食品中黃曲霉毒素B₁檢測(cè)方法研究

張宏博 靳志敏 高智慧 鄭玉山

摘 要：黃曲霉毒素（AF）是廣泛存在于自然界中的真菌毒素，而在所有的真菌毒素中，AFB1的毒性、致癌性較大，其能阻止蛋白、酶和凝血因子合成，又能抑制葡萄糖、脂肪酸、代謝產(chǎn)物的合成，從而引起免疫抑制、脂肪退化和DNA損傷。AFB1的檢測(cè)方法大致分為化學(xué)分析法、生物鑒定法、儀器分析法三大類(lèi)，本文主要對(duì)運(yùn)用較為廣泛的TLC（薄層層析）、HPLC（高效液相色譜）、GICA（膠體金標(biāo)免疫層析分析法）、ELISA（酶聯(lián)免疫法）檢測(cè)方法進(jìn)行論述。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素? 毒性? 致癌性? 檢測(cè)方法

1 黃曲霉毒素概況及其發(fā)病機(jī)理

黃曲霉毒素（AF）主要成分是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）產(chǎn)生的有毒性的次生代謝產(chǎn)物，屬于真菌毒素，廣泛存在于自然界中[1，2]。黃曲霉毒素由大約18種化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的衍生物組成，包括B和G兩大類(lèi)，植物性食物中產(chǎn)生B1、B2、G1和G2[3]，而乳或乳制品（包括乳酪、奶粉等）中產(chǎn)生M1、M2。黃曲霉毒素B1在植物性食物衍生組中毒性最強(qiáng)，其慢性毒性甚至可誘發(fā)肝癌。

AF需要在機(jī)體內(nèi)代謝活化才能表現(xiàn)出毒性。首先，細(xì)胞內(nèi)的多功能氧化酶將AF催化成環(huán)氧化物;然后，環(huán)氧化物與大分子反應(yīng)生成DNA、RNA、蛋白質(zhì)和類(lèi)脂的結(jié)合物，并表現(xiàn)出兩種毒性——急性毒性和慢性毒性，分別表現(xiàn)為AF與蛋白質(zhì)（包括酶）、類(lèi)脂的反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，與核酸的反應(yīng)可導(dǎo)致突變。研究表明，在所有真菌毒素中，AFB1的毒性、致癌性最大——能阻止蛋白、酶和凝血因子合成，又能抑制葡萄糖、脂肪酸、代謝產(chǎn)物的合成，從而導(dǎo)致免疫抑制、脂肪退化和DNA損傷[4]。

AFB1在動(dòng)物體中的急性毒性如表1所示，其毒性因動(dòng)物年齡、種類(lèi)、性別而異[5]。一般來(lái)說(shuō)，幼年動(dòng)物對(duì)AFB1的敏感性要大于成年動(dòng)物，雄性動(dòng)物的敏感性要大于雌性動(dòng)物。研究表明，當(dāng)豬飼料中AFB1的含量達(dá)到810ppm時(shí)，飼料的轉(zhuǎn)化率下降，豬的體重也明顯下降，甚至?xí)霈F(xiàn)死亡，解剖發(fā)現(xiàn)其肝臟出現(xiàn)退行性變化，肝細(xì)胞大面積壞死。AF除了會(huì)對(duì)大鼠引起肝癌外，還會(huì)使大鼠患上胃癌、結(jié)腸癌和腎臟上皮癌[6]。

人體攝入被AF污染的食物后經(jīng)消化道吸收，其大部分積累在肝臟，少部分分布在腎臟、血液和肌肉中，在機(jī)體內(nèi)通過(guò)羥基化、去甲基化和環(huán)氧化等作用形成代謝產(chǎn)物使機(jī)體致癌、致突變。研究表明，AF的LD50（半數(shù)動(dòng)物致死量）為0.249mg/kg，毒性比氰化鉀高10倍[7]。AFB1在人體內(nèi)的危害表現(xiàn)為急性毒性和慢性毒性，急性毒性在人體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死、膽管上皮細(xì)胞增生、肝脂肪浸潤(rùn)及肝出血等[8]，前期癥狀為發(fā)燒、嘔吐、黃疸，繼而出現(xiàn)腹水和下肢浮腫，最終可導(dǎo)致死亡。AFB1是一種能導(dǎo)致人體遺傳物質(zhì)發(fā)生變化的致突變化合物，其在人體的代謝產(chǎn)物有致突變作用，包括AFB1-2，3-環(huán)氧化物、AFM1和AFP1等，其中AFB1-2，3-環(huán)氧化物的第2個(gè)碳與DNA的鳥(niǎo)嘌呤酮基結(jié)合形成AFB1-DNA加合物，去嘌呤反應(yīng)通過(guò)形成AFB1-N7-鳥(niǎo)嘌呤，使DNA分子產(chǎn)生無(wú)嘌呤位置的缺口，從而造成DNA損傷，進(jìn)而可能導(dǎo)致癌變。致癌性表現(xiàn)為AFB1可引起細(xì)胞錯(cuò)誤地修復(fù)DNA，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA誘變，并進(jìn)一步抑制DNA和RNA的合成，最終抑制蛋白質(zhì)的合成及基因變化積累[9，10]。目前，科學(xué)家已證實(shí)p53基因是癌癥的抑制基因，很多人可能在幼年時(shí)就受到AFB1的攻擊，加之人體內(nèi)特定基因的缺失或變異引起p53基因突變，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生癌變[11]。

由于A(yíng)FB1具有危害性和廣泛性，人們需要有效的檢測(cè)方法測(cè)定其在食品中的含量，確保對(duì)人和家畜的傷害降到最低。目前檢測(cè)AFB1的方法很多，但主要分為三大類(lèi)：化學(xué)分析法、生物鑒定法、儀器分析法[12-14]，其中有4種方法的運(yùn)用較為廣泛，即TLC（薄層層析）、HPLC（高效液相色譜）、GICA（膠體金標(biāo)免疫層析分析法）、ELISA（酶聯(lián)免疫法）。

2 食品中AFB1的幾種檢測(cè)方法

2.1 薄層層析法（TLC）

AF是低分子量極性化合物，它的特點(diǎn)是可以吸收紫外光，利用這一特點(diǎn)衍生了多種測(cè)定AF的方法，而薄層層析方法是最早被運(yùn)用的方法。薄層層析法（TLC）同時(shí)具有定性和定量的分析功能，所以被美國(guó)官方確定為標(biāo)準(zhǔn)方法，我國(guó)也在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中將其確立為仲裁法[15]。TLC的原理是利用AFB1在365nm紫外波長(zhǎng)下會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光的特點(diǎn)，再經(jīng)過(guò)固相層分離后，對(duì)其熒光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，并且與標(biāo)準(zhǔn)液相比，最終得出結(jié)果。這種方法不需要專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備，成本低，實(shí)驗(yàn)室大都能完成對(duì)AF的測(cè)定。但是，最原始的薄層分析由于分辨率不穩(wěn)定，受周?chē)蛩氐挠绊懞艽?，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，差異性較大。同時(shí)，該方法的工作量比較復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，且在做定量分析時(shí)精確度較低?，F(xiàn)如今，隨著科技的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了很多固相吸附材料，可以使薄層層析的準(zhǔn)確度得到提升，其精確度甚至可以與高效液相色譜相較量。張慧麗等通過(guò)用黃曲霉菌株接種18種花生仁，利用半定量薄層層析法和精確定量高效液相色譜法檢測(cè)到的AF質(zhì)量濃度確定花生的抗AF合成的能力，鑒定出2個(gè)高抗黃曲霉感染和AF質(zhì)量濃度低的花生品種[16]。

2.2 高效液相色譜（HPLC）

1986年，AOAC International首次將高效液相色譜法（HPLC）作為檢測(cè)乳液中AFM1及AFM2公認(rèn)的方法[17]，也是國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)認(rèn)為檢測(cè)AF最權(quán)威的一種方法，其具有分析自動(dòng)化的潛力，且具備靈敏度高、精確度高等優(yōu)點(diǎn)[18]。但是，HPLC對(duì)樣品的純度要求很高，必要時(shí)需將原料進(jìn)行衍生才能使用這種方法。經(jīng)長(zhǎng)期研究實(shí)踐，研究人員總結(jié)出一些使用該方法的技巧。AF的熒光特性受流動(dòng)相中的液體影響較大，只能檢測(cè)到1～2種AF，有的甚至?xí)l(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，所以在測(cè)定時(shí)要同時(shí)運(yùn)用紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器才能將試樣中的AF檢測(cè)完全。此外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也對(duì)高效液相色譜法測(cè)定AF進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。陸勤佳等人基于高效液相色譜熒光法設(shè)計(jì)并完成了一套由分離系統(tǒng)、恒溫控制系統(tǒng)、熒光檢測(cè)器、主控板和人機(jī)交互界面組成的AF檢測(cè)系統(tǒng)，并且經(jīng)過(guò)測(cè)試，表明該AF檢測(cè)系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性——結(jié)構(gòu)緊湊、檢測(cè)速度快且靈敏度高，能用于A(yíng)F的實(shí)際檢測(cè)[19]。王勇建立AFB1的柱前衍生-高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)方法，該方法具有良好的準(zhǔn)確性、靈敏性和重復(fù)性，可對(duì)組織樣品中AFB1殘留量進(jìn)行快速準(zhǔn)確分析，為AFB1在食品中的快速檢測(cè)奠定基礎(chǔ)[20]。Beaver R、Klaus R等研究發(fā)現(xiàn)，在柱后衍生時(shí)向其中加入碘，會(huì)增強(qiáng)AFB1的熒光度——是之前的25倍，該方法已經(jīng)被運(yùn)用到花生制品AFB1的含量檢測(cè)中[21，22];該方法需要使用的儀器非常昂貴，一般在進(jìn)出口檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室使用。羅朝權(quán)等為建立一種快速檢測(cè)動(dòng)物類(lèi)藥材污染AFB1（AFB1）和AFG1（AFG1）的液質(zhì)聯(lián)用法，并用于水蛭等6種動(dòng)物類(lèi)中藥材污染情況的分析，結(jié)果表明，土鱉蟲(chóng)等動(dòng)物類(lèi)藥材受AF污染的情況較為嚴(yán)重[23]。

2.3 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

酶聯(lián)免疫法在1971年以后開(kāi)始被運(yùn)用到實(shí)驗(yàn)中，成為檢測(cè)食品中AFB1最簡(jiǎn)單、方便的方法之一。ELISA的原理是利用抗原與抗體之間的高度特異性和酶的高效催化性，抗原或抗體與某種載體結(jié)合，在檢測(cè)時(shí)樣品中的酶標(biāo)抗原抗體與載體上的抗原或抗體會(huì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生抗原抗體的復(fù)合物，通過(guò)添加酶使產(chǎn)生的物質(zhì)快速顯現(xiàn)顏色，且AF的含量越高，底物的顏色越淺，從而達(dá)到檢測(cè)的目的，是一種可以定性定量分析的方法[24，25]。該方法的關(guān)鍵點(diǎn)首先是抗原或抗體在檢測(cè)的過(guò)程中要一直保持活性，并且還可以與載體相結(jié)合;其次是酶在檢測(cè)的過(guò)程中要始終保持活性，即使是與抗原或抗體結(jié)合后，仍能發(fā)揮出酶的催化作用，但這種酶容易受溫度等多種因素的影響，所以一般將其在低溫下保存。常用的ELISA有直接法、間接法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、抑制性測(cè)定法等[26，27]。胡竹行等研究了酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大曲中AFB1的提取條件，結(jié)果表明，在甲醇濃度為55%（v/v）、提取時(shí)間為25min、功率為200W時(shí)，其提取率明顯高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[28]。當(dāng)前，為了更加方便而利用ELISA研發(fā)出酶聯(lián)免疫法分析試紙盒，并且已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，為人們的生活提供便利。酶聯(lián)免疫法分析試紙盒沒(méi)有改變?cè)?，且檢測(cè)的準(zhǔn)確性十分可靠，該方法目前被廣泛用于飼料原料中檢測(cè)AFB1的含量。李江等用酶聯(lián)免疫法對(duì)食用油中AFB1的測(cè)定結(jié)果與液相法比較，符合率高，能夠用于食用油中AFB1的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)[29]。

2.4 膠體金標(biāo)免疫層析分析法（GICA）

納米金是直徑1～100nm的金微小粒子，是一種帶負(fù)電的疏水膠體。膠體金標(biāo)免疫層析分析法就是利用納米金作為標(biāo)記底物，所需檢測(cè)時(shí)間較短，可直接讀取檢測(cè)數(shù)值，且該方法不需要對(duì)試樣進(jìn)行分離提純處理，也不用對(duì)檢測(cè)溶劑做處理，操作起來(lái)簡(jiǎn)便且高效[30]，是目前最簡(jiǎn)單、最快速的檢測(cè)方法之一。GICA會(huì)使試樣中的AF與偶聯(lián)膠體金的抗AF抗體相結(jié)合，無(wú)論是結(jié)合的還是非結(jié)合的抗體都會(huì)沿著膜的移動(dòng)，通過(guò)固定化的真菌毒素組成的檢測(cè)線(xiàn)，它將結(jié)合游離的抗體，以形成可見(jiàn)的線(xiàn)，以此來(lái)表示AF的污染低于試驗(yàn)的閾值[31]。人們對(duì)于納米金的研究已經(jīng)有很長(zhǎng)的時(shí)間，并在多個(gè)領(lǐng)域得到運(yùn)用。宋青龍等用膠體金免疫層析技術(shù)，結(jié)合膠體金定量讀數(shù)儀研制出一種檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好，樣品檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)誤差在20%以?xún)?nèi)，快速定量檢測(cè)谷物和飼料中AFB1含量的膠體金快速定量檢測(cè)試劑盒[32]。劉曉玥等通過(guò)用膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)飼料樣品的檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，膠體金免疫層析試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法相符率可達(dá)95%以上，說(shuō)明該方法操作簡(jiǎn)單、快速、方便，可以應(yīng)用于谷物及飼料產(chǎn)品AFB1現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[33]。

3 小結(jié)

AF是廣泛存在于自然界中的真菌毒素，運(yùn)用較為廣泛的檢測(cè)方法有4種——薄層層析法是最早被運(yùn)用的方法，該方法同時(shí)具有定性和定量的分析功能，但隨著科技的發(fā)展迅速，如今出現(xiàn)了很多固相吸附材料，使薄層層析的準(zhǔn)確度也隨之上升，其精確度甚至可以與高效液相色譜相較量;高效液相色譜法對(duì)樣品的純度要求很高，但具有分析自動(dòng)化的潛力，以及靈敏度高、精確度高等優(yōu)點(diǎn);酶聯(lián)免疫法的特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便及無(wú)污染;而在熒光素、酶、同位素及乳膠標(biāo)記技術(shù)之后，納米金已經(jīng)成為的一種新型標(biāo)記技術(shù)[34]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳寧慶.實(shí)用生物毒素學(xué)[M].北京：中國(guó)科技出版社，2001：251-275.

[2] 夏世鈞，吳中亮.分子毒理學(xué)基礎(chǔ)[M].湖北：科學(xué)技術(shù)出版社，2001：170-175.

[3] 王瑞鑫，張微，李書(shū)國(guó).免疫傳感器在糧油中真菌毒素快速檢測(cè)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].糧油食品科技，2015，23（04）：83-87.

[4] Denissenko M F， Cahill J， Koudriakova T B， et al. Quantitation and mapping of aflatoxin B1-induced DNA damage in genomic DNA using aflatoxin B1-8，9-epoxide and microsomal activation systems[J].Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，1999，425（2）： 205-211.

[5] 任志.禽黃曲霉菌素中毒的診斷及防治[J].家禽科學(xué)，2015（11）：60.

[6] 王鳳榮，張祥宏，張振東，等.真菌及其毒素誘發(fā)肺癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）.2003，1（35）：1-8.

[7] 李金.有害物質(zhì)及其檢測(cè)[M].北京：中國(guó)石化出版社，2001：94-100.

[8] 吳丹.黃曲霉毒素在糧食和食品中的危害及防治[J].糧食加工，2007，32（03）：91-94.

[9] CHAN K T，DENNIS P H，MARIA L L，et al.In vitro aflatoxin B1 induced p53 mutations[J].Canc Let，2003，199（1）：1-7.

[10] PAUL C T，ABDOULAYE S，KUANG S K，et al.Absence of p53 Codon 249 mutations in young guinean children with high Aflatoxin exposure[J].Canc Epid Bio &Pre，2005，14：2053-2055.

[11] 許真，金銀龍.環(huán)境致癌劑與p53基因突變[J].衛(wèi)生研究，2004.33（2）：239-243.

[12] 王叔淳.食品中黃曲霉毒素M1、B1的測(cè)定[M].食品衛(wèi)生檢驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1994，251-252.

[13] 李明元.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法.食品衛(wèi)生理化檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1998：292-293.

[14] 揚(yáng)兆祿.色譜[J].1991，9（3）：54.

[15] 楊惠芬.食品中黃曲霉毒素B，的薄層色譜法[J].食品衛(wèi)生理化檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè).化學(xué)工業(yè)出版社.1998：272-274.

[16] 張慧麗，楊松，蘇君偉，于洪波，徐文杰，張麗男，姜忠良，孟憲軍.黃曲霉菌感染花生的不同檢測(cè)方法的應(yīng)用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，32（08）：868-874.

[17] Tabata S. Kamimura H.AFM] and M2-high performance liquid chromatography （HPLC） in milk.AOAC[M]. 1986.26.83-87.

[18] 王培之，徐克沂，皮國(guó)華.膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2000，23（5）：308-309.

[19]陸勤佳，蔡強(qiáng)，沈國(guó)金，王振華.黃曲霉毒素檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[J].電子器件，2017，40（03）：748-753.

[20]王勇.黃曲霉毒素B1柱前衍生-高效液相色譜法檢測(cè)方法的建立[J].大眾標(biāo)準(zhǔn)化，2017（06）：45-47.

[21] Beaver R.W，Wilson D.M. Comparison of postcollumn derivatization liquid chromatography with thin-layer chromatography for determination of aflatoxins in naturally contaminated corn [J]. AOAC . Int， 1990.73（4）：579～581.

[22] Klaus R. Wolfgang M.F Determination of aflatoxins in medical herbs and plant extracts[J].Journal of chromatography A.1995，692，131-136.

[23]羅朝權(quán)，張敏玲，鄭潤(rùn)生，蔡曉吟，徐暉，贠小蕓，覃嘉良.6種動(dòng)物類(lèi)藥材中黃曲霉毒素污染的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（03）：67-71.

[24] S D Holladay.間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)黃曲霉毒素抗體的評(píng)價(jià)[J].貴州畜牧獸醫(yī)，1993，17（1）：46-47.

[25]趙曉聯(lián)，趙春城，鈕偉民，等.酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定黃曲霉毒素B1誤差分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2001，11（4）;473-474.

[26]周先碗，胡曉倩.生物化學(xué)儀器分析與實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

[27]陳建偉. 玉米中黃曲霉毒素的ELISA測(cè)定方法研究.

[28]胡竹行，沈才洪，敖宗華，王松濤，周軍，曾娜，丁海龍，張強(qiáng).大曲中黃曲霉毒素B1提取方法的研究[J].釀酒科技，2014（02）：27-29.

[29]李江，綦艷，佘之蘊(yùn)，廖桂福，陳滿(mǎn)英.酶聯(lián)免疫法對(duì)食用油中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)[J].廣東化工，2017，44（11）：73-74.

[30] 鄧瑞廣，孫開(kāi)冬，慕桂香，等.膠體金免疫層析法檢測(cè)豬旋毛蟲(chóng)病試驗(yàn)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，4：97-99.

[31] 王巖.黃曲霉毒素M1化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法的研究[D].哈爾濱長(zhǎng)春理工大學(xué)，2013.

[32]宋青龍，李成洪，傅巍，唐紅梅，楊春柳，譙仕彥.黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測(cè)試劑盒的研發(fā)[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2017，29（10）：3703-3709.

[33]劉曉玥，侯亞楠，呂麗卿.飼料中黃曲霉毒素B1快速篩查膠體金免疫層析檢測(cè)方法應(yīng)用研究[J].吉林農(nóng)業(yè)，2017（18）：64-65.

[34] Osikowicz G，Begge M.One-step chromatographic immunoassay for qualitative.