趙凱豐 劉慧英 江道亮 苗葉 張靜

[摘要] 目的 探討胃癌組織中脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）、Bcl-2蛋白表達(dá)與幽門螺桿菌（Hp）感染的關(guān)系。 方法 收集2013年1月～2017年1月于解放軍第四六四醫(yī)院行胃癌根治術(shù)的80例胃癌組織標(biāo)本，另選其中43例癌旁組織。采用快速尿素酶試紙和Warthin-Starry染色，檢測(cè)組織標(biāo)本是否感染Hp，采用免疫組化染色方法檢測(cè)組織標(biāo)本中FHIT和Bcl-2的表達(dá)。 結(jié)果 胃癌組織FHIT陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織（P < 0.05），胃癌組織Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織（P < 0.05）。胃癌組織中FHIT的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤(rùn)程度和Hp感染均有關(guān)（均P < 0.05），Bcl-2的表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度、浸潤(rùn)程度和Hp感染有關(guān)（均P < 0.05）。FHIT的陽(yáng)性率與Hp感染呈負(fù)相關(guān)（r = -0.295，P < 0.05），Bcl-2的陽(yáng)性率與Hp感染呈正相關(guān)（r = 0.393，P < 0.05）。 結(jié)論 胃癌組織中FHIT蛋白表達(dá)減弱，Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，且均與Hp感染關(guān)系密切，三者相互作用導(dǎo)致了胃癌的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] 胃癌;幽門螺桿菌;脆性組氨酸三聯(lián)體;Bcl-2

[中圖分類號(hào)] R735.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（b）-0100-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between fragile histidine triad （FHIT） and Bcl-2 protein expression in gastric cancer tissues and helicobacter pylori （Hp） infection. Methods From January 2013 to January 2017， 80 gastric carcinoma tissue samples were collected after radical gastrectomy in the 464th Hospital of PLA， and 43 paracancerous tissues were selected. Rapid urease assay paper and Warthin-Starry staining were used to detect whether the tissue samples were infected with Hp， and the expressions of FHIT and Bcl-2 in the tissue samples were detected by immunohistochemical staining. Results FHIT positive expression rate in gastric carcinoma tissues was lower than that in para-carcinoma tissues （P < 0.05）， Bcl-2 positive expression rate in gastric carcinoma tissues was higher than that in para-carcinoma tissues （P < 0.05）. The expression of FHIT in gastric carcinoma tissues was related to lymphatic metastasis， distant metastasis， degree of differentiation， degree of infiltration and Hp infection （all P < 0.05）. Bcl-2 expression was related to tumor diameter， differentiation degree， infiltration degree and Hp infection （all P < 0.05）. The positive rate of FHIT was negatively correlated with Hp infection （r = -0.295， P < 0.05）， and the positive rate of Bcl-2 was positively correlated with Hp infection （r = 0.393， P < 0.05）. Conclusion The expression of FHIT protein in gastric carcinoma tissues is weakened， and the expression of Bcl-2 protein is enhanced， which are closely related to Hp infection， and the three interactions lead to the occurrence of gastric carcinoma.

[Key words] Gastric carcinoma; Helicobacter pylori; Fragile histidine triad; Bcl-2

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)胃癌居各類惡性腫瘤發(fā)病率的首位，每年有15～20萬(wàn)人死于胃癌，占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的25%[1]。研究顯示胃癌早期的5年生存率和10年生存率均達(dá)到90%，但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)胃癌時(shí)已是中、晚期，此時(shí)治療的預(yù)后不佳[2]。目前手術(shù)治療是治療胃癌最好的手段，其他治療方式包括化學(xué)治療、內(nèi)鏡下治療和中醫(yī)治療等[3]，但結(jié)果不甚理想。胃癌的病因尚無(wú)定論，學(xué)者廣泛認(rèn)為是遺傳、飲食、環(huán)境、幽門螺桿菌（Hp）感染等多因素相互作用引起的。脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histidine triad，F(xiàn)HIT）基因是Ohta等[4]發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因，在正常組織中廣泛表達(dá)，在多種食管癌、胃癌、膀胱癌等惡性腫瘤中表達(dá)減少，喪失抑癌作用。Bcl-2是從濾泡性B淋巴細(xì)胞中分離得到的一種致癌基因，是研究最早、最深入的凋亡抑制基因，通過(guò)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑來(lái)參與腫瘤的發(fā)生[5]。目前關(guān)于Hp與FHIT和Bcl-2表達(dá)關(guān)系的研究較少，本研究對(duì)胃癌組織中FHIT、Bcl-2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并分析其與Hp感染的關(guān)系，以期為胃癌的診斷和治療提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

80例胃癌組織取自解放軍第四六四醫(yī)院于2013年1月～2017年1月期間行胃癌根治術(shù)的存檔蠟塊，其中男47例，女33例，年齡40～76歲，平均（58.3±6.5）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理學(xué)診斷確診為胃癌，且術(shù)前未進(jìn)行放療、化療等特殊治療;②既往無(wú)胃部手術(shù)史;③1個(gè)月內(nèi)無(wú)抗炎藥物、抗菌藥物、H2受體拮抗劑、質(zhì)子泵抑制劑等藥物史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病歷資料不完全;②住院期間未接受Hp檢測(cè)者;③既往接受過(guò)Hp根除治療。另選其中43例癌旁組織（距離腫瘤邊緣>2 cm），均取自上述胃癌根治術(shù)病例。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Hp檢測(cè)? 采用快速尿素酶試紙檢測(cè)取胃黏膜組織，1～3 min內(nèi)試紙由黃色變?yōu)闄鸭t色為陽(yáng)性，不變色者為陰性;采用Warthin-Starry染色對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行染色，陽(yáng)性標(biāo)本可見(jiàn)紅黑色或黑色弧形、S形或海鷗狀Hp，分布于胃黏膜表面黏液層、胃小凹及胃癌旁黏膜腺窩內(nèi)。上述兩項(xiàng)檢測(cè)均呈陽(yáng)性者判斷為Hp感染陽(yáng)性，兩項(xiàng)均陰性者為無(wú)Hp感染，僅有一項(xiàng)陽(yáng)性者不納入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 FHIT和Bcl-2表達(dá)的檢測(cè)? 采用免疫組化染色的方法檢測(cè)組織標(biāo)本中FHIT和Bcl-2表達(dá)，F(xiàn)HIT兔-多克隆抗體和Bcl-2兔-多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司。先將固定后的組織標(biāo)本在60℃恒溫烤箱中烤干1 h，室溫冷卻后進(jìn)行脫水處理，用3%過(guò)氧化氫（H2O2）滅活內(nèi)源性酶，再用乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，PBS沖洗后滴加BSA封閉液，孵育10 min添加一抗，4℃冰箱孵育18 h，添加二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗2～3次，加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液顯色10 min，蘇木精復(fù)染30 s，梯度酒精脫水，中性樹(shù)膠封片，室溫晾干，鏡下觀察。

1.2.3 染色結(jié)果判定? FHIT和Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位均位于細(xì)胞質(zhì)，選已知陽(yáng)性的組織切片為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS替代一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果采用雙盲半定量積分法，每張切片的染色結(jié)果由2名病理醫(yī)師分別確認(rèn)：①按細(xì)胞著色深淺程度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分;②按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞百分比，選擇高倍鏡（400×）視野，避開(kāi)邊緣組織。百分比<5%為0分，5%≤百分比<25%為1分，25%≤百分比<50%為2分，百分比≥50%為3分;③將上述2項(xiàng)得分相加得到綜合評(píng)分，綜合得分≥4分判定為陽(yáng)性（+），綜合得分<4分判定為陰性（-）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FHIT和Bcl-2在癌組織與癌旁組織中的表達(dá)

癌旁組織、胃癌組織FHIT蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率依次為62.79%、42.50%，胃癌組織陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織（P < 0.05）。見(jiàn)圖1（封四）、表1;癌旁組織、胃癌組織Bcl-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率依次為39.53%、63.75%，其中胃癌組織陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織（P < 0.05）。見(jiàn)圖2（封四）、表1。

2.2 FHIT和Bcl-2的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系

胃癌組織中FHIT的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤(rùn)程度和Hp感染均有關(guān)（均P < 0.05），與年齡、性別、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（均P > 0.05）;Bcl-2的表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度、浸潤(rùn)程度和HP感染有關(guān)（均P < 0.05），與年齡、性別、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床特征無(wú)關(guān)（均P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 相關(guān)性分析

FHIT的陽(yáng)性率與Hp感染呈負(fù)相關(guān)（r = -0.295，P < 0.05）;Bcl-2的陽(yáng)性率與Hp感染呈正相關(guān)（r = 0.393，P < 0.05）。

3 討論

胃癌的明確病因尚不清楚，但自從Hp被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，大量研究報(bào)道均顯示其參與了胃癌發(fā)生過(guò)程[6-8]，鑒于這些研究結(jié)果國(guó)際癌癥研究中心（IARC）在1994年將Hp定義為Ⅰ類致癌原[9-10]。Watanabe等[11]將Hp接種至5周齡的蒙古沙鼠，成功觀察到了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、萎縮性胃炎、腸上皮化生和不典型增生的過(guò)程，并成功誘導(dǎo)胃癌，證實(shí)Hp在胃癌的發(fā)生中的作用。Hp感染與癌基因激活、抑癌基因沉默三者相互作用引起胃黏膜上皮細(xì)胞異常增生是胃癌發(fā)生的重要原因。

FHIT是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，全長(zhǎng)1095 bp，編碼FHIT蛋白，是一種典型的Ap3A水解酶，Ap3A是ATP類似物，具有抑制蛋白激酶活性的作用，當(dāng)FHIT蛋白活性降低時(shí)，Ap3A水平升高引起生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑增強(qiáng)，阻斷凋亡通道，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12-13]。FHIT蛋白還作用于mRNA帽類似物，可能通過(guò)影響關(guān)鍵基因mRNA的翻譯發(fā)揮抑癌作用[14]。雖然目前尚不清楚FHIT究竟通過(guò)何種途徑發(fā)揮抑癌作用，但是大量研究均表明其在胃癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，Baffa等[15]發(fā)現(xiàn)67%的原發(fā)性胃腺癌患者FHIT基因缺失或表達(dá)減少，Huiping等[16]利用RT-PCR技術(shù)對(duì)39例胃癌組織中FHITmRNA的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)87.18%的標(biāo)本存在FHIT低表達(dá)。本研究對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色結(jié)果顯示，癌旁組織、胃癌組織FHIT蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.79%、42.50%，且胃癌組織陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織（P < 0.05），提示FHIT蛋白表達(dá)降低或缺失與胃癌的發(fā)生存在密切關(guān)系。FHIT與患者臨床特征的分析結(jié)果顯示，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度低、浸潤(rùn)程度高和Hp感染的胃癌組織中，F(xiàn)HIT的表達(dá)顯著減少，提示FHIT蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，與Rocco等[17]研究結(jié)果一致。

Bcl-2是濾泡性B淋巴細(xì)胞中分離得到的一種癌基因，正常位于18號(hào)染色體上，在淋巴瘤中易位到14號(hào)染色體上[18]。Bcl-2基因被稱作存活基因，其編碼的蛋白質(zhì)定位于線粒體內(nèi)膜、核周膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，通過(guò)抑制Casepase酶系和阻礙細(xì)胞色素C的釋放[19]，阻礙凋亡途徑，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡刺激因子的耐受力[20]。在體內(nèi)Bcl-2與Bax基因的比例決定了細(xì)胞凋亡程度，當(dāng)Bcl-2表達(dá)增加時(shí)，與Bax形成二聚體，凋亡被抑制，當(dāng)Bax表達(dá)增加時(shí)，可拮抗Bcl-2的作用使細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，癌旁組織、胃癌組織Bcl-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率依次為39.53%、63.75%，胃癌組織陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織（P < 0.05），與劉海峰等[22]的研究結(jié)果一致。Bcl-2與臨床特征的比較結(jié)果顯示，分化程度低、浸潤(rùn)程度高、腫瘤直徑大和Hp感染組織中表達(dá)顯著增高，Jr等[23]也發(fā)現(xiàn)Hp（+）胃癌組織中Bcl-2表達(dá)水平更高。本研究結(jié)果還顯示，F(xiàn)HIT的陽(yáng)性率與Hp感染呈負(fù)相關(guān)（r = -0.295，P < 0.05），Bcl-2的陽(yáng)性率與Hp感染呈正相關(guān)（r = 0.393，P < 0.05），提示胃癌發(fā)生過(guò)程中，F(xiàn)HIT表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，引起細(xì)胞異常增生，抵抗凋亡作用，導(dǎo)致腫瘤形成，而Hp感染可能作為一個(gè)重要因素引發(fā)了這一過(guò)程，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

綜上所述，胃癌組織中FHIT蛋白表達(dá)減弱，Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，且均與Hp感染關(guān)系密切，三者相互作用導(dǎo)致了胃癌的發(fā)生。

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（收稿日期：2018-06-01? 本文編輯：封? ?華）