金海燕， 金光林， 董光輝， 崔松彪

酒精，又名乙醇(Ethanol)，是最常被濫用的藥物之一。當(dāng)血液中的酒精濃度超過1000 mg/L時(shí)，人就有明顯的酒精中毒癥狀，如興奮、走路不穩(wěn)、嗜睡、麻醉等。小腦是酒精的重要靶點(diǎn)。小腦參與動(dòng)物控制運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、計(jì)劃、自主運(yùn)動(dòng)的精細(xì)調(diào)節(jié)和認(rèn)知功能。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一種逆行信使分子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[1]。N’-硝基-L-精氨酸(NG-Nitro-L-arginine，L-NNA)是NO合成酶抑制劑。它能夠抑制體內(nèi)合成的NO，從而抑制NO升高所帶來的效應(yīng)。大麻素1受體(Cannabinoid type 1，CB1)分布在腦、脊髓與周圍神經(jīng)中，它與動(dòng)物的記憶、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)等功能方面有關(guān)系[2]。在20世紀(jì)70～80年代發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)在一定程度上是在小腦中完成的，且作為一種從適應(yīng)性控制系統(tǒng)來發(fā)揮這一功能[3]。慢性酒精攝入引起的運(yùn)動(dòng)行為障礙與腦內(nèi)NO水平變化有關(guān)系，而CB1受體則不參與其中。NO主要在小腦分子層通路中產(chǎn)生，CB1受體也在小腦浦肯野細(xì)胞層大量分布[4]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)急性及慢性酒精對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的研究較多，但對(duì)NO信號(hào)通路與CB1受體是否參與慢性酒精攝入帶來運(yùn)動(dòng)行為損傷的研究尚少。本研究主要通過行為學(xué)測(cè)驗(yàn)方法觀察慢性酒精攝入對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的影響，觀察慢性酒精攝入對(duì)運(yùn)動(dòng)行為的影響是否與NO信號(hào)通路與CB1受體有關(guān)，為探索慢性酒精攝入對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能的影響機(jī)制提供研究方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用6～8周齡，且體重控制在29 g～30 g的ICR小鼠50只，均使用雄性小鼠，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自由攝食及飲水。本實(shí)驗(yàn)的所有操作均未違背國(guó)際動(dòng)物保護(hù)條例，并接受延邊大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)的監(jiān)督。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)器材與材料 行走障礙分析儀，轉(zhuǎn)棒儀，酒精，氯化鈉，N’-硝基-L-精氨酸(L-NNA)，大麻素1受體抑制劑(AM251)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備 將小鼠分為5組，即對(duì)照組、酒精攝入低劑量組、酒精攝入高劑量組、酒精攝入高劑量+L-NNA組和酒精攝入高劑量+AM251組(每組n=10)，并用染毛試劑做好標(biāo)記。建立動(dòng)物模型，即對(duì)照組腹腔注射9 g/kg生理鹽水，低劑量組注射0.8 g/kg酒精，高劑量組注射1.6 g/kg酒精，每組注射周期為28 d。每日上午同一時(shí)間段注射，每組注射周期為28 d，起始體重為29 g～30 g。

1.4 行走障礙分析測(cè)試 各組模型小鼠腹腔注射結(jié)束后第1天，分別將每組小鼠放到行走障礙分析儀上，讓小鼠在無任何刺激下主動(dòng)在行走障礙分析儀上跑動(dòng)，行走障礙分析儀器的77個(gè)傳感棒自動(dòng)記錄小鼠步態(tài)錯(cuò)誤，并自動(dòng)統(tǒng)計(jì)出每根傳感棒上的錯(cuò)誤次數(shù)及時(shí)間。每只小鼠測(cè)試5次，取5次測(cè)試的總錯(cuò)誤次數(shù)及時(shí)間來進(jìn)行分析。

1.5 加速轉(zhuǎn)棒運(yùn)動(dòng)測(cè)試 各組模型小鼠腹腔注射結(jié)束后第一天，將對(duì)照組、低劑量組、高劑量組小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒儀測(cè)試。加速模式設(shè)定為滾輪的轉(zhuǎn)速在300 s內(nèi)從4 rpm加速到40 rpm[5]。當(dāng)小鼠在某個(gè)轉(zhuǎn)速下不能被動(dòng)行走時(shí)會(huì)掉落，轉(zhuǎn)棒儀自動(dòng)記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上持續(xù)的時(shí)間和掉落時(shí)的速度。每只小鼠測(cè)3次后取平均值。最后將所有小鼠的持續(xù)時(shí)間和速度一起進(jìn)行分析。

1.6 檢測(cè)慢性酒精攝入是否與NO和CB1受體有關(guān) 取20只小鼠，分為兩組，先按高劑量濃度酒精注射28 d后的第1天上午分別腹腔注射1 mg/kg劑量的一氧化氮氧合酶抑制劑(L-NNA)和10 mg/kg劑量的大麻素受體1(CB1)受體抑制劑(AM251)，然后分別在行走障礙分析儀和轉(zhuǎn)棒儀上測(cè)試。研究L-NNA和AM251對(duì)酒精攝入引起的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性損傷的影響。

1.7 測(cè)試酒精攝入影響的消退時(shí)間 將高劑量組的小鼠10只，在結(jié)束腹腔注射酒精后的1 d、1 w、2 w、3 w時(shí)分別按上述方式在行走障礙分析儀和轉(zhuǎn)棒儀上測(cè)試。

2 結(jié) 果

2.1 慢性酒精攝入對(duì)行走運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的影響 經(jīng)過28 d的酒精攝入，我們利用行走障礙分析儀觀察了酒精對(duì)行走運(yùn)動(dòng)的影響。長(zhǎng)期酒精攝入后，可劑量依存地增加四肢行走的錯(cuò)誤率。典型例子(見圖1A、B)，1例酒精高劑量組小鼠四肢在一次測(cè)試中一共出現(xiàn)3次錯(cuò)誤，錯(cuò)步共持續(xù)48 ms，分別出現(xiàn)在第13和38傳感棒上。酒精低劑量(0.8 g/kg)組小鼠四肢(見圖1C)和前肢(見圖1E)行走錯(cuò)誤次數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而高劑量(1.6 g/kg)組小鼠四肢(見圖1C)和前肢(見圖1E)行走錯(cuò)誤次數(shù)顯著高于低劑量組(P<0.05)。此外， 酒精攝入不僅增加四肢行走錯(cuò)誤次數(shù)，而且顯著增加錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間，低劑量組小鼠四肢(見圖1D)和前肢(見圖1F)行走錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)，而高劑量組小鼠四肢(見圖1D)和前肢(見圖1F)行走錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間顯著高于低劑量組(P<0.05)。

2.2 慢性酒精攝入對(duì)平衡調(diào)節(jié)的影響 經(jīng)過28 d的酒精攝入，利用轉(zhuǎn)棒儀觀察了酒精對(duì)平衡調(diào)節(jié)的影響。長(zhǎng)期酒精攝入后，可劑量依存地縮短小鼠在加速轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間，同樣，掉落時(shí)的轉(zhuǎn)速也劑量依存地減慢。低劑量組小鼠在加速轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間顯著短于對(duì)照組(P<0.05)；而高劑量組小鼠在加速轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間短于低劑量組(P<0.05)(見圖2A)。低劑量組小鼠掉落時(shí)的轉(zhuǎn)速顯著慢于對(duì)照組(P<0.05)；而高劑量組小鼠掉落時(shí)的轉(zhuǎn)速慢于低劑量組(P<0.05)(見圖2B)。

2.3 NO合成酶抑制劑對(duì)酒精攝入引起的行走運(yùn)動(dòng)損傷的影響 在高劑量酒精攝入結(jié)束后的第一天小鼠腹腔注射NO合成酶抑制劑(L-NNA)，然后利用行走障礙分析儀觀察了NO合成酶抑制劑對(duì)慢性酒精攝入引起的行走運(yùn)動(dòng)損傷的影響。給高劑量組小鼠腹腔注射NO合成酶抑制劑后發(fā)現(xiàn)，能減少高劑量組小鼠四肢行走的錯(cuò)誤率。典型例子(見圖3A、B)，1例酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠四肢在一次測(cè)試中一共出現(xiàn)一次錯(cuò)誤，錯(cuò)步共持續(xù)16 ms，出現(xiàn)在第27個(gè)傳感棒上。酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠四肢(見圖3C)行走錯(cuò)誤次數(shù)顯著低于高劑量組(P<0.05)；酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠四肢(見圖3D)錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間顯著短于高劑量組(P<0.05)。

2.4 NO合成酶抑制劑對(duì)酒精攝入引起的平衡調(diào)節(jié)損傷的影響 在高劑量酒精攝入結(jié)束后的第一天小鼠腹腔注射NO合成酶抑制劑(L-NNA)，然后利用轉(zhuǎn)棒儀觀察了NO合成酶抑制劑對(duì)慢性酒精攝入引起的平衡調(diào)節(jié)損傷的影響。小鼠腹腔注射NO合成酶抑制劑后也發(fā)現(xiàn)，能延長(zhǎng)高劑量組小鼠在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間。酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠在加速轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間(見圖4A)顯著長(zhǎng)于高劑量組(P<0.05)；酒精攝入高劑量+L-NNA組小鼠掉落時(shí)的轉(zhuǎn)速(見圖4B)顯著快于高劑量組(P<0.05)。上述結(jié)果表明，NO合成酶抑制劑能夠改善酒精攝入對(duì)行走運(yùn)動(dòng)損傷作用。

2.5 抑制CB1受體對(duì)酒精攝入引起的行走運(yùn)動(dòng)損傷的影響 在高劑量酒精攝入結(jié)束后的第一天小鼠腹腔注射CB1受體抑制劑(AM251)，然后利用行走障礙分析儀觀察了CB1受體抑制劑對(duì)酒精攝入引起的行走運(yùn)動(dòng)損傷的影響。典型例子(見圖5A、B)，1例酒精攝入高劑量+AM251組小鼠四肢在一次測(cè)試中一共出現(xiàn)兩次錯(cuò)誤，錯(cuò)步共持續(xù)48 ms，分別出現(xiàn)在第33和60傳感棒上。給高劑量組小鼠腹腔注射CB1受體抑制劑后發(fā)現(xiàn)，不能減少高劑量組小鼠四肢行走的錯(cuò)誤率，酒精攝入高劑量+AM251組小鼠四肢(見圖5C)行走錯(cuò)誤次數(shù)與高劑量組沒有差異(P>0.05)；酒精攝入高劑量+AM251組小鼠四肢(見圖5D)錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間與高劑量組沒有差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明，CB1受體阻斷劑不能改善酒精攝入對(duì)行走運(yùn)動(dòng)的損傷作用。

2.6 抑制CB1受體對(duì)酒精攝入引起的平衡調(diào)節(jié)損傷的影響 在高劑量酒精攝入結(jié)束后的第1天小鼠腹腔注射CB1受體抑制劑(AM251)，然后利用轉(zhuǎn)棒儀觀察了CB1受體抑制劑對(duì)酒精攝入引起的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)損傷的影響。給高劑量組小鼠腹腔注射CB1受體抑制劑后發(fā)現(xiàn)，不能延長(zhǎng)高劑量組小鼠在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間，酒精攝入高劑量+AM251組小鼠在加速轉(zhuǎn)棒上持續(xù)時(shí)間(見圖6A)與高劑量組沒有差異(P>0.05)；酒精攝入高劑量+AM251組小鼠掉落時(shí)的轉(zhuǎn)速(見圖6B)與高劑量組沒有差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明，CB1受體阻斷劑不能改善酒精攝入對(duì)平衡調(diào)節(jié)的損傷作用。

2.7 慢性酒精攝入引起運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能損傷的消退過程 在酒精攝入高劑量組小鼠停止酒精攝入后1 d(0 w)、1 w、2 w、3 w時(shí)的行走障礙分析測(cè)試及加速轉(zhuǎn)棒測(cè)試結(jié)果表明：小鼠四肢行走錯(cuò)誤次數(shù)及錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間逐漸減少(見圖7A、B)，3 w后消失，行走運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)到酒精攝入前水平(P<0.05)；小鼠在加速轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間及掉落時(shí)的轉(zhuǎn)速逐漸延長(zhǎng)及加快(見圖7C、D)，3 w后恢復(fù)到酒精攝入前水平(P<0.05)。綜上所述，長(zhǎng)期酒精攝入引起運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能的損傷作用隨著酒精攝入的停止可逐漸消退，恢復(fù)到酒精攝入前水平。

A：1例高劑量組小鼠在一次測(cè)試中的四肢行走錯(cuò)誤次數(shù)；B：1例高劑量組小鼠在一次測(cè)試中的四肢行走錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間；C：不同劑量酒精攝入對(duì)四肢行走錯(cuò)誤次數(shù)的影響；D：不同劑量酒精攝入對(duì)四肢行走錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間的影響；E：不同劑量酒精攝入對(duì)前肢行走錯(cuò)誤次數(shù)的影響；F：不同劑量酒精攝入對(duì)前肢行走錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間的影響。與對(duì)照組相比*P< 0.05；與低劑量組比較#P<0.05

圖1 慢性酒精攝入對(duì)行走運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的影響

A：不同劑量酒精攝入對(duì)小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上的持續(xù)時(shí)間的影響；B：酒精攝入對(duì)小鼠從轉(zhuǎn)棒儀上掉落時(shí)轉(zhuǎn)速的影響。與對(duì)照組相比*P<0.05；與低劑量組比較#P<0.05

圖2 慢性酒精攝入對(duì)平衡調(diào)節(jié)的影響

A：NNA組小鼠在1次測(cè)試中的四肢行走錯(cuò)誤次數(shù)；B：1例L-NNA組小鼠在1次測(cè)試中的四肢行走錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間；C：對(duì)照組、酒精攝入高劑量組和L-NNA組的四肢行走錯(cuò)誤次數(shù)；D：對(duì)照組、酒精攝入高劑量組和L-NNA組的四肢行走錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間。與高劑量組比較#P<0.05

圖3 NO合成酶抑制劑對(duì)酒精攝入引起的行走運(yùn)動(dòng)損傷的影響

A：對(duì)照組、酒精攝入高劑量組和L-NNA組小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上的持續(xù)時(shí)間；B：對(duì)照組、酒精攝入高劑量組和L-NNA組小鼠從轉(zhuǎn)棒儀上掉落時(shí)的轉(zhuǎn)速。與高劑量組比較#P<0.05

圖4 NO合成酶抑制劑對(duì)酒精攝入引起的平衡調(diào)節(jié)損傷的影響

A：1例AM251組小鼠在一次測(cè)試中的四肢行走錯(cuò)誤次數(shù)；B：1例AM251組小鼠在一次測(cè)試中的四肢行走錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間；C：對(duì)照組、酒精攝入高劑量組和AM251組的四肢行走錯(cuò)誤次數(shù)；D：對(duì)照組、酒精攝入高劑量組和AM251組的四肢行走錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間。與高劑量組比較#P>0.05

圖5 抑制CB1受體對(duì)酒精攝入引起的行走運(yùn)動(dòng)損傷的影響

A：對(duì)照組、酒精攝入高劑量組和AM251組小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上的持續(xù)時(shí)間；B：對(duì)照組、酒精攝入高劑量組和AM251組小鼠從轉(zhuǎn)棒儀上掉落時(shí)的轉(zhuǎn)速。與高劑量組比較#P>0.05

圖6 抑制CB1受體對(duì)酒精攝入引起的平衡調(diào)節(jié)損傷的影響

A：停止酒精攝入后，四肢行走錯(cuò)誤次數(shù)的消退過程；B：停止酒精攝入后，四肢行走錯(cuò)誤持續(xù)時(shí)間的消退過程；C：停止酒精攝入后，小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上的持續(xù)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)的過程；D：停止酒精攝入后，小鼠掉落時(shí)的轉(zhuǎn)速逐漸增快的過程。與停止注射酒精后1 d(0 w)比較#P<0.05

圖7 慢性酒精攝入引起運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能損傷的消退過程

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)主要通過建立不同劑量的慢性酒精攝入的模型小鼠，利用行走障礙分析儀和轉(zhuǎn)棒儀觀察慢性酒精攝入對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的影響，觀察酒精攝入引起的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)損傷作用與酒精攝入停止的關(guān)系;觀察NO氧合酶抑制劑和CB1受體抑制劑對(duì)酒精攝入引起的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)損傷的影響。本研究的結(jié)果主要發(fā)現(xiàn)慢性酒精攝入可劑量依存地導(dǎo)致小鼠的步態(tài)錯(cuò)誤次數(shù)和錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間顯著增加，在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間明顯縮短，對(duì)轉(zhuǎn)棒儀的轉(zhuǎn)速要求明顯減小，提示酒精攝入對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的損傷作用具有劑量依存性。然而值得注意的是：腹腔注射NO合成酶抑制劑改善酒精攝入對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的損傷作用，顯著減少步態(tài)錯(cuò)誤次數(shù)和錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間降低，明顯增加轉(zhuǎn)棒上持續(xù)時(shí)間及轉(zhuǎn)速。我們的研究成果表明慢性酒精攝入通過NO信號(hào)通路損傷小鼠運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)功能。

事實(shí)上，酒精對(duì)大腦功能的影響主要發(fā)生在低濃度到100 mmol的范圍內(nèi)[6]，且低濃度酒精的作用在人和動(dòng)物身上表現(xiàn)不同[7]。慢性酒精暴露和酒精使用障礙對(duì)社會(huì)的負(fù)面影響較大，包括人際關(guān)系的不協(xié)調(diào)、失業(yè)、精神癥狀、肝功能衰竭和嚴(yán)重的認(rèn)知障礙[8]。酒精攝入引起的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、平衡、行為、言語和認(rèn)知功能的改變被認(rèn)為一部分是由小腦功能受損所介導(dǎo)的[9]。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酒精可劑量依存地?fù)p傷運(yùn)動(dòng)行為功能，此結(jié)果與Laurent Servais等研究的結(jié)果一致[10]，表明慢性酒精攝入對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能損傷有顯著影響，它的影響表現(xiàn)在主動(dòng)性和被動(dòng)性的行走功能。慢性酒精中毒導(dǎo)致的肢體震顫及行走不穩(wěn)等癥狀甚至可持續(xù)到清醒后狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：慢性酒精攝入可劑量依存地導(dǎo)致小鼠的步態(tài)錯(cuò)誤次數(shù)和錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間顯著增加，在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間明顯縮短，對(duì)轉(zhuǎn)棒儀的轉(zhuǎn)速要求明顯減小，提示酒精攝入對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的損傷作用具有劑量依存性。

酒精可通過直接增強(qiáng)外源性GABAA受體發(fā)揮作用，也可通過抑制鈉鉀依賴式ATP酶、鉀通道和神經(jīng)元一氧化氮合酶，間接地增加自發(fā)性高爾基細(xì)胞的放電[11]。在體內(nèi)條件下，長(zhǎng)期系統(tǒng)地給予酒精會(huì)導(dǎo)致NO水平的劑量依賴性增加，說明酒精的消耗可能導(dǎo)致NO水平的增加。它還可以促進(jìn)細(xì)胞毒性的形成，如過氧化亞硝酸鹽的形成，可能與高度損害蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)期腹腔注射高劑量酒精的小鼠注射了L-NNA后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)運(yùn)動(dòng)行為的改變明顯好轉(zhuǎn)，從而說明酒精的消耗引起NO水平的升高，且NO水平的上升與運(yùn)動(dòng)行為損傷機(jī)制有關(guān)。CB1受體在小腦、基底核有分布，它也參與共濟(jì)失調(diào)、不隨意運(yùn)動(dòng)等，由此可猜想慢性酒精攝入帶來的運(yùn)動(dòng)行為障礙可能與CB1受體相關(guān)。然而，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給高劑量組小鼠注射CB1受體抑制劑后，并未發(fā)現(xiàn)小鼠運(yùn)動(dòng)行為得以改善。這能間接說明，腦消耗酒精導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)行為損傷時(shí)并沒有CB1受體參與其中。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)慢性酒精攝入可劑量依存地?fù)p傷運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能，腹腔注射NO合成酶抑制劑能夠改善酒精攝入對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的損傷作用，顯著減少步態(tài)錯(cuò)誤次數(shù)和降低錯(cuò)步持續(xù)時(shí)間，明顯增加轉(zhuǎn)棒上持續(xù)時(shí)間及轉(zhuǎn)速。本研究結(jié)果表明慢性酒精攝入是通過NO信號(hào)通路來損傷小鼠運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)功能。