jī)體的毒害，維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)。菌種感染稻蝗后，稻蝗血細(xì)胞中SOD和POD活性均高于對(duì)照組，可見，稻蝗血細(xì)胞可以通過提高酶活性來抵御菌種的毒害作用，這可為研究稻蝗的免疫反應(yīng)提供試驗(yàn)依據(jù)。