楊麗峰， 伍時華， 趙東玲， 張 健， 黃翠姬

（廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006）

甘蔗糖蜜是制糖工業(yè)的副產品，主要含有30～60 g/dL 的糖、5～10 g/dL 的膠體和 5～16 g/dL 的灰分等其它物質[1]，以及許多酵母發(fā)酵所需的營養(yǎng)成分，已經成為我國南方地區(qū)乙醇生產的主要原料[2]。亞硫酸法制糖得到的糖蜜，亞硫酸鈉質量濃度為200～700 mg/L，亞硫酸鹽是甘蔗糖蜜中影響酵母發(fā)酵的抑制物之一[3]。然而亞硫酸鹽抑制酵母代謝的機理并不完全清楚，目前研究主要集中在細胞和分子水平上，抑制酵母細胞膜的正常代謝，影響酵母糖酵解過程，與乙醛發(fā)生反應，抑制乙醇脫氫酶的活性，誘導胞內活性氧 （reactive oxygen species，ROS）和Ca2+升高，引起酵母死亡[4-7]。針對甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵生產存在的乙醇度低、發(fā)酵周期長問題，開展亞硫酸鹽對酵母細胞乙醇發(fā)酵能力影響的研究，這對甘蔗糖蜜高質量濃度乙醇發(fā)酵工業(yè)生產具有重要的基礎研究意義。

為了研究亞硫酸鹽對蔗糖乙醇發(fā)酵的影響，將NaHSO3貯備液添加到YPS（Yeast Extract Peptone Sucrose)培養(yǎng)基進行乙醇發(fā)酵，通過曲線下面積（Area under the curve/AUC）[8]等方法研究發(fā)酵過程中NaHSO3對蔗糖、果糖和葡萄糖的代謝、細胞生長及乙醇生成的影響，旨在為實現(xiàn)甘蔗糖蜜高質量濃度乙醇發(fā)酵提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 乙醇酵母 （Saccharomyces cerevisiae）GJ2008為甘蔗汁乙醇發(fā)酵的高產菌株，由廣西科技大學發(fā)酵工程研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面活化培養(yǎng)基 (g/L):酵母浸膏10，葡萄糖 20，蛋白胨 20；自然 pH。

一級種子培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏10，葡萄糖20，蛋白胨20；自然pH。

二級種子培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏10，糖蜜204，蛋白胨20；自然pH。

YPS發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏10，蛋白胨20，蔗糖274；自然pH。

以上培養(yǎng)基均于115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 發(fā)酵方法 將實驗室保藏菌種接至一級種子培養(yǎng)基中，搖床120 r/min，32℃培養(yǎng)12 h后以體積分數(shù)10%接種量轉接至二級種子培養(yǎng)基中，搖床120 r/min，32℃培養(yǎng)12 h后經4 000 r/min離心10 min，棄上清液得濕酵母泥，加入無菌水振蕩混合制得10倍濃縮種子懸液。以體積分數(shù)10%接種量（3 mL濃縮種子液）接種至300 mL的YPS發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL三角瓶）進行發(fā)酵，NaHSO3貯備液過濾除菌加入發(fā)酵液中，調節(jié)濃度梯度 （g/L）為0.00、0.16、0.49、1.14、1.63，以 0.00 g/L 為對照試驗組。初始酵母數(shù)約5.15×107個/mL，用透氣膜封口，搖床120 r/min，32℃條件下進行發(fā)酵，每組3個平行。發(fā)酵開始0、3 h以后每隔6 h取樣并測CO2失重，CO2失重小于0.3 g時發(fā)酵結束。

1.2 分析方法

樣品處理:取4 mL發(fā)酵液，12 000 r/min冷凍離心3 min，用移液槍吸取上清液儲存于-60℃冰箱，用于糖和乙醇濃度分析；加入與吸取上清液等量無菌的0.85 g/dL生理鹽水振蕩混合成菌懸液儲存于4℃冰箱，用于測定酵母細胞OD值和死亡率。

發(fā)酵參數(shù)測定:使用SGD-IV全自動還原糖測定儀測定還原糖及酸解后的殘總糖。使用UV-1100紫外可見分光光度計，在560 nm波長下統(tǒng)一稀釋30倍測量菌懸液的吸光度。采用美蘭法[9]測定酵母細胞存活率。采用生物傳感分析儀SBA-40C測定葡萄糖和乙醇濃度，標準品的葡萄糖質量濃度1 g/L、乙醇體積分數(shù)0.075%，發(fā)酵上清液稀釋至合適濃度進樣分析。蔗糖質量濃度等于殘總糖質量濃度減去還原糖質量濃度，果糖質量濃度等于還原糖質量濃度減去葡萄糖質量濃度。

1.3 發(fā)酵過程曲線分析

蔗糖、果糖、葡萄糖、殘總糖的代謝曲線以及OD值和乙醇度變化曲線運用GraphPad Prism 6.0軟件進行繪制，并分別獲得蔗糖、果糖、葡萄糖、殘總糖、OD值和乙醇度曲線下面積[8]，記作蔗糖AUC、果糖AUC、葡萄糖AUC、殘總糖AUC、OD值AUC[10]和乙醇度AUC。

1.4 發(fā)酵參數(shù)計算

發(fā)酵參數(shù)按蔣凱描述方法進行計算[11]。

2 結果與討論

2.1 亞硫酸氫鈉對細胞生長的影響

在不同亞硫酸氫鈉質量濃度（g/L）0.00、0.16、0.49、1.14、1.63條件下，酵母GJ2008生長趨勢基本一致，0～12 h為延滯期和對數(shù)生長期，12 h以后達到穩(wěn)定期，如圖1所示。當NaHSO3質量濃度低于1.14 g/L時，酵母經過短暫的適應后開始快速、大量繁殖；當NaHSO3質量濃度為1.63 g/L時，發(fā)酵0～3 h，細胞數(shù)明顯沒有增加，3 h后細胞才開始呈對數(shù)增長。單位時間OD值AUC（OD值AUC/發(fā)酵時間）可以簡捷、直觀地描述發(fā)酵過程中酵母細胞生物量的變化趨勢，評估酵母的生長狀況[10]。細胞生長狀況越好，細胞數(shù)目越多，單位時間OD值AUC越大，反之亦然[12]。由表1可知，不同NaHSO3質量濃度梯度下，對照組的單位時間OD值AUC最大（16.69），單位時間OD值AUC隨NaHSO3質量濃度的增大而減小，當NaHSO3質量濃度為1.63 g/L時，單位時間OD值AUC最小(14.26)。表明亞硫酸氫鈉的加入使酵母細胞生長緩慢，細胞數(shù)減少；且亞硫酸氫鈉質量濃度越高，細胞總數(shù)越少。

圖1 不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件下乙醇發(fā)酵過程細胞生長曲線Fig.1 Profiles of biomass growth during the alcohol fermentation process by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

表1 不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件下酵母細胞生長曲線下面積Table 1 Area under the biomass production vs.time growth curves for fermentation by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

圖2 不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件下乙醇發(fā)酵過程細胞死亡率曲線Fig.2 Profiles of the death rate during the fermentation process by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

由圖2可知，發(fā)酵0～18 h，不同NaHSO3質量濃度梯度的酵母細胞死亡率都較低，當NaHSO3質量濃度低于0.16 g/L時，酵母細胞在18 h以后開始大量死亡；當NaHSO3質量濃度超過0.49 g/L時，24 h以后酵母細胞死亡率出現(xiàn)快速升高的現(xiàn)象。細胞死亡率越小則酵母死亡率AUC越小，細胞死亡率越大則酵母死亡率AUC越大。如表1所示，未添加NaHSO3對照組的酵母細胞死亡率AUC最?。? 484），酵母死亡率AUC隨NaHSO3質量濃度的增大而增大，當NaHSO3質量濃度為1.63 g/L時，酵母死亡率AUC最大（2 386）。表明NaHSO3的加入抑制了酵母細胞的生長，使細胞生長遲緩、細胞數(shù)減少、細胞活性降低[5]，發(fā)酵時間延長。

2.2 亞硫酸氫鈉對糖代謝的影響

不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件下，初始總糖為274.00 g/L的蔗糖乙醇發(fā)酵殘總糖擬合曲線見圖3。由圖3可知，未添加NaHSO3時，酵母細胞耗糖發(fā)酵48 h結束；NaHSO3質量濃度越高，糖消耗越慢，發(fā)酵時間越長。曲線下面積法能夠簡單、準確地判斷糖的利用情況[8]。殘?zhí)橇吭礁邉t殘總糖代謝AUC越大，說明糖消耗越慢；殘?zhí)橇吭降蛣t殘總糖代謝AUC越小，說明糖消耗越快[13]。由表2可知，不同NaHSO3質量濃度條件下，蔗糖、葡萄糖和果糖的AUC均隨著NaHSO3質量濃度的增大而增大；未添加NaHSO3的殘總糖AUC最小 （4 078），殘總糖AUC隨著NaHSO3質量濃度的增大而增大，當NaHSO3質量濃度為1.63 g/L時，殘總糖AUC達到最大（6 609）。表明亞硫酸氫鈉的加入抑制了酵母細胞的糖消耗，糖利用抑制程度隨亞硫酸氫鈉質量濃度的增大而增強。

圖3 不同亞硫酸氫鈉質量濃度下酵母細胞乙醇發(fā)酵殘總糖代謝擬合曲線Fig.3 Fitted profiles of sucrose metabolism for alcohol fermentation by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

表2 不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件下蔗糖乙醇發(fā)酵殘總糖曲線下面積Table 2 Area under the sugar metabolism curves for ethanol fermentation by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

總糖消耗速率可以定量地表示單位時間糖消耗的快慢[11]。由圖4所示，發(fā)酵0～3 h，對照組總糖消耗速率為9.52 g/(L·h)；NaHSO3質量濃度為 0.16 g/L和1.63 g/L時，總糖消耗速率分別降低了36.97%和81.96%。發(fā)酵3～6 h，對照組總糖消耗速率達到最大25.65 g/（L·h）， 當 NaHSO3質量濃度為 0.16 g/L 和1.63 g/L時，總糖消耗速率分別下降39.65%和78.09%。發(fā)酵6 h后，試驗組酵母細胞糖耗變快，原因是由于開始時細胞生長受到NaHSO3抑制，經過延滯期后細胞糖利用速率變快。發(fā)酵18 h后，乙醇度不斷升高，對酵母細胞有一定的毒害作用，此時細胞生長達到穩(wěn)定期，總糖消耗速率出現(xiàn)下降的趨勢。說明NaHSO3使總糖消耗速率變慢；且NaHSO3質量濃度越高，總糖消耗速率越慢。

圖4不同亞硫酸氫鈉質量濃度下乙醇發(fā)酵過程總糖消耗速率Fig.4 Profiles of total sugar uptake rate during the fermentation process at different sodium bisulfite concentrations

比總糖消耗速率能夠準確地表示單位時間內細胞與糖消耗之間的關系[11]。由圖5可知，發(fā)酵3～6 h，對照組比總糖消耗速率為10.71 g糖/（1 011個活細胞·L·h），當 NaHSO3質量濃度為 0.16 g/L 和 1.63 g/L時，與對照組相比比總糖消耗速率分別下降了30.81%和 43.14%。0～3 h和 3～6 h未添加NaHSO3的對照組比總糖消耗速率遠高于試驗組的比總糖消耗速率，說明NaHSO3的加入使單位數(shù)量的酵母細胞消耗糖的能力降低，發(fā)酵周期延長。

圖5 不同亞硫酸氫鈉質量濃度下乙醇發(fā)酵過程比總糖消耗速率Fig.5 Profiles of special total sugar uptake rate during the fermentation processatdifferentsodium bisulfite concentrations

2.3 亞硫酸氫鈉對葡萄糖和果糖利用差異性的影響

蔗糖在轉化酶的作用下，一分子蔗糖水解為一分子葡萄糖和一分子果糖。葡萄糖與果糖共用一套膜運輸和酶催化體系，但由于膜運輸和酶親和力的差異，酵母優(yōu)先利用葡萄糖，后利用果糖[14-15]。相同初總糖質量濃度條件下，葡萄糖AUC/果糖AUC的值小于1表示酵母優(yōu)先利用葡萄糖，葡萄糖利用速率比果糖利用速率快。由表3可知，同一NaHSO3質量濃度梯度下，葡萄糖AUC/果糖AUC總是隨發(fā)酵時間的延長而依次減小。發(fā)酵6 h到發(fā)酵結束時對照組的葡萄糖AUC/果糖AUC由0.65依次下降至0.32，且葡萄糖AUC/果糖AUC總是小于1，表明酵母優(yōu)先利用葡萄糖，證實了酵母對葡萄糖的嗜好性[16]。不同NaHSO3質量濃度梯度下，同一發(fā)酵時間段葡萄糖AUC/果糖AUC的值隨NaHSO3質量濃度的增大而增大。發(fā)酵12 h時，對照組的葡萄糖AUC/果糖AUC的值為0.55，當NaHSO3質量濃度為1.63 g/L時，與對照組相比葡萄糖AUC/果糖AUC的值增大了27.27%。表明隨著亞硫酸氫鈉質量濃度的增大，葡萄糖消耗速率變慢，葡萄糖代謝更易受到亞硫酸氫鈉的影響，且抑制程度隨亞硫酸氫鈉質量濃度的增大而增強。

表3 不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件下酵母細胞不同發(fā)酵時間點的葡萄糖與果糖代謝面積比值Table 3 Ratio of glucose AUC to fructose AUC during fermentation by S.cerevisiae GJ2008 in YPS media containing different sodium bisulfite concentrations at different fermentation times

2.4 亞硫酸氫鈉對乙醇生成的影響

不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件下，蔗糖乙醇發(fā)酵的乙醇生成曲線見圖6。未添加NaHSO3對照組的乙醇度最高達到15.45%（體積分數(shù)），隨NaHSO3質量濃度的增大，最終乙醇度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。乙醇的生成與細胞數(shù)量和糖消耗有密切的關系[11]，比較圖4和圖7發(fā)現(xiàn)總糖消耗速率和乙醇生成速率總體趨勢基本一致。發(fā)酵3～6 h，對照組酵母細胞處于對數(shù)生長期，乙醇生成速率為 8.86 g/(L·h)，當NaHSO3質量濃度為0.16 g/L和1.63 g/L時，與對照組相比乙醇生成速率分別下降了11.51%和70.32%。由圖8可知，發(fā)酵3～6 h，對照組的比乙醇生成速率為 4.03 g 乙醇/（1011個活細胞·L·h），當 NaHSO3質量濃度為0.16 g/L和1.63 g/L時，與對照組相比比乙醇生成速率分別下降了7.44%和29.28%。結果表明:亞硫酸氫鈉質量濃度越高，糖消耗速率越慢，最終酒精度越低，且亞硫酸氫鈉的加入使單位數(shù)量的酵母細胞生成乙醇的能力降低。

圖6 不同亞硫酸氫鈉質量濃度下乙醇發(fā)酵過程酒精生成曲線Fig.6 Profilesofalcoholproductionduring the fermentation process at different sodium bisulfite concentrations

圖7 不同亞硫酸氫鈉質量濃度下乙醇發(fā)酵過程酒精生成速率Fig.7 Profiles of alcohol production rate during the fermentation process at different sodium bisulfite concentrations

圖8 不同亞硫酸氫鈉質量濃度下乙醇發(fā)酵過程比乙醇生成速率Fig.8 Profiles of special alcohol production rate during the fermentation processatdifferentsodium bisulfite concentrations

表4 不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件下酵母GJ2008蔗糖乙醇發(fā)酵參數(shù)Table 4 Parameters of ethanol fermentation by S.cerevisiae GJ2008 in YPS media at different sodium bisulfite concentrations

2.5 不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件下乙醇發(fā)酵參數(shù)比較分析

不同NaHSO3質量濃度條件下，酒精酵母GJ2008蔗糖酒精發(fā)酵的主要參數(shù)見表4。不同NaHSO3質量濃度梯度下，當NaHSO3質量濃度為0.16 g/L和1.63 g/L，與對照組相比，細胞生長變慢，細胞數(shù)減少，耗糖變慢，殘總糖分別增大了21.32%和47.37%；發(fā)酵周期分別延長了0.00%和37.50%；酒精度分別降低了3.37%和9.19%；乙醇產率分別降低了3.54%和33.86%；總糖發(fā)酵效率分別降低了3.39%和9.21%。耗糖發(fā)酵效率隨NaHSO3質量濃度的增大而降低，但差別不大；試驗組酒精度AUC與對照組酒精度AUC的比值隨NaHSO3質量濃度的增大而變小。當NaHSO3質量濃度為0.16 g/L和1.63 g/L，與對照組相比試驗組乙醇度AUC與對照組乙醇度AUC的比值分別降低了4.94%和27.02%。表明添加亞硫酸氫鈉后酵母細胞的生長受到抑制，細胞生長變慢，總糖消耗速率變慢，發(fā)酵周期延長，殘總糖略高，乙醇度稍低，乙醇產率、總糖發(fā)酵效率和耗糖發(fā)酵效率降低；且抑制程度隨亞硫酸氫鈉質量濃度的增大而增強[6，17]。

3 結 語

甘蔗制糖工藝中的亞硫酸法是用石灰和二氧化硫作為澄清劑的蔗汁澄清方法。硫磺燃燒生成二氧化硫，經過硫熏中和除去蔗汁中的膠體、色素等不利于蔗汁澄清的雜質[18]。SO2易溶于水，水溶液中含有分子 SO2（SO2·H20），HSO3-（亞硫酸氫鹽），SO32-（亞硫酸鹽）。甘蔗制糖的副產物糖蜜中含有少量的亞硫酸鹽[3]，亞硫酸鹽溶液中存在下面的反應:

其解離常數(shù)（pK 值）分別為 pK1=6.91，pK2=1.81[4]。亞硫酸鹽溶液中離子或分子的存在形式與溶液的pH有明顯的關系。由于酵母的胞內pH約為5.5～6.5，亞硫酸鹽主要以HSO3-的形式存在，同時發(fā)酵液中還含有微量的游離 SO2分子[4，6]。

由圖1和表4可知，當NaHSO3質量濃度為0.16 g/L時，與對照組相比細胞數(shù)和發(fā)酵效率都有所降低，此結果與Alves[17]研究類似。不同NaHSO3質量濃度條件下，與對照組相比試驗組酵母細胞生長受到抑制，糖消耗變慢，單位數(shù)量酵母細胞的糖消耗、乙醇生成的能力下降，發(fā)酵周期延長。亞硫酸鹽以游離 SO2的形式抑制酵母細胞的生長[19-20]。Schimz等[19]研究亞硫酸鹽對酵母細胞生長的影響發(fā)現(xiàn):pH低于4.0，Na2SO3的濃度超過1 mmol/L時，酵母細胞生長受到抑制，ATP消耗程度與Na2SO3濃度、溫度、pH等有關。Pilkington等[20]研究亞硫酸鹽對酵母生長的影響，細胞生長的亞硫酸鹽抑制濃度為1.0 mmol/L～2.0 mmol/L，同時伴隨著乙醛和甘油產量的增加。亞硫酸鹽抑制細胞的生長主要表現(xiàn)在3個方面:①游離SO2分子進入酵母細胞后影響細胞膜的正常功能[6]，與特定的受體結合使細胞膜受到傷害，抑制3'磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPS）還原酶活性，使NADPH氧化為NADP+受阻[4]，引起胞內pH下降和跨質膜運輸動力消耗，使細胞生長受到抑制[5，20]；②游離SO2分子進入酵母細胞后使細胞內代謝產物滲漏[4]；③游離SO2分子激活了細胞內的ATP水解酶系統(tǒng)，使細胞內ATP含量快速下降，細胞代謝所需ATP不足[6，19]，最終導致酵母細胞喪失活性[5]。此外，游離SO2分子進入酵母細胞后影響糖酵解過程，使葡萄糖或果糖轉化為丙酮酸受阻；游離SO2分子與乙醛反應，抑制乙醇脫氫酶的活性，致使生成乙醇的能力降低[4]。

本試驗研究了以274 g/L蔗糖為底物的高質量濃度乙醇發(fā)酵過程中，不同亞硫酸氫鈉質量濃度條件對酵母GJ2008細胞生長、糖代謝和乙醇生成等參數(shù)的影響。結果表明:亞硫酸氫鈉的加入抑制了酵母細胞的活力，使糖消耗速率變慢，乙醇產率降低；與果糖代謝相比葡萄糖代謝更易受到亞硫酸氫鈉的影響,且抑制程度隨亞硫酸氫鈉質量濃度的增大而增強。研究亞硫酸氫鈉對蔗糖乙醇發(fā)酵的影響，以AUC等指標可以從整體上反應亞硫酸鹽對糖代謝、細胞生長及乙醇生成的抑制程度，從而為實現(xiàn)甘蔗糖蜜高濃度乙醇發(fā)酵工業(yè)生產提供研究基礎。