陳超磊，蘆天罡，倪和民，盛熙暉，王相國，齊曉龍，邢凱，劉云海，郭勇

(北京農(nóng)學院動物科學技術學院，北京 102206)

胚胎休眠現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于一些野生哺乳動物中，是指動物交配受精后，受精卵發(fā)育至胚泡階段后游離于著床部位，但不立即發(fā)生著床，而是延緩一定時間后再植入處于容受態(tài)的子宮，繼續(xù)完成其后的著床發(fā)育的現(xiàn)象。由于著床是處于窗口期的胚胎與處于容受態(tài)子宮的相互作用的過程，研究胚胎的休眠現(xiàn)象是研究胚胎著床機理的重要內(nèi)容之一，并可為輔助生殖技術提供必要的參考。目前，對于小鼠休眠胚胎的研究都集中在揭示胚胎休眠現(xiàn)象的分子機理以及與之相關的胚胎著床的分子調(diào)控上，例如張劭俁等[1]對程序化冷凍的小鼠休眠胚胎和正常休眠胚胎進行了基因芯片掃描，結果發(fā)現(xiàn)存在228個差異表達基因，其中50個基因表達上調(diào)，178個基因表達下調(diào)，盧文謹?shù)萚2]研究發(fā)現(xiàn)LYZ1 蛋白在休眠模型小鼠胚胎中為抵御外界不利環(huán)境而上調(diào)；劉迪等[3-4]研究發(fā)現(xiàn)C3，Hba-α基因很可能參與了胚胎抗凍過程的相關調(diào)控等等。但在休眠胚胎應用方面的研究較少。小鼠休眠胚胎是一個很好的研究應用模型。當前，休眠胚胎盡管可以保存一定的時間，但非常有限。而實際生產(chǎn)應用則需要能夠長期保存即冷凍保存，以達到保存的目的。研究休眠胚胎的冷凍效果是休眠胚胎研究走向應用的重要步驟，可為改進大家畜的輔助胚胎工程技術提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級ICR系小鼠30只，6 ～ 8周齡，體重25 ～ 30 g；雄鼠8周齡以上，體重30 ～ 35 g，動物均購自北京維通利華實驗動物科技有限公司【SCXK(京) 2014-0008】， 實驗操作在北京農(nóng)學院屏障動物實驗室內(nèi)進行【SYXK(京) 2015-0004】。

1.1.2 實驗試劑

甘油(glycerol)，孕酮(progesterone，P4)，牛血清白蛋白(BSA)，抗羊脾細胞抗血清(anti-sheep whole serum)，豚鼠補體(guinea pig complement serum)，碘化丙啶(propidium iodide,PI)，聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)，bisbenzimide(Hoechst33342)，胚胎冷凍液購自ICPbio Reproduction，胎牛血清(FBS)為美國Sigma公司產(chǎn)品，葡萄糖、NaCl等無機試劑均為國產(chǎn)優(yōu)級純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 胚胎的獲取

休眠胚胎的獲取：妊娠小鼠見栓的第4天上午 9：00 時摘除雙側卵巢保留輸卵管，連續(xù)3 d頸部皮下注射 0.1 mL孕酮(0.2 mg/mL)，見栓第8天收集休眠胚胎；孵化期胚胎的獲?。河谝娝ǖ?天12:00時沖出受孕母鼠子宮內(nèi)的胚胎。

1.2.2 冷凍方法

將獲取的胚胎先用PBS (pH7.4)清洗兩遍，然后依次用含1/3的冷凍液，1/2的冷凍液，2/3的冷凍液的PBS清洗，隨后在冷凍液中清洗三遍，然后用0.25 mL的塑料細管按冷凍液(2.5 cm)→空氣(1.0 cm) →冷凍液(2.5 cm)→空氣(1.0 cm)→含有胚胎的冷凍液(3.0 cm)→空氣(1.0 cm)→冷凍液(2.5 cm) → 空氣(1.0 cm)→冷凍液(2.5 cm)制備凍存胚胎細管。提前在冷凍儀內(nèi)放入液氮, 把裝好的細管放入程序冷凍儀中，以1℃/min的速度降到-5℃時，使其在平臺期平衡10 min，然后迅速取出細管并在兩端制冰，再平衡10 min。然后以0.3℃/min的速度直至降到-35℃。隨后置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 解凍與培養(yǎng)方法

從液氮中取出冷凍細管，室溫輕晃動8 s左右，置于35℃水中15 s左右取出，用酒精棉處理細管之后用吸水紙擦干，剪掉細管兩端，沖出胚胎，按三步脫除甘油法脫去冷凍液。胚胎解凍后分別置于小鼠胚胎培養(yǎng)液小滴中，石蠟油覆蓋，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察和記錄各組胚胎發(fā)育情況，顯微照像記錄。

1.2.4 移植方法

首先將假孕母鼠(正常母鼠與結扎公鼠交配)麻醉。于背腰側消毒殺菌后剪開皮層，取出一側子宮，用眼科鑷子夾住子宮與輸卵管的結合部使子宮與鼠體成45度角，另一用4號針頭入子宮腔，上下輕輕移動以確認針頭未扎入子宮腔內(nèi)壁，迅速沿針眼將移植槍扎入將卵吹入子宮內(nèi)。子宮輕推回小鼠體內(nèi)，進行術后縫和，傷口消毒。注意保溫，觀察并記錄出生情況。

1.2.5 雙重熒光染色

(1) 染料準備

染料儲液：1 mg染料+1 mL雙蒸水；染料工作液：4 μL染料儲液+10 μL 95%乙醇+36 μL 2.3%檸檬酸鈉。

(2) 雙重熒光染色步驟

清洗胚胎：首先用含0.1% PVA的PBS清洗胚胎3次，每次間隔3 min，確保清洗干凈無血清殘留；結合抗體：將胚胎放入含抗血清的PBS(5 μL抗血清+25 μL PBS)小滴中反應30 min，使其充分結合抗體；隨后將胚胎用含10% FBS的PBS中處理5 min，以便結束抗體反應；清洗胚胎：用含0.1% PVA的PBS清洗3次；結合補體和染色：將胚胎置于含有補體和兩種染料的PBS(5 μL補體+2 μL PI+2 μL Hoechst 33342+21 μL PBS)小滴中避光反應90 min；壓片與觀察：清洗胚胎，洗掉多余染料和雜質(zhì)。吸出胚胎移至事先做好的載玻片微滴，用凡士林支撐4周，蓋玻片壓片，在熒光顯微鏡下觀察，在藍色濾光片下內(nèi)細胞團呈藍色，滋養(yǎng)層細胞呈粉色。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 胚胎冷凍結果

從表1中可以看出休眠胚胎的回收率極顯著高于孵化期胚胎(72.1% vs 50.2%，P< 0.01)。各組胚胎冷凍后形態(tài)見圖1,2。

2.2 胚胎凍融后體外復蘇培養(yǎng)結

從表2中可以看出休眠胚胎的繼續(xù)發(fā)育率極顯著高于孵化期胚胎(94.2% vs 73.9%，P< 0.01)。各組胚胎培養(yǎng)后形態(tài)見圖3。

組別Groups解凍胚胎數(shù)(枚)No. of thawed embryos回收數(shù)(枚)No. of recovery回收率(%)Recovery rate of embryo形態(tài)完整數(shù)(枚)No. of recovery embryos可用率(%)Available rate of embryo休眠胚胎Dormant embryo36528880.9a26372.1a孵化期胚胎Hatched embryo31923874.6a16050.2b

注：表中同列字母不同表示差異有顯著性(P< 0.05)；字母相同表示差異無顯著性(P>0.05)。(下表同)

Note. Different letters indicate significant differences among them(P< 0.05), the same letters indicate no significant differences among them (P> 0.05).(The same in the following tables)

表2 胚胎凍融培養(yǎng)后發(fā)育率Table 2 Development rates of embryos after frozen-thawing

2.3 胚胎凍融后移植結果

從表3中可以看出休眠胚胎的產(chǎn)子率顯著高于孵化期胚胎的產(chǎn)仔率(40.8% vs 30.1%，P< 0.05)。

2.4 胚胎細胞計數(shù)結果

從表4中可以看出，休眠胚胎的內(nèi)細胞團細胞數(shù)顯著高于孵化期胚胎的(27.83 vs 19.53，P< 0.05)，兩種胚胎的滋養(yǎng)層細胞數(shù)無差異。凍融，培養(yǎng)后休眠胚胎的內(nèi)細胞團數(shù)顯著高于孵化期胚胎的(25.18 vs 14.68，P< 0.05)，滋養(yǎng)層細胞數(shù)也顯著高于孵化期胚胎(114.09 vs 73.88，P< 0.05)。凍融，培養(yǎng)前后休眠胚胎內(nèi)細胞團(ICM)數(shù)和滋養(yǎng)層細胞(TE)數(shù)差異均不顯著，培養(yǎng)后孵化期胚胎的內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞數(shù)都顯著低于冷凍前的。各組胚胎雙重染色照片見圖4。

圖1 小鼠正常胚胎(A)與休眠胚胎(B)(×20)Figure 1 Normal(A) and dormant(B) embryos of mice (×20)

圖3 解凍后培養(yǎng)1 d后的小鼠孵化期胚胎(A)和休眠胚胎(B)(×10)Figure 3 Hatched (A) and dormant(B) embryos at one day after thawing (×10)

圖2 解凍后小鼠孵化(A)和休眠(B)胚胎Figure 2 Hatched (A) and dormant(B) embryos of mice after thawing (×20)

圖4 小鼠孵化胚胎(A)和休眠胚胎(B)雙重染色(×60)Figure 4 Double staining of mouse hatched(A) and dormant(B) embryos(×60)

表3 胚胎凍融后移植產(chǎn)子率Table 3 Procreation rate of mice after embryo transplantation

表4 胚胎凍融前后的細胞數(shù)Table 4 Number of cells in the embryos before and after freeze-thawing

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物大量的胚胎損失發(fā)生在著床前后，因而胚胎著床一直是研究哺乳動物生殖調(diào)控機理的關鍵[5-7]。胚胎在發(fā)育過程中受多種激素、生長因子以及各種酶的影響。20世紀60年代，科學家發(fā)現(xiàn)哺乳動物為了更好地繁衍生息而進化產(chǎn)生胚胎延遲著床現(xiàn)象[8]，胚胎延遲現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及深入研究，不僅有助于人們更為深入的了解胚胎著床過程的分子調(diào)控機制；同時，延遲著床模型的廣泛應用，也提供了一種新的研究著床窗口,分子網(wǎng)絡開啟與關閉的有效手段，對不孕癥的治療、相關藥物的開發(fā)及動物的繁殖成功率的提高等都有重要的現(xiàn)實意義。因此針對哺乳動物的休眠胚胎進行較廣泛的相關生物學研究具有一定的理論意義和潛在應用價值[9-10]。

休眠胚胎和正常孵化期胚胎的回收率均較低，分析其原因可能兩者同時處于孵化階段沒有透明帶的保護，在操作過程中很易破碎或黏附在細管管壁上。Marti等[11]認為冷凍對細胞膜、胞質(zhì)及細胞連接有損害。Tao等[12]認為，胚胎骨架可增加胚胎的結構完整性，較好地耐受凍融過程中滲透壓的改變。顧美超等[13]研究表明小鼠休眠胚胎的亞細胞超微結構比其正常孵化胚胎更具抗凍性。Hmatani等[14]通過檢測休眠和激活的胚胎中的2萬個基因表達情況，發(fā)現(xiàn)其中有229個基因表達存在差異。這些基因主要參與細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導和能量代謝等通路。從凍融回收胚胎的形態(tài)完整數(shù)和形態(tài)完整率方面來看，休眠胚胎顯然優(yōu)于正常孵化胚胎。分析其原因，可能是較孵化期胚胎休眠胚胎在休眠期間一方面通過積累更多的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面通過不斷調(diào)節(jié)自身的結構及能量代謝來適應外界不利環(huán)境，進而能夠較快的恢復正常形態(tài)并且繼續(xù)發(fā)育。

國內(nèi)外報道的小鼠囊胚或孵化囊胚冷凍后移植產(chǎn)仔率在30% ～ 45%之間[15-16]。本實驗中休眠胚胎的凍融后移植產(chǎn)仔率為40.8%，顯著高于孵化期胚胎的30.1%，說明休眠胚胎經(jīng)過凍融后體內(nèi)發(fā)育潛力要優(yōu)于正?；罨咛?。分析其原因可能與冷凍方法，操作者的胚胎移植技術方法，凍融的胚胎時間等等有關。對于凍融結局的影響，除了種屬、冷凍保護劑和冷凍方法外，胚胎的發(fā)育階段尤為重要。因為在胚胎的不同發(fā)育階段，其代謝變化伴隨著細胞漿和冷凍保護劑之間的相互作用而變化。因此，不同發(fā)育階段的胚胎對同一種冷凍方法的作用結果有一定差別[17]。

從雙重染色結果來看[18]，休眠胚胎的ICM細胞數(shù)極顯著高于孵化期胚胎的ICM細胞數(shù)。而TE細胞數(shù)則差異不顯著。表明休眠胚胎在延遲著床過程中內(nèi)細胞團有一個持續(xù)增殖過程，而滋養(yǎng)層細胞則處于基本穩(wěn)定。這與Given等[19]的研究結果一致，其通過測定小鼠胚胎延遲著床后一定時間內(nèi)的DNA合成，結果發(fā)現(xiàn)在一定時間內(nèi)內(nèi)，ICM細胞的DNA合成一直處于較高水平，而TE細胞的DNA合成則在卵巢摘除手術24 h后有一個大幅度的降低，并在其后維持在較低水平。由于內(nèi)細胞團將會發(fā)育成胎兒，因而內(nèi)細胞團的定量測定能夠比較準確地地預估囊胚的植入潛能，不斷增大的內(nèi)細胞團數(shù)目與胚胎的著床率有一個近乎線性的增長關系，即內(nèi)細胞團的發(fā)育與其移植后胎兒的發(fā)育能力呈正相關[20]。而囊胚的直徑和滋養(yǎng)層細胞數(shù)與著床率無直接關系[21]。所以這一結果可以從一個側面說明休眠胚胎在胚胎質(zhì)量上要優(yōu)于孵化期胚胎。

休眠胚胎凍融培養(yǎng)前后的ICM和TE細胞數(shù)均無差異，而孵化胚胎ICM和TE細胞數(shù)都顯著高于解凍培養(yǎng)后的相關值，說明冷凍處理對孵化期胚胎破壞較大，在染色過程中發(fā)現(xiàn)各細胞之間連接較為松散，容易造成丟失，并且在凍融后的培養(yǎng)過程中細胞恢復和發(fā)育潛力較休眠胚差。本實驗中休眠胚胎與正常胚胎的ICM/TE比值分別為0.3和0.22，此結果要小于前人的 0.6，這是因為胚胎處于圍著床期時，內(nèi)細胞團數(shù)的增加會減慢并出現(xiàn)一個凋亡的波峰，結果是內(nèi)細胞團數(shù)占總細胞數(shù)的比例會隨著囊胚的不斷擴張、孵化和開始著床而不斷下降[22]。 Vander等[23]發(fā)現(xiàn)小鼠5 d擴張囊胚的總細胞數(shù)與內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞的比率(ICM/TE)呈負相關，以上結果都與本實驗結果相一致。

綜上所述，通過對小鼠正常孵化胚胎和休眠胚胎凍融后體內(nèi)外發(fā)育潛力的比較，我們發(fā)現(xiàn)休眠胚胎抵御冷凍的能力以及凍融后體外和體內(nèi)發(fā)育潛力均優(yōu)于孵化期胚胎。休眠胚胎的抗凍能力不僅與其細胞結構和細胞連接有關，其中還涉及許多尚不明確的細胞調(diào)控通路，尚需進一步深入研究。