白國輝 曾鳳嬌 于航 陳靖 田源

【摘要】應用堿裂解法原理大量提取大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA，對質(zhì)粒提取試劑盒的相關步驟進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示按優(yōu)化的步驟該方法提取的質(zhì)粒DNA濃度高、質(zhì)量好，能夠符合后續(xù)酶切等常規(guī)實驗的要求。

【關鍵詞】質(zhì)粒DNA;堿裂解法;大腸桿菌

質(zhì)粒是閉合環(huán)狀的DNA分子，存在于細菌、酵母菌和放線菌等生物的染色體并表達所攜帶的遺傳信息，常被用做基因工程中的載體。在質(zhì)粒中插入目的基因片段，構(gòu)成重組質(zhì)?；蚍Q重組體，然后將重新構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)過電擊法、CaCl2等化學試劑法處理轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入受體細菌（如大腸桿菌）中，使目的基因在受體菌中得以繁殖或表達。通過對試劑盒提取質(zhì)粒的步驟中進行優(yōu)化，經(jīng)過DNA濃度測量發(fā)現(xiàn)以優(yōu)化步驟提取的質(zhì)粒DNA質(zhì)量和純度較對照組更好，能更好地滿足后續(xù)實驗要求。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒

重組質(zhì)粒pVAXl-HA2-FimA/IL-15、pVAXl-HA2/IL一15由課組前期構(gòu)建保存，（Escheriehia c0li，E.c0li）JMl09由遵義醫(yī)學院口腔重點實驗室提供。

1.1.2主要試劑

金牌超量無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司;卡那霉素購自北京索萊寶公司;DNAMarkerDL2，000購自大連TakaRa生物工程公司;DNAMarker 5000bp購自北京bi0med公司。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒DNA的提取

對照組按照康維世紀生物科技有限公司試劑盒步驟進行。

實驗組基于試劑盒步驟優(yōu)化如下：

（1）挑單菌落于帶有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌過夜，至0D600值為0.6。取150ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12000Xg離心3分鐘收集細菌。

（2）向留有菌體沉淀的離心管中加入12ml Buffer P1，使用移液器或渦旋振蕩器充分混勻，懸浮細菌沉淀。

（3）向離心管中加入12ml BufferP2，溫和地上下顛倒混勻10次，使菌體充分裂解，室溫放置5分鐘。

（4）向離心管中加入12ml BufferE3，立即上下顛倒混勻10次，避免產(chǎn)生局部沉淀。此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室溫放置5分鐘。12000Xg離心10分鐘，用移液器去除大部分沉淀后，將上清全部倒入除內(nèi)毒素過濾器中，慢慢推動推柄過濾，濾液收集在干凈的50ml離心管中。

（5）向濾液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇和0.1倍濾液體積的醋酸鈉，上下倒混勻。

（6）向己裝入收集管中的處理后的吸附柱中加入2mlBufferPs，12000xg離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

（7）將步驟5中濾液、異丙醇和醋酸鈉的混合溶液轉(zhuǎn)移到平衡好的吸附柱中。

（8）12000Xg離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

（9）向吸附柱中加入10ml BufferPW，12000xg離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。

（10）重復步驟9。

（11）將吸附柱重新放回收集管中，12000Xg離心5分鐘，將吸附膜上液體離心干凈，空離一次，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫10分鐘。

（12）將吸附柱置于一個新的離心管中，向吸附膜的中間部位加入lmlEndo-freeBufferEB，室溫放置10分鐘，12000Xg離心5分鐘，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，重復離心兩次。-20°C保存質(zhì)粒。

1.為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液新加入到吸附柱中，室溫放置5分鐘12000Xg離心5分鐘，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。 2.質(zhì)粒貝數(shù)較低或>10kb時，Endo-fleeBufferEB在65-70°C水浴預熱，可以增加提取效率。1.2.2質(zhì)粒DNA濃度檢測

應用超微量核酸蛋白測定儀對實驗組及對照組提取的大腸桿菌質(zhì)粒DNA濃度檢測。1.2.3質(zhì)粒DNA的酶切實驗

重組質(zhì)粒pVAXl-HA2-FimA、pVAXl-HA2-FimA/IL-15經(jīng)Xho I/Nhe I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳100v，1h，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，記錄結(jié)果。2結(jié)果

對同一培養(yǎng)液中的菌體，分別用上述不同的方法提取質(zhì)粒，經(jīng)超微量核酸蛋白測定儀進行質(zhì)粒濃度檢測，結(jié)果明顯看到，應用優(yōu)化步驟提取的質(zhì)粒比較純且濃度較高（見表1）。質(zhì)粒的酶切鑒定：可見2.2kb（pVAXl-HA2-FimA， 圖1）、3.2 kb（pVAXl-HA2-FimA/IL-15，圖2）的基因片段，酶切效果非常理想，切出的條帶大小吻合，而且沒有雜帶的出現(xiàn)，與預計相同。3討論

質(zhì)粒提取是基因工程的基礎，所有提取質(zhì)粒DNA的方法基本都包括培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增;收集和裂解細菌;分離和純化質(zhì)粒DNA 3個步驟。目前關于質(zhì)粒提取的方法主要有堿裂解法、煮沸法、牙簽法等，其中運用較為廣泛的是堿裂解法。染色體DNA與質(zhì)粒DNA在變性和復性存在著差異，堿裂解法是基于而達到分離質(zhì)粒DNA的目的。質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒是基于堿裂解法裂解細胞的基礎上采用獨特的硅基質(zhì)膜吸附技術，高效專一的結(jié)合質(zhì)粒DNA，同時采用特殊的緩沖液系統(tǒng)和除內(nèi)毒素過濾器，有效去除內(nèi)毒素、基因組DNA、RNA、蛋白等雜質(zhì)，提取效果好，本實驗對試劑盒中質(zhì)粒提取步驟進行優(yōu)化，獲得更高效率的質(zhì)粒提取率，有利于減少實驗成本。

（通訊作者;田源）