王 斌,張 遜

(1.天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床學(xué)院 300140;2.天津胸科醫(yī)院 300095)

空通氣孔同源框2(empty spiracles homeobox 2,EMX2)是人類與果蠅ems(empty spiracles)的同源結(jié)構(gòu)域基因,含同源轉(zhuǎn)錄因子[1]。EMX2作為抑癌基因在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，與腫瘤患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有密切關(guān)系[2]。目前研究已經(jīng)證實(shí)，腺癌A549細(xì)胞與肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。因此,在本研究以腺癌A549細(xì)胞系為研究對(duì)象,利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),使腺癌細(xì)胞系中EMX2基因過(guò)表達(dá)，觀察其對(duì)A549細(xì)胞的增殖及浸潤(rùn)影響,為臨床治療非小細(xì)胞肺癌提供一種新的途徑。

1 材料與方法

1．1材料 腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，EMX2過(guò)表達(dá)慢病毒載體由北京合生基因科技有限公司合成并構(gòu)建。

1.2方法

1.2.1慢病毒轉(zhuǎn)染 過(guò)表達(dá)慢病毒載體購(gòu)自北京合生基因科技有限公司，轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。β-actin：上游引物5′-ACC ACA GCT GAG AGG GAA ATC G-3′，下游引物5′-AGA GGT CTT TAC GGA TGT CAA CG-3′；EMX2：上游引物5′-GTC CCA GCT TTT AAG GCT AGA-3′，下游引物5′-CTT TTG CCT TTT GAA TTT CGT TC-3′。反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣重復(fù)3次。

1.2.3Western blot檢測(cè) 處理細(xì)胞，進(jìn)行蛋白提取，定量后十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫印記，最后化學(xué)顯影、定影。結(jié)果分析以目標(biāo)條帶IOD值與β-actin IOD值的比作為蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.2.4細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞常規(guī)消化、重懸，將細(xì)胞懸液接種至96孔板中，在96孔板中分別處理3組細(xì)胞，干擾組和對(duì)照組均設(shè)置 6 個(gè)平行孔；24 h后取出其中一塊96孔板，小心移除培養(yǎng)基，在待檢測(cè)的樣品中加入5 mg/mL MTT液體,于 4 h 之后終止細(xì)胞培養(yǎng)；移除各孔內(nèi)的上清液，在孔內(nèi)分別加入二甲基亞砜150 μL,將96孔板置于電動(dòng)搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解; 使用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm 處各孔的光密度(OD)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞培養(yǎng)處理24 h，收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/mL；將無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋好的Matrigel膠80 μL 加入到Transwell小室，37 ℃平衡過(guò)夜；下室中加入含20% FBS的1640培養(yǎng)基500 μL，上室中加入150 μL制備好的細(xì)胞懸液，在37 ℃ 5%CO2孵育24 h后,取出小室,用棉簽擦去上室的細(xì)胞,4%多聚甲酸固定15 min,PBS洗滌1次,結(jié)晶紫染色10 min,PBS洗滌1次;高倍顯微鏡下選取并計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)視野,計(jì)算穿過(guò)小孔的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1熒光定量PCR檢測(cè)EMX2 mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染后24 h，干擾組、未干擾組及陰性對(duì)照組的EMX2 mRNA表達(dá)量分別為10.47±0.21、0.75±0.12、1.02±0.09。干擾組A549細(xì)胞中EMX2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，其余兩組EMX2 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2Western blot檢測(cè)EMX2蛋白表達(dá) 干擾組、未干擾組及陰性對(duì)照組的EMX2 蛋白表達(dá)分別為0.97±0.13、0.24±0.11和0.32±0.09。經(jīng)過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞EMX2的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(F=127.67，P=0.000)，未干擾組和陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)EMX2 蛋白在各組中的表達(dá)量

2.3過(guò)表達(dá) EMX2對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染24 h，3組細(xì)胞OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.306,P=0.595)。轉(zhuǎn)染后48 h開始,干擾組A549細(xì)胞的OD值明顯低于未干擾組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，未干擾組和陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染后48 h，干擾組A549細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，其余兩組未受到抑制，見圖2。轉(zhuǎn)染后24 h,干擾組A549細(xì)胞抑制率維持在一個(gè)較低水平上，48 h抑制率明顯上升達(dá)到39.66%，72 h達(dá)到新高度52.31%，見圖3。

圖2 不同時(shí)間各組的OD值

圖3 干擾組不同時(shí)間抑制率

2.4過(guò)表達(dá)EMX2對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響 干擾組、未干擾組及陰性對(duì)照組的A549細(xì)胞遷移數(shù)分別為19.23±3.89、47.24±4.11、43.57±2.09，干擾組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯低于陰性對(duì)照組和未干擾組(F=68.57，P=0.000)，陰性對(duì)照組和未干擾組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

肺癌是全球廣泛存在的最常見的一種癌癥，是導(dǎo)致與癌癥相關(guān)死亡的直接原因[4]。非小細(xì)胞肺癌占肺癌病理類型的80%，已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病[5]。盡管肺癌治療方法取得了巨大進(jìn)步，但其5年生存率僅有16%，在5年內(nèi)估計(jì)有35%～50%的早期非小細(xì)胞肺癌患者死亡[6]。而EMX2屬于同源盒基因(HOX)，是一種多基因家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因[7]，通過(guò)與DNA結(jié)合激活或抑制目的基因[8]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可以通過(guò)調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育和分化、細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮重要的作用[9-11]。LI等[12]研究發(fā)現(xiàn),EMX2是一種腫瘤抑制基因,在胃癌腫瘤組織中其蛋白表達(dá)明顯降低,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上調(diào)EMX2表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。OKAMOTO等[13]的研究表明,肺腺癌患者EMX2表達(dá)下調(diào)。EMX2 mRNA低表達(dá)與肺腺癌患者總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率下降明顯相關(guān)[14]。ZHANG等[15]發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)EMX2能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使EMX2在肺癌 A549 細(xì)胞中出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，細(xì)胞的增殖和侵襲能力研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染處理的A549細(xì)胞EMX2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而未干擾組和陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干擾組細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.05)，而未干擾組和陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干擾組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯低于陰性對(duì)照組和未干擾組(P<0.05)，其余兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)EMX2能夠明顯抑制肺癌A549細(xì)胞的遷移，減少惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，提高生存率，這可能成為治療非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)新的靶點(diǎn)。但本研究存在一定的局限性，其只在細(xì)胞系中得到了驗(yàn)證，體外環(huán)境和機(jī)體內(nèi)部生理環(huán)境不完全一致，后續(xù)研究將在動(dòng)物體內(nèi)研究EMX2基因在成瘤實(shí)驗(yàn)中的作用，探討EMX2抑癌的具體機(jī)制、分子基礎(chǔ)、調(diào)控靶點(diǎn)，為將來(lái)臨床肺癌的診斷、治療提供依據(jù)。