黃 浩 ， 周楠迪 ， 田亞平 *

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

氨肽酶（Aminopeptidases，簡稱 AP）是一類能夠水解多肽N末端附近肽鍵釋放出游離氨基酸的外切蛋白酶[1]。對于蛋白質(zhì)水解物苦味的去除[2]、提高營養(yǎng)價值以及深加工等方面具有良好的作用，可應(yīng)用于乳制品、肉制品行業(yè)促進食品風味；此外在醫(yī)療行業(yè)，氨肽酶檢測也可作為一項疾病診斷指標[3]。氨肽酶廣泛存在于動植物和微生物中[4]，根據(jù)不同的標準可以分成很多種類。賴氨酸氨肽酶是指切割多肽鏈N末端賴氨酸殘基效率最高的一類氨肽酶[5]，水解釋放出的游離賴氨酸是人和動物的必需氨基酸，對于人體代謝水平的調(diào)節(jié)、鈣離子的吸收和積累及增強體質(zhì)等方面具有重要作用[6]。因此，賴氨酸氨肽酶在食品工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。

耐熱酶是一類能夠在高溫下保持活性的酶，在工業(yè)領(lǐng)域具有降低制備成本、提高反應(yīng)速率、生產(chǎn)工藝簡化等優(yōu)勢，應(yīng)用前景廣闊[7-8]。因此自從70年代發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生耐熱酶的嗜熱菌以來，耐熱酶迅速成為一個重要的研究領(lǐng)域[9]。目前，大多數(shù)研究仍集中在耐熱酶產(chǎn)生菌的篩選及分離純化上[10-11]，由于野生嗜熱菌的培養(yǎng)條件嚴格、生長速度較慢，實現(xiàn)耐熱酶在常溫宿主中的表達成為一個新的研究方向。

作者在篩選得到一株耐熱賴氨酸氨肽酶產(chǎn)生菌P.sdfdsafda的基礎(chǔ)上[12]，克隆得到該耐熱酶的編碼基因，構(gòu)建重組基因并實現(xiàn)了重組酶在原核宿主E.coil中的異源表達，純化得到電泳純的酶液并初步研究了其特性表征，為進一步研究實現(xiàn)耐熱賴氨酸氨肽酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 Pseudomonas aeruginosa NJ-814:實驗室篩選與保藏；菌株E.coil JM109、E.coil BL21（DE3）:Novagen 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒 pET-42a(+):大連寶生物公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨、酵母粉:英國oxoid公司產(chǎn)品；基因組提取試劑盒:天根生化科技公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒、硫酸卡那霉素:上海生工公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA marker、T4 DNA連接酶:大連寶生物公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒:碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（g/dL）:1胰蛋白胨，0.5 酵母粉，1NaCl；自然 pH。

TB液體培養(yǎng)基 （g/dL）:1.2胰蛋白胨，2.4酵母粉； 體積分數(shù) 0.5%甘油，72mmol/L K2HPO4·3H2O，17mmol/L KH2PO4。

LBK、TBK培養(yǎng)基:分別對應(yīng)在LB液體培養(yǎng)基、TB液體培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為50 μg/mL過濾除菌的硫酸卡那霉素（Kan）。

固體培養(yǎng)基即在對應(yīng)液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1.5 g/dL的瓊脂粉。

1.2 賴氨酸氨肽酶基因的獲取

1.2.1 P.aeruginosa基因組的提取 實驗室前人從土壤中篩選得到一株氨肽酶產(chǎn)生菌銅綠假單胞菌NJ-814（Pseudomonas aeruginosa NJ-814）。取甘油冷凍保藏的P.aeruginosa NJ-814，劃線于LB平板37℃活化培養(yǎng)，挑取活化好的單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。取適量培養(yǎng)液，根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒操作方法提取Pseudomonas aeruginosa基因組。

1.2.2 編碼基因的克隆 根據(jù)NCBI公布的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa GF31氨肽酶基因序列設(shè)計引物:lap-s:5'CCGgaattcATGGTCAGCACCC CGCTTGGCCTGCCGC 3'（小寫字母表示EcoRⅠ酶切位點）；lap-a:5'CCGctcgagTTACTTGATGAAGTC GTGACC 3'（小寫字母表示XhoⅠ酶切位點）。利用1.2.1中提取的基因組作為模板，PCR擴增lap基因。 PCR 反應(yīng)體系（50 μL）:模板 2 μL，lap-s 2 μL，lap-a 2 μL，ddH2O 19 μL，PrimeSTAR MAX 25 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃5 min預變性；95℃15 s變性，55℃30s退火，72℃90s延伸，循環(huán)35次；72℃ 5 min后延伸。

1.3 重組菌的構(gòu)建與表達

1.3.1 基因的連接與轉(zhuǎn)化 PCR產(chǎn)物通過純化試劑盒純化，與質(zhì)粒pET-42a（+）用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ同條件雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收，膠回收產(chǎn)物通過T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，連接液42℃熱擊轉(zhuǎn)化E.coil JM109感受態(tài)細胞，涂布到LBK平板上37℃過夜培養(yǎng)，篩選出具有Kan抗性的轉(zhuǎn)化菌株。菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，雙酶切驗證并送檢上海生工測序。

1.3.2 重組酶的誘導表達與檢測 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細胞獲得重組菌BLAP。挑取單菌落接種于5 mL LBK液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，再以1%的接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)接到50 mL TBK液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達到0.6左右，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導劑IPTG，16℃低溫誘導36h。誘導培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵液離心得到發(fā)酵液上清和菌體沉淀，沉淀用 Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.5）緩沖液漂洗后超聲破碎，破碎液離心收集上清液。

通過LNA比色法[13]測定發(fā)酵液上清中的胞外氨肽酶酶活和破碎液上清中的胞內(nèi)氨肽酶酶活。2 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 9.0）緩沖液加入 1 mL底物亮氨酸對硝基苯胺（L-Leu-pNA）和1 mL適量稀釋的上清液，80℃水浴條件反應(yīng)10 min，405 nm波長下比色測定吸光值。

取發(fā)酵液上清和破碎液上清作為實驗組進行SDS-PAGE電泳，以未連接lap的質(zhì)粒pET-42a(+)轉(zhuǎn)化E.coil BL21（DE3）后經(jīng)過同條件處理作為對照組，驗證重組酶的表達情況。

1.4 重組酶的純化與酶學性質(zhì)

通過Ni-NTA親和層析對重組酶進行純化分離并進行SDS-PAGE電泳驗證。

初步研究了純化后的重組酶的酶學性質(zhì)。

1.5 酶活定義

在80℃水浴條件下每分鐘分解亮氨酸對硝基苯胺（L-Leu-pNA）產(chǎn)生1 μmol對硝基苯胺所需的酶量，即為1個酶活單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌的構(gòu)建

根據(jù)NCBI公布的Pseudomonas aeruginosa GF31氨肽酶DNA序列設(shè)計引物，以Pseudomonas aeruginosa NJ-814基因組為模板，PCR擴增出大小約1.5 kb的DNA條帶。純化的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pET-42a（+）經(jīng)過 EcoRⅠ和 XhoⅠ雙酶切，成為兩端帶有相同粘性末端的基因片段，在T4 DNA連接酶的作用下部分連接形成重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入E.coil感受態(tài)細胞后能使轉(zhuǎn)化子在含有卡那霉素的LB平板上長出單菌落，通過菌落PCR進一步將陽性轉(zhuǎn)化子從空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株中篩選出來，能夠擴增出目標條帶的即對應(yīng)構(gòu)建成功的重組菌BLAP。

BLAP經(jīng)過培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證。重組質(zhì)粒在上海生工測序后得到lap基因的DNA序列，通過DNAMAN翻譯出其所對應(yīng)的氨基酸序列，如圖1所示。該基因長度為1 461 bp，與凝膠電泳結(jié)果相符，共編碼486個氨基酸，通過分析軟件ExPASy預測其相對分子質(zhì)量大小約為54×103。將序列提交到NCBI通過Blast比對，確認PCR擴增得到的目的基因為編碼Pseudomonas aeruginosa氨肽酶的DNA。

圖1 lap基因的核酸序列和氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of gene lap

2.2 重組酶的表達

BLAP按1.3.2所述條件誘導培養(yǎng)后，測得胞內(nèi)氨肽酶酶活約2.5 U/mL，胞外未測到氨肽酶酶活。已知重組酶相對分子質(zhì)量大小約為54×103，同時載體質(zhì)粒pET-42a(+)上GST標簽?zāi)軌虮磉_出約26×103的融合蛋白，共80×103左右，SDS-PAGE對重組酶表達情況的驗證結(jié)果見圖2，可以觀察到破碎液上清電泳在66.4×103與97.2×103之間出現(xiàn)一條對照組沒有的條帶，可以證明重組酶的成功表達。

M:蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1:實驗組破碎液上清液；2:對照組破碎液上清液；3:實驗組發(fā)酵液上清；4:對照組發(fā)酵液上清液

2.3 重組酶的純化

載體質(zhì)粒pET-42a(+)帶有His-tag，使得表達的重組酶能夠通過鎳柱親和層析進行分離純化，純化結(jié)果如表1所示，重組酶純化倍數(shù)為4.7倍，回收率為83.5%。純化后的酶液進行SDS-PAGE分析得到電泳純，見圖3。

表1 重組酶鎳柱純化結(jié)果Table 1 Ni-NTA purification results of the recombinant

2.4 重組酶的酶學性質(zhì)

2.4.1 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性 室溫條件下配制不同pH（3.0～11.0）的緩沖液，測定重組酶在各緩沖液體系中的酶活，如圖4，以pH值為橫坐標、相對酶活為縱坐標，確定該酶的最適反應(yīng)pH為8.3；將酶液置于不同pH條件下，30℃水浴保溫1 h后，測定其殘留酶活，由圖5可知該酶在pH 6.5～9.5之間具有較好的穩(wěn)定性。與課題組報道的野生菌所產(chǎn)氨肽酶最適pH為9.0、在pH 7.5～10.5之間具有穩(wěn)定性[14]是一致的。

圖3 鎳柱純化后的重組酶SDS-PAGE驗證Fig.3 SDS-PAGE identification of the Ni-NTA purified recombinant enzyme

圖4 重組酶最適反應(yīng)pH Fig.4 Optimal reaction pH of the recombinant enzyme

圖5 重組酶pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of the recombinant enzyme

2.4.2 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性 將重組酶與底物置于不同溫度條件下反應(yīng)測定酶活，根據(jù)圖6可知80℃為最適反應(yīng)溫度。將酶液于梯度溫度中分別水浴1 h，再按照標準方法測定處理后的剩余酶活，以4℃酶液保存溫度下的酶活作為對照，如圖7所示，該重組酶經(jīng)過70℃熱處理1 h能保留60%以上的酶活性，與野生菌所產(chǎn)氨肽酶經(jīng)過70℃熱處理2 h后保留約70%酶活[12,15]相比，熱穩(wěn)定性略有降低，但仍比多數(shù)常溫酶具有更好的耐熱性。

圖6 重組酶最適反應(yīng)溫度Fig.6 Optimal reaction temperature of the recombinant enzyme

圖7 重組酶溫度穩(wěn)定性Fig.7 Temperature stability of the recombinant enzyme

2.4.3 底物特異性、動力學分析

分 別 用 Ala-pNA、Arg-pNA、Ile-pNA、LeupNA、Lys-pNA、Met-pNA、Pro-pNA、Val-pNA 作為底物，考察重組酶的底物特異性，如圖8所示，該酶能夠水解Arg-pNA、Leu-pNA和Lys-pNA，對LyspNA的水解能力分別是Arg-pNA的6.6倍、LeupNA的2.4倍。

以不同濃度 （0.2～1.4 mmol/L）的Leu-pNA和Lys-pNA作為底物，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，見圖9-圖10，算得以Leu-pNA為底物的米氏常數(shù)Km為15.07 mmol/L、最大反應(yīng)速率Vmax為12.77 μmol/（L·min）， 以 Lys-pNA 為底物的Km和Vmax分別為 4.86 mmol/L、8.76 μmol/（L·min）。

結(jié)果表明該重組酶對Lys-pNA親和性更強，與野生菌所產(chǎn)的酶表現(xiàn)出相似的底物特異性，同屬賴氨酸氨肽酶。

圖8 重組酶底物特異性Fig.8 Substrate specificity of the recombinant enzyme

圖9 Leu-pNA底物的重組酶雙倒數(shù)圖Fig.9 Lineweaver-Burk plot of the recombinant enzyme with Leu-pNA as substrate

圖10 Lys-pNA底物的重組酶雙倒數(shù)圖Fig.10 Lineweaver-Burk plot of the recombinant enzyme with Lys-pNA as substrate

3 結(jié) 語

論文從野生菌Pseudomonas aeruginosa中克隆出編碼一種氨肽酶的基因lap，利用該基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-42a-lap轉(zhuǎn)化到異源宿主E.coil BL21（DE3）中，形成能夠表達重組氨肽酶的工程菌BLAP。重組酶經(jīng)過Ni-NTA分離純化后得到氨肽酶純酶液。對重組酶的酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶和野生菌所產(chǎn)酶一樣都屬于賴氨酸氨肽酶，在堿性條件下表現(xiàn)出活性，并且具有良好的熱穩(wěn)定性。為進一步研究該重組酶的高效分泌表達和熱穩(wěn)定性氨肽酶的構(gòu)效及進一步的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。