丁洪流， 沈福苗， 成玉梁， 謝云飛， 于 航， 姚衛(wèi)蓉， 郭亞輝*， 錢 和

(1.蘇州市質(zhì)量技術監(jiān)督綜合檢驗監(jiān)測中心，江蘇蘇州 215000; 2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214000)

孔雀石綠(Nalachite Green,MG)是一種三苯甲烷類染料，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中曾被廣泛用作殺菌劑，但其具有毒性和致癌性，且毒性隨著暴露時間、溫度和濃度而增加[1 - 3]。但由于MG抗菌效果好、價格低廉，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍有違規(guī)使用的情況。因此，出于對人們健康的考慮，以及對水產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)督，建立一個快速測定水體中MG的分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。

國內(nèi)目前比較常見的MG檢測方法有拉曼光譜法[4 - 5]、液相色譜法[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8 - 9]、其他光譜法[10 - 11]和電化學分析法[12 - 13]等。這些方法相對來說均具有較好靈敏度和較低的檢出限，但是也存在一些缺陷，比如拉曼光譜法納米粒子不穩(wěn)定，測定時受影響較大；液相色譜法前處理復雜，花費時間長，檢測成本高；電化學方法則存在電化學修飾困難，操作難度大的問題。本文建立的DNA增強熒光法檢測時間短，只需1.5～2.5 h即可完成檢測，且操作簡單，可應用于養(yǎng)殖水體快速檢測。MG本身熒光強度小，不能直接使用熒光光譜儀進行檢測。已有報道[14]表明MG可結合到富含G堿基DNA形成的G -四聯(lián)體上，并且熒光強度顯著增強，故本工作在此原理基礎上，研究并建立了基于G -四聯(lián)體增強的熒光法快速檢測MG的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4600熒光光譜儀(日本，Hitachi Co.Ltd)；M5酶標儀(美國，Molecular Devices公司)。

本研究使用的DNA均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。DNA的儲備溶液用超純水制備，并根據(jù)波長260 nm處的紫外吸光度準確定量濃度?？兹甘G(MG)標準品(純度96%)，購自北京百靈威科技有限公司。NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(PBS,0.2 mol/L，pH=6.6)：稱取1.064 g Na2HPO4，1.950 g NaH2PO4·2H2O，溶解定容至100 mL。Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=6.5，100 mmol/L K+)：稱取0.606 g Tris，0.745 g KCl，定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至6.5。Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=6.5，100 mmol/L Na+)：稱取0.606 g Tris，0.584 g NaCl，定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至6.5。上述所用試劑均為分析純。實驗用水為 Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。

水樣取自江南大學校內(nèi)小蠡湖。

1.2 檢測體系篩選

DNA增強熒光法快速檢測MG過程如下：在170 μL緩沖溶液中，依次加入10 μL 100 μmol/L DNA，20 μL 100 μmol/L MG溶液(線性實驗中為20 μL不同濃度的MG標準溶液，實際樣品檢測時為20 μL水樣)，使檢測體系總體積為200 μL，劇烈混勻后，室溫靜置1 h，在630 nm激發(fā)波長下進行熒光測定，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設定為20 nm。分別改變緩沖溶液和DNA種類進行上述檢測過程。熒光測定使用酶標儀(M5，美國Molecular Devices公司)。

1.3 檢測限及實際樣品測定

改變檢測體系中MG濃度并進行熒光檢測，并制作標準曲線，采用3倍噪聲值時的濃度作為檢測限。采用本研究檢測方法直接檢測?；厥章蕼y定：將取至小蠡湖的水樣作為基質(zhì)，向其中加入MG標準溶液，使其濃度分別為0.5、1.0、5.0 μmol/L，配制成模擬水樣進行檢測。具體檢測過程同上。

1.4 熒光強度及穩(wěn)定性實驗

采用0.5、1.0、5.0 μmol/L 3個濃度的MG溶液，分別改變DNA濃度，采用上述體系進行實驗。測定熒光強度。穩(wěn)定性實驗：H22 DNA(5 μmol/L),Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=6.5，100 mmol/L K+)與1 μmol/L MG形成的檢測體系產(chǎn)生的熒光強度，通過放置不同時間檢測其熒光強度。

2 結果與討論

2.1 最佳檢測條件的選擇

表1羅列了本實驗中采用的11種DNA序列，均為富G序列。3種緩沖溶液分別為磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液和含100 mmol/L Na+Tris-HCl緩沖溶液。

表1 11種寡核苷酸(DNA)名稱及序列

圖1 分別由3種緩沖溶液及11種DNA序列組成的33種檢測體系測定孔雀石綠的相對熒光強度Fig.1 Relative fluorescence intensity of malachite green in 33 detection systems consisting of 3 kinds of buffer solutions and 11 kinds of DNA sequences

分別改變檢測體系中緩沖溶液種類以及DNA種類進行DNA增強熒光法快速檢測，研究不同體系對MG熒光增強的影響。圖1所示為3種緩沖溶液及11種DNA序列檢測體系測定MG相對熒光強度結果三維柱狀圖。如圖所示，共有33個體系，每個體系分別對應于一個空白對照，x軸上對應的列為11種DNA分別與3種緩沖溶液形成的體系，y軸上對應的行為3種緩沖溶液分別與11種DNA形成的溶液，包括三行對照。首先，分別從3種溶液進行觀察。在PBS體系中，與DNA8形成的體系與MG結合顯示最強的熒光，其次是DNA7和DNA6，三者區(qū)別不大，最小的是DNA9。在含100 mmol/L Na+Tris-HCl緩沖溶液中，與DNA8形成的體系與MG結合具有最大的熒光強度，其次是DNA7和DNA6，三者區(qū)別不大，最小的是DNA9，這個結果與PBS體系類似。在含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液中，與DNA11形成的緩沖體系測定MG具有最強熒光，其次是DNA5，最小的是DNA9。其次，縱觀11種DNA，DNA1、2、3、4、9、10與3種溶液形成的體系測定MG熒光強度具有一致性，說明這些DNA與MG作用產(chǎn)生熒光強度幾乎不受這3種緩沖溶液種類的影響。DNA6、7、8與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系檢測熒光強度小于其它兩種溶液。DNA5和DNA11與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系檢測熒光強度大于其它兩種溶液。從整體上來看，DNA11與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系檢測MG具有最大的相對熒光強度。PBS和含100 mmol/L Na+Tris-HCl緩沖溶液與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系具有顯著性差異，結合3種緩沖溶液的組成進行對比分析，可以推測影響DNA與MG結合產(chǎn)生的熒光強度的主要因素是鹽離子，且Na+和K+對不同種類的DNA的影響結果是不同的。

圖2 MG與DNA11-Tris-HCl(100 mmol/ K+)緩沖溶液體系檢測MG的熒光光譜圖對比Fig.2 Comparison of fluorescence spectra of MG and MG detected by DNA11-Tris-HCl(100 mmol/K+) buffer solution system

從上述篩選實驗結果可得DNA11與含100 mmol/L K+Tris-HCl緩沖溶液形成的體系結合MG產(chǎn)生的熒光相對強度最大，故采用此檢測條件進行后續(xù)檢測實驗。圖2所示為MG自身熒光光譜圖與DNA11-Tris-HCl(100 mmol/L K+)緩沖體系檢測10 μmol/L MG的熒光光譜圖?？梢杂^察到添加了DNA緩沖體系后的MG溶液熒光強度顯著性增強(增強了約36倍)，這是由于H22 DNA在Tris-HCl(100 mmol/L K+)緩沖體系中易穩(wěn)定形成分子內(nèi)G -四聯(lián)體結構[15]。文獻的報道[16]中也指出體外生物濃度(20 mmol/L)下的K+、Na+離子可以穩(wěn)定DNA形成的G-四聯(lián)體結構，以前者的效果明顯[16]。對檢測溶液進行激發(fā)和發(fā)射光譜掃描發(fā)現(xiàn)最大激發(fā)/發(fā)射波長為630/680 nm，其結果與MG自身最大激發(fā)和發(fā)射波長相近。

2.2 DNA濃度選擇及熒光穩(wěn)定性研究

對篩選出的DNA11-Tris-HCl體系進行DNA濃度研究，選擇了3個濃度(0.5、1.0、5.0 μmol/L)MG，用不同濃度的DNA分別進行檢測。結果如圖3所示，可以觀察得到3個濃度MG檢測結果具有相似性，隨著DNA濃度的增加，檢測體系熒光強度增大，DNA濃度在3.0 μmol/L之前時，熒光強度增大非常迅速，在5.0 μmol/L時基本達到穩(wěn)定。猜測DNA濃度增大熒光強度隨之增大的原因是隨著DNA濃度增大，DNA與MG比率也增大，溶液中DNA分子數(shù)增加，故而形成的G -四聯(lián)體結構數(shù)量也增加，故而MG分子能更容易的，也更多的結合至G -四聯(lián)體上，從而熒光強度增大。結合實驗結果綜合考慮，DNA濃度選擇5.0 μmol/L。

圖3 DNA濃度優(yōu)化Fig.3 Optimization of DNA concentrations

采用DNA11-Tris-HCl-MG體系，DNA濃度5.0 μmol/L，MG濃度1.0 μmol/L，分別放置不同的時間測定熒光強度。結果顯示熒光強度在1 h之內(nèi)快速達到最大值，在30 h之內(nèi)基本保持恒定。

圖4 DNA增強熒光法檢測MG標準曲線Fig.4 Standard curve of DNA-enhanced MG fluorescence assay

2.3 標準曲線及檢測限

對于H22 DNA增強MG的熒光強度與MG濃度的相關性進行了研究。配制0～6 μmol/L系列標準溶液進行熒光強度測定，結果如圖4所示。測定MG熒光強度與其濃度有很好的線性相關性，線性方程為：y=5206.902x+277.866，相關性系數(shù)(R2)達0.9941，線性范圍為0.1～6.0 μmol/L。根據(jù)標準曲線，以3倍噪聲值時的濃度作為檢測限，得到此方法的檢測限為0.083 μmol/L。

2.4 選擇性實驗

選擇水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的7種抗生素作為對照，分別為甲砜霉素、鹽酸四環(huán)素、羅紅霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉、氯霉素、頭孢拉定。結果如圖5(A)所示，激發(fā)波長為630 nm，檢測結果差異非常顯著，可知此方法檢測MG具有非常好的選擇性。圖5(B)所示為干擾性實驗，分別在MG標準溶液中添加等量的7種抗生素，結果顯示，MG分別添加7種抗生素后檢測的相對熒光強度與未添加的MG檢測結果相近，其熒光強度并未出現(xiàn)顯著性變化，故此方法用于檢測養(yǎng)殖水體中的孔雀石綠具有很好的實用性。

圖5 (A)7種抗生素及MG檢測的相對熒光強度;(B)MG及分別添加7種抗生素的MG的相對熒光強度Fig.5 (A)Relative fluorescence intensities of 7 kinds of antibiotics and MG;(B)Relative fluorescence intensities of MG and MG with 7 kinds of antibiotics added

2.5 實際樣品檢測及回收率測定

實際樣品用DNA增強熒光快速檢測法進行檢測,結果未檢出。為測試該方法在實際樣品中的檢測能力，進行了加標回收率實驗。將取至小蠡湖的水樣作為基質(zhì)，向其中加入MG標準溶液，使其濃度分別為0.5、1.0、5.0 μmol/L，配制成模擬水樣進行檢測，如表2所示，回收率范圍為93.4%～119.3%。該方法有望應用于實際樣品的檢測中。

表2 實際樣品檢測回收率表

3 結論

本文利用分子內(nèi)G -四聯(lián)體DNA與孔雀石綠結合會顯著性增強孔雀石綠熒光強度的原理，建立了一種快速、簡便、高效的養(yǎng)殖水體中MG的快速檢測方法。該方法基本無需前處理，且操作過程簡單快捷，檢測周期非常短，穩(wěn)定性好，抗干擾性強，可應用于養(yǎng)殖水體MG快速檢測，對篩查MG具有現(xiàn)實意義。