張文鳳，張冠文，陳云，何嘉耀

（1.中國廣州分析測(cè)試中心，廣東省測(cè)試分析研究所，廣東廣州510070；2.廣東省疾病預(yù)防控制中心國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)參比實(shí)驗(yàn)室（重金屬），廣東廣州511430）

全球每年通過河流向海洋輸入的汞約有380 t，每年通過地下水輸入到海洋的汞有100 t～800 t，另外，每年約有600 t 的汞由深海熱液噴口產(chǎn)生[1]。馮新斌課題組的研究結(jié)果表明，中國地表自然源年均排放約465 t汞[2]。我國是全球汞消費(fèi)和汞排放大國，人為活動(dòng)汞排放量達(dá)500 t/年～700 t/年[3]。在我國，汞及其化合物的應(yīng)用主要是催化劑，所占比例達(dá)到總用量的70%，其余30%分別應(yīng)用在以下領(lǐng)域：科學(xué)測(cè)量儀9%、藥物8%、蒸氣燈5%、電極3%、雷汞2%、淘金3%[1]。

汞具有高致毒性、持久性和長距離遷移性等特征，是一種全世界公認(rèn)的持久性有毒物質(zhì)（persistent toxic substance，PTS）。汞是唯一一種能在常溫下呈現(xiàn)液態(tài)的重金屬，有7 個(gè)穩(wěn)定同位素，其質(zhì)量數(shù)分別為196、198、199、200、201、202、204，汞的毒性和生物有效性取決于其化學(xué)形態(tài)。汞及其化合物在環(huán)境中普遍存在，各形態(tài)的汞之間可以相互轉(zhuǎn)化，尤其是無機(jī)汞可以通過生物甲基化或者光化學(xué)反應(yīng)等過程形成毒性更大的甲基汞，并可通過食物鏈最終在人體內(nèi)富集，嚴(yán)重危害人體健康[4-7]。汞形態(tài)分析方法和技術(shù)的發(fā)展，對(duì)相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)研究的發(fā)展具有重要的推動(dòng)作用。由此，總汞及其形態(tài)分析的定性和定量分析的巨大市場(chǎng)需求和強(qiáng)烈的人文訴求可見一斑。

前人針對(duì)生物樣品汞形態(tài)分析的前處理及其分析的方法開展了大量的科學(xué)研究工作，過去的幾十年國內(nèi)外汞的形態(tài)分析研究取得了很多突破性的成果。本文從總汞的分析方法、汞形態(tài)分析方法及近年來汞形態(tài)分析研究方面綜述了生物樣品中汞形態(tài)分析方法的研究進(jìn)展及其新動(dòng)向。

1 總汞的快速篩查方法

無需前處理的總汞測(cè)量方法。試樣無需預(yù)處理過程或僅僅經(jīng)過簡單的預(yù)處理（如粉碎或干燥），可直接上機(jī)。最具代表性的是美國環(huán)保局頒布的方法“Method 7473 （SW-846）：Mercury in Solids and Solutions by Thermal Decomposition，Amalgamation，and Atomic Absorption Spectrophotometry”，中文名為熱分解齊化原子吸收光度法，該方法（以下簡稱EPA 方法7473）可測(cè)定固體及液體中的汞含量，原理：試樣經(jīng)熱解后，汞原子被捕集，隨后經(jīng)原子吸收光譜檢測(cè)。雖然該方法不需要消解過程便可直接測(cè)定汞含量、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡便，但由于儀器的運(yùn)行成本高，我國GB 5009.17-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》并未涵蓋該方法[8]。

為了減免試樣的復(fù)雜前處理過程，一些可用于化妝品及保健食品中重金屬的快速篩查的“食品藥品安全快速檢測(cè)試劑盒（汞快速檢測(cè)試紙）”悄然而生，并且在我國已有十多年的歷史。目前常用的汞離子快速檢測(cè)有生物酶抑制法、化學(xué)顯色法和離子交換法等，可應(yīng)用于環(huán)境水樣、食品、中藥材、紡織等領(lǐng)域的汞含量檢測(cè)。這些檢測(cè)手段通常用于快速篩查大樣本中的可疑樣本，從而起到排查食品安全事故的作用，但在樣本中目標(biāo)物含量低時(shí)，會(huì)出現(xiàn)重現(xiàn)性差、平行性不好等情況。

2 測(cè)定總汞的前處理方法

生物樣品（尤其是食品）重金屬的檢測(cè)需要低檢出限、高靈敏度的分析方法（檢出限低于1 mg/kg），因此，無法使用X 射線熒光光譜儀這類快速檢測(cè)儀器直接進(jìn)行測(cè)定（檢出限通常高于50 mg/kg），此外，汞極易在常溫下?lián)]發(fā)，不適合與其它重金屬一起進(jìn)行酸消解等前處理，常常需要單獨(dú)進(jìn)行預(yù)處理。

總汞的前處理方法有濕法酸消解法、微波消解法。GB 5009.17-2014 方法包含了這些前處理方法，包括濕法消解或微波消解、定容、離心等過程，采用冷原子吸收光譜法或原子熒光光譜法進(jìn)行總汞的測(cè)定，由于具有運(yùn)行成本較低、對(duì)技術(shù)要求不高等優(yōu)點(diǎn)，深受基層技術(shù)工作者的歡迎。

3 檢測(cè)總汞的儀器分析方法

總汞的檢測(cè)方法一般包括三大類：光譜法、電化學(xué)法和其它方法。據(jù)Suvarapu 和Baek 統(tǒng)計(jì)，最新的研究報(bào)道中大于50%總汞的檢測(cè)使用的方法是光譜法，他們將電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）列入光譜法中，此外還包括冷原子吸收光譜（cold-vapor atomic absorption spectrometry，CV-AAS）、冷原子熒光光譜（cold-vapor atomic fluorescence spectrometry，CV-AFS）以及電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES）等[9-10]。

為了防止汞的記憶效應(yīng)干擾檢測(cè)結(jié)果，維持儀器較低的檢出限，經(jīng)ICP-OES 或ICP-MS 檢測(cè)的固體樣品一般需要經(jīng)過繁瑣的前處理以及稀釋后，才能上機(jī)，例如微波輔助消解/萃取和酶水解，而且上機(jī)前需要進(jìn)行靈敏度、精度和重現(xiàn)性等儀器條件的調(diào)試[11-17]。CV-AFS 的操作原理：還原劑硼氫化鉀在酸性條件下與樣液反應(yīng)，樣液中的含汞目標(biāo)物全部氣化為原子態(tài)的汞蒸氣，汞蒸氣被氬氣送入檢測(cè)器，汞的絕對(duì)含量在特征波長下被測(cè)定。

直接測(cè)汞儀包括塞曼測(cè)汞儀（例如，俄羅斯魯美科思公司生產(chǎn)的塞曼測(cè)汞儀RA-915+）、原子吸收直接測(cè)汞儀（例如，意大利邁爾斯通公司生產(chǎn)的直接測(cè)汞儀DMA-80，美國力可LECO-ALTEC 公司生產(chǎn)的全自動(dòng)汞含量分析儀AMA 254）、固體同位素質(zhì)譜儀—多通道接收電感耦合等離子體質(zhì)譜儀等[18-24]。其中，塞曼測(cè)汞儀的原理：基于熱分解混合樣品和塞曼校正技術(shù)的原子吸收光譜檢測(cè)生成的汞元素總量；原子吸收直接測(cè)汞儀的原理：固態(tài)或液態(tài)的樣品經(jīng)干燥、程序升溫至特定的溫度，汞蒸汽在氧氣的作用下被金網(wǎng)捕集形成金汞齊，再經(jīng)高溫加熱同步釋放，在特征波長下檢測(cè)總汞的絕對(duì)含量。

4 汞形態(tài)分析的前處理方法

總汞的分析檢測(cè)技術(shù)是汞形態(tài)分析技術(shù)得以發(fā)展的基礎(chǔ)，總汞檢測(cè)技術(shù)日益豐富，促使了基于儀器聯(lián)用技術(shù)的汞形態(tài)分析方法及相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的快速發(fā)展。

在生物樣品甲基汞的萃取過程中，所使用的試劑有鹽酸（HCl）、濃硝酸（HNO3）、四甲基氫氧化銨（tetramethyl ammonium hydroxide，TMAH）、氫氧化鉀（KOH）、甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）、四乙基硼酸鈉（NaBEt4），萃取后的試樣若過酸或過堿，則需要中和試樣的pH 值后再進(jìn)行下一個(gè)分析步驟；常用的萃取方法有超聲輔助萃取、恒溫振蕩提取和微波輔助萃取，以及不常用的前處理方法，如蒸餾、乙基化、吸附－解吸等。經(jīng)氣相色譜分析的樣品一般需要進(jìn)行衍生化處理，常用的衍生化（也稱乙基化）試劑為四乙基硼酸鈉（NaBEt4）。

如上所述，汞形態(tài)分析的前處理方法具有多樣化，2013年～2017年研究報(bào)道的生物樣品汞形態(tài)分析的方法見表1，包括目標(biāo)物（總汞、無機(jī)汞和甲基汞）、生物樣品類別、前處理方法以及儀器分析方法等。

表1 近5年（2013年～2017年）文獻(xiàn)涉及的生物樣品中汞的形態(tài)分析方法Table 1 The analytical methodologies of mercury species in biomaterials according to previous studies published in the past five years（2013-2017）

續(xù)表1 近5年（2013年～2017年）文獻(xiàn)涉及的生物樣品中汞的形態(tài)分析方法Continue table 1 The analytical methodologies of mercury species in biomaterials according to previous studies published in the past five years（2013-2017）

食品中甲基汞的分析檢測(cè)按照GB 5009.17-2014方法執(zhí)行時(shí)需要進(jìn)行一系列的前處理（加酸條件下超聲輔助提取、離心、中和、絡(luò)合、定容、過濾），才可上機(jī)測(cè)試[8]。然而，超聲波輔助萃取法的優(yōu)缺點(diǎn)：1）萃取效率的穩(wěn)定性高、儀器運(yùn)行成本低、人力成本低；2）受超聲波衰減因素的制約，超聲有效作用區(qū)域?yàn)橐画h(huán)形，如果提取罐的直徑太大，在罐子的周壁就會(huì)形成超聲空白區(qū)；3）難以保證超聲波器件的安全性，也無法實(shí)現(xiàn)超聲罐的密封性；4）前處理時(shí)間至少需要半小時(shí)。

Teo 等充分肯定了微波輔助萃取法（microwaveassisted extraction，MAE）作為生物樣品（尤其是食品）前處理技術(shù)的快速、簡單等優(yōu)勢(shì)所在，同時(shí)強(qiáng)調(diào)了優(yōu)化MAE 方法的重要性[46]。微波輔助萃取法作為前處理方法的優(yōu)勢(shì)有：1）在密閉的容器中進(jìn)行，很好地避免目標(biāo)物的揮發(fā)和溶劑的損失，有效避免前處理過程中的外源污染；2）微波能具有良好的穿透性，可控因素多，節(jié)能；3）萃取時(shí)間短，一般以秒或分鐘計(jì)，省時(shí)；4）溶劑的用量少，通常為幾毫升，環(huán)保；5）減少稱樣量，當(dāng)樣品來源稀少時(shí)，此優(yōu)點(diǎn)更為明顯。不可置否，由于無機(jī)汞化物和有機(jī)汞化物的正辛醇/水分配系數(shù)的差別往往較大，因此應(yīng)用微波法難以實(shí)現(xiàn)同步萃取重金屬有機(jī)化合物和無機(jī)形態(tài)的重金屬，部分元素如砷除外[47]。

5 汞形態(tài)分析的儀器分析方法及其在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

本文以甲基汞的分析方法為例介紹汞形態(tài)分析的儀器檢測(cè)技術(shù)與分析方法。甲基汞的分析包括兩個(gè)部分：定性分析（甲基汞形態(tài)的甄別）與定量分析（甲基汞含量的測(cè)量）。首先，借助液相色譜柱或氣相色譜柱，利用甲基汞和其它含汞化合物在填料上的保留時(shí)間不同，使溶液中的甲基汞和其它形態(tài)的汞分離，隨后通過催化或熱解等技術(shù)使甲基汞轉(zhuǎn)化為汞蒸氣（汞原子或汞離子），最后根據(jù)汞在特征波長253.6 nm 或質(zhì)量數(shù)200.59 下的響應(yīng)，便可達(dá)到定性分析汞的目的。其次，測(cè)量汞的含量，在定性的基礎(chǔ)上使用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法將試樣中的目標(biāo)物與標(biāo)準(zhǔn)樣液進(jìn)行比較分析，從而達(dá)到定量分析的目的。目前，最常見的甲基汞的形態(tài)分析檢測(cè)手段為氣相/液相色譜-冷原子熒光光譜和氣相/液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜等[38-40，43-45]。

原子熒光光譜法經(jīng)歷了四十多年的發(fā)展，取得了令人矚目的成績，但是仍存在重復(fù)性和穩(wěn)定性略差、儀器使用壽命略短等不足。相比之下，有記憶效應(yīng)但穩(wěn)定性好的氣相/液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜等技術(shù)手段在魚類等復(fù)雜生物樣品汞形態(tài)分析方面在國際上得到了廣泛的應(yīng)用和認(rèn)可。

汞的形態(tài)分析是研究汞的毒性、致毒機(jī)理、膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)等課題的必經(jīng)之路，離開前者討論后者是不嚴(yán)謹(jǐn)甚至不科學(xué)的。從這個(gè)層面上，可以認(rèn)為，汞形態(tài)分析的儀器檢測(cè)技術(shù)與分析方法是開展環(huán)境化學(xué)、地球化學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品安全等基礎(chǔ)學(xué)科的相關(guān)研究的基礎(chǔ)。

中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所馮新斌課題組及其合作者基于氫氣發(fā)生-原子熒光光譜和冷原子熒光光譜等儀器分析方法研究了在汞礦區(qū)河流/土壤系統(tǒng)中硒的生物地球化學(xué)循環(huán)特征及其環(huán)境歸趨，在此基礎(chǔ)上對(duì)萬山汞礦區(qū)域的居民在大米膳食中汞暴露或者硒暴露健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估，并且在對(duì)硒的生理學(xué)/毒理學(xué)意義、汞的毒理學(xué)意義以及硒汞相互作用分子機(jī)理等進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)上，提出了健康風(fēng)險(xiǎn)效益值（benefit-risk value，BRV），指出將該指標(biāo)用于評(píng)估大米或魚類膳食中硒汞聯(lián)合暴露的健康獲益和風(fēng)險(xiǎn)水平更為科學(xué)[48-50]。

此外，基于穩(wěn)定同位素的汞形態(tài)分析方法，是近二十年發(fā)展起來的，Yin 等在國內(nèi)首次建立了基于多接受電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用的高精度測(cè)定汞同位素組成的方法[21]，這使我國的汞形態(tài)分析技術(shù)向高精度發(fā)展成為了可能。Li 等借助冷蒸氣-多接受電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了大米樣品甲基汞同位素的分析測(cè)試方法[51]。Du 等利用相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)及同位素的質(zhì)量分餾和非質(zhì)量分餾二元混合模型進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)食用大米甲基汞暴露人群的頭發(fā)汞同位素組成與食魚甲基汞暴露人群的差異，證實(shí)了頭發(fā)汞同位素是示蹤人體汞暴露來源的有力工具[52]。

中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心江桂斌課題組及其合作者運(yùn)用多種儀器聯(lián)用技術(shù)開展了很多汞形態(tài)分析與生命科學(xué)、食品安全等領(lǐng)域密切相關(guān)的前沿研究[53-55]。

李璐借用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜等儀器聯(lián)用技術(shù)研究了貴州汞礦區(qū)的生大米，發(fā)現(xiàn)大米中的甲基汞主要以甲基汞半胱氨酸（CH3HgCys）的形式存在，它的形成被認(rèn)為是甲基汞可以穿越血腦屏障和胎盤屏障的主要原因，然而，甲基汞半胱氨酸（CH3HgCys）經(jīng)烹飪后，絕大部分降解成其他形式的甲基汞化合物[54]。

孟梅等采用冷原子熒光光譜儀和氣相色譜-原子熒光光譜技術(shù)研究軟體動(dòng)物中總汞和甲基汞的時(shí)空變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)總汞含量隨時(shí)間呈現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)，隨空間的變化不明顯，螺類中甲基汞比例明顯高于雙殼類[55]。

贠照軍利用二維高效液相色譜技術(shù)-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)正常人體血漿蛋白中汞的形態(tài)及含量進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了在血漿中存在汞結(jié)合蛋白，經(jīng)高效液相色譜-線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜鑒定該蛋白為人血清白蛋白，經(jīng)等溫滴定量熱法等方法進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)Hg2+主要結(jié)合在為人血清白蛋白的蛋白Cys34 殘基上[53]。

6 結(jié)論與展望

綜上所述，汞的形態(tài)分析研究取得了一系列重要進(jìn)展。從目標(biāo)物的角度看，目標(biāo)物從單一的總汞總量分析向不同形態(tài)化合物（如甲基汞、無機(jī)汞）分析轉(zhuǎn)變，從化合物分析（如氯化甲基汞，CH3HgCl）向指定質(zhì)量數(shù)的化合物（如201 標(biāo)記的氯化甲基汞，CH3201HgCl）分析演變。從分析儀器的角度看，基于光譜學(xué)、質(zhì)譜學(xué)的汞分析儀器趨于多樣化，如CV-AAS、CV-AFS、ICPMS，以及基于這些檢測(cè)手段的汞形態(tài)分析儀器聯(lián)用技術(shù)層出不窮，如色譜－光譜聯(lián)用技術(shù)，其中色譜模塊包括液相色譜、氣相色譜、毛細(xì)管電泳色譜等。

筆者推測(cè)提高實(shí)驗(yàn)室方法中汞形態(tài)分析前處理方法的時(shí)效性、靈敏度和準(zhǔn)確度，降低儀器的檢出限等將成為日后的研究方向，今后還可在以下幾個(gè)方面進(jìn)行重點(diǎn)研究：1）檢測(cè)方法快速運(yùn)行，提高時(shí)效性；2）聯(lián)用儀器小型化設(shè)計(jì)，增加儀器和方法的可移動(dòng)性；3）便攜式儀器，增強(qiáng)適用性；4）多種已有儀器重組形成新儀器，衍生出新的儀器聯(lián)用技術(shù)。由于快速檢測(cè)能滿足廣大市場(chǎng)的需求，多功能檢測(cè)試紙和多通道檢測(cè)儀也將是日后的研究重點(diǎn)；而隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，需要也將越來越大，汞形態(tài)分析的檢測(cè)方法和技術(shù)將會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。