H9亞型禽流感病毒毒種保存期試驗

梁宛楠

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

禽流感（AI）又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟，是由正黏病毒科、流感病毒屬A型流感病毒引起的一種急性、敗血型傳染病，幾乎所有野生及家養(yǎng)禽類均可感染。根據(jù)禽流感致病性的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感和低致病性禽流感[1]。

本試驗將H9禽流病毒TJ株檢驗和基礎(chǔ)種子批凍干毒存放于-70℃保存，并于不同的保存時間抽樣隨機(jī)抽樣，進(jìn)行病毒含量測定、血凝價測定、毒力測定和無菌檢驗，確定凍干毒種-70℃條件下的保存期；將檢驗和生產(chǎn)種子批濕毒存放于-20℃保存，并于保存后不同時間隨機(jī)取出，進(jìn)行病毒含量測定、血凝價測定、毒力測定和無菌檢驗，確定濕毒-20℃條件下的保存期。

1 試驗材料

1.1 毒種

毒種信息見表1。

表1 毒種信息

1.2 檢驗用培養(yǎng)基

無菌檢驗用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪胨瓊脂（G.A）和葡萄糖蛋白胨（G.P），由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備；支原體檢驗用Frey氏培養(yǎng)基，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 SPF雞及SPF雞胚

由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司五常SPF雞場提供。

2 試驗方法

將檢驗和基礎(chǔ)種子批凍干毒存放于-70℃保存，并于保存當(dāng)日和保存后3、6、9、12、18和24個月，隨機(jī)抽樣，分別進(jìn)行病毒含量測定、血凝價測定、對雞毒力測定和無菌檢驗，確定凍干毒種-70℃條件下的保存期；將檢驗和生產(chǎn)種子批濕毒存放于-20℃保存，并于保存后3、6、9和12個月隨機(jī)取出，進(jìn)行病毒含量測定、血凝價測定、毒力測定和無菌檢驗。

2.1 病毒含量測定

將毒種用生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-7、10-8、10-93個稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL，置37℃繼續(xù)孵育，24 h以前死亡的雞胚棄去不計，在24～96 h死亡的雞胚隨時取出，至96 h，取出所有活胚，分別收獲雞胚液，測定雞胚液HA效價，HA效價≥1∶16（微量法）者判為感染，按Reed-Muench法計算EID50。

2.2 紅細(xì)胞凝集效價

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定。

2.3 對雞的毒力

將毒種用生理鹽水稀釋至107.0EID50/0.1 mL，靜脈注射42和56日齡SPF雞各5只，0.1 mL·只-1。攻毒后第5天，采集每只雞的泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離。將每只雞的樣品經(jīng)尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5枚。孵育觀察5 d，無論死胚、活胚均應(yīng)測定雞胚液血凝價，以5枚雞胚中至少有1枚雞胚的雞胚液血凝價不低于1∶16（微量法）判為病毒分離陽性。對病毒分離為陰性的樣品，應(yīng)盲傳1次，再次測定HA價。記錄結(jié)果。

2.4 無菌檢驗

按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗。

3 試驗結(jié)果

3.1 凍干毒種保存期試驗結(jié)果

不同保存時間凍干毒種病毒含量及血凝價測定、雞毒力試驗、無菌檢驗結(jié)果見表2～4。

從表2～4結(jié)果可以看出，檢驗種子和基礎(chǔ)種子批凍干毒種于-70℃保存24個月，病毒含量和血凝價與保存當(dāng)日無明顯差異，無細(xì)菌和霉菌污染；檢驗用凍干強(qiáng)毒種于-70℃保存24個月與保存當(dāng)日均可致42和56日齡雞感染；無細(xì)菌和霉菌污染。

3.2 濕毒保存期試驗結(jié)果

不同保存時間檢驗和生產(chǎn)毒種濕毒病毒含量測定結(jié)果見表5。

表2 病毒含量及血凝價測定結(jié)果

表3 對雞毒力量測定結(jié)果

續(xù)表

表4 無菌檢驗結(jié)果

續(xù)表

由表5可知，檢驗和生產(chǎn)種子批濕毒于-20℃保存9個月，病毒含量與保存當(dāng)日無明顯差異，保存12個月病毒含量下降1個滴度以上，血凝價為1∶128。

不同保存時間檢驗用濕毒種對雞毒力試驗結(jié)果見表6。

由表6可知，檢驗種子批濕毒于-20℃保存9個月與保存當(dāng)日均可致42和56日齡雞5/5感染，保存12個月僅可致42和56日齡2/5～3/5感染。

不同保存時間毒種濕毒無菌檢驗測定結(jié)果見表7。

由表7可知，檢驗和生產(chǎn)種子批濕毒于-20℃保存12個月與保存當(dāng)日均無細(xì)菌、霉菌污染。

表5 病毒含量及血凝價測定結(jié)果

表6 對雞毒力量測定結(jié)果

表7 濕毒無菌檢驗結(jié)果

4 結(jié)論

4.1 H9亞型禽流感病毒

TJ株檢驗和基礎(chǔ)凍干毒種于-70℃保存24個月，病毒含量、血凝價與保存當(dāng)日無明顯變化，且無細(xì)菌和霉菌污染；檢驗用凍干強(qiáng)毒種對雞的毒力與保存當(dāng)日無顯著差異，無細(xì)菌和霉菌污染。

4.2 H9亞型禽流感病毒

TJ株檢驗和生產(chǎn)種子批濕毒于-20℃保存9個月，病毒含量、對雞的毒力與保存當(dāng)日無明顯差異，無細(xì)菌、霉菌污染；保存12個月病毒含量下降1個滴度以上，檢驗強(qiáng)毒對雞的毒力明顯下降。因此，將H9亞型禽流感病毒TJ株濕毒-20℃保存的有效期定為6個月。