張家寧 曹夢遠(yuǎn) 李林成 劉銘傳 劉洋 何亭

[摘要] 目的 探討褪黑素（MT）對內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)的膿毒癥腎損傷小鼠炎癥及腎臟細(xì)胞凋亡的影響，以及MT對膿毒癥腎損傷的作用及其與microRNA-146a（miR-146a）的關(guān)系。 方法 將48只雄性Balb/c小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、MT治療組（MT組）以及假治療組（NS組），每組16只。MT組、NS組小鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg體重）制備膿毒癥模型，MT組小鼠于建模前半小時(shí)、建模時(shí)、傷后4 h分3次注射MT（30 mg/kg體重），NS組及Sham組小鼠在MT組相應(yīng)給藥時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水。LPS處理24 h后，檢測各組白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6 mRNA的水平、miR-146a的水平、凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表達(dá)情況，以及血清肌酐（Cr）及尿素氮（BUN）水平。LPS處理72 h后觀察各組小鼠腎臟病理變化及損傷情況。 結(jié)果 ①Sham組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，NS組腎小管內(nèi)管型形成，腎小管結(jié)構(gòu)不清，腎小球固縮，大量炎癥細(xì)胞浸潤;MT組壞死腎小球數(shù)目明顯少于NS組。②NS組、MT組血清Cr、BUN含量顯著高于Sham組（P < 0.01），MT組血清Cr、BUN含量則顯著低于NS組（P < 0.01）。③MT組腎臟組織Cleaved-caspase-3、Bax表達(dá)量顯著低于NS組（P < 0.01）。④三組腎臟組織中IL-1β和IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其中MT組腎臟組織IL-1β、IL-6顯著低于NS組（P < 0.01）。⑤三組腎臟組織中miR-146a水平比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），MT組顯著高于NS組（P < 0.01）。 結(jié)論 MT對LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠腎損傷有明顯治療作用，這種治療作用可能是通過上調(diào)miR-146a，進(jìn)而抑制炎癥及細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 褪黑素;膿毒癥;腎損傷;微小RNA-146a

[中圖分類號] R631? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of melatonin （MT） on apoptosis of renal cells and inflammation in lipopolysaccharide （LPS）-induced septic mice， and to explore the effect of MT on renal injury in sepsis as well as the role that microRNA-146a（miR-146a） plays. Methods Forty-eight male Balb/c mice were divided into sham-operated group （Sham group）， MT treatment group （MT group） and placebo group （NS group） according to random number table method， with 16 mice in each group. Mice in the latter two groups were injected with LPS （10 mg/kg body weight） intraperitoneally to prepare sepsis model. Mice in MT group were injected with MT （30 mg/kg body weight） three times separately at half an hour before LPS injection， the same time as LPS injection and 4 hours after injection. At the same time，mice in NS group and Sham group were injected with same volume saline. After LPS treatment for 24 hours， the levels of interleukin （IL）-1β and IL-6 mRNA， miR-146a， the expression of apoptotic proteins Caspase-3 and Bax， serum creatinine （Cr） and urea nitrogen （BUN） were detected. After LPS treatment for 72 hours， the renal pathological changes and injuries of mice in each group were observed. Results ①The renal structure was normal in Sham group. The renal tubules in NS group were of tubular type， with unclear tubular structure， glomerular pyknosis， and a large number of inflammatory cells infiltrating; the number of necrotic glomeruli in MT group was much less than that in NS group. ②The levels of serum Cr and BUN in NS group were significantly higher than those in Sham group （P < 0.01）. The levels of Cr and BUN in MT group mice were significantly lower than those in NS group （P < 0.01）. ③The levels of Cleaved-caspase 3 and Bax in MT group mice were significantly lower than those in NS group （P < 0.01）. ④The levels of IL-1β and IL-6 in these three groups mice had statistically significant difference （P < 0.05）. In MT group， the levels of IL-1β and IL-6 in renal tissues were lower than those in NS group （P < 0.01）. ⑤The levels of miR-146a in renal tissues were highly statistically different in these three groups mice （P < 0.01）. In MT group， it was significantly higher than that in NS group （P < 0.01）. Conclusion MT can significantly improve renal injury in LPS-induced septic mice， which may related to the upregulation of miR-146a and suppression of inflammation and cell apoptosis.

[Key words] Melatonin; Sepsis; Renal injury; microRNA-146a

膿毒癥是指感染或嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致的不可控的炎性反應(yīng)，其發(fā)病率和死亡率極高，是重癥監(jiān)護(hù)室中患者死亡的主要原因之一[1]。膿毒癥常致多器官功能衰竭綜合征（MODS），腎臟是其經(jīng)常累及的臟器之一[2]。據(jù)報(bào)道，膿毒癥患者中急性腎損傷發(fā)生率高達(dá)40%，嚴(yán)重威脅患者生命健康安全[3]。褪黑素（MT）是由松果體分泌的吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有調(diào)節(jié)生物鐘、抗氧化、清除氧自由基、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)功能[5-6]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)MT對膿毒癥大鼠有一定的保護(hù)作用[7]。膿毒癥合并急性腎損傷病死率較高，是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。本研究擬通過觀察MT對膿毒癥小鼠急性腎損傷及miR-146a水平的影響，初步闡明MT對膿毒癥腎損傷的作用及其與miR-146a水平的關(guān)系，為疾病的治療提供新思路，為相關(guān)研究提供新視角。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑與儀器

健康清潔級雄性Balb/c小鼠48只，重量20～25 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號：SYXK（軍）2012-0022。Cleaved-caspase-3（貨號：9661）、Bax（貨號：14796S）多克隆抗體、小鼠抗β肌動(dòng)蛋白抗體（貨號：3700）購自美國CST公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號：01334）、山羊抗鼠IgG二抗（批號：01325）均購自武漢博士德生物工程有限公司;內(nèi)毒素（LPS）（批號：037M4015V）購自Sigma公司;Trizol（批號：AHF1813A）試劑購自美國Invitrogen公司;肌酐（Cr）（貨號：C011-2）、尿素氮（BUN）（貨號：C013-2）ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;SYBR Green MasterMix（批號：A8605）購自美國ABI公司。3-18K型高速冷凍離心機(jī)購自Sigma公司;紫外線分光度計(jì)、mini PROTEAN型垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)移儀均購自美國Bio-Rad公司;7900HT型熒光定量PCR儀購自美國應(yīng)用生物公司;ImageMaster凝膠成像分析儀購自Applied Biosystems公司。

1.2 模型制備及分組處理

Balb/c小鼠采取22～26℃ SPF環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲食，光照控制12 h明/12 h暗，濕度50%～60%。實(shí)驗(yàn)前分籠飼養(yǎng)24 h，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、MT治療組（MT組）與假治療組（NS組），每組16只。MT組與NS組小鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg體重），MT組小鼠于建模前半小時(shí)、建模時(shí)、傷后4 h分3次注射MT（30 mg/kg體重），NS組小鼠在MT組相應(yīng)給藥時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水;Sham組僅在相應(yīng)給藥時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。各組小鼠處理后分籠飼養(yǎng)，自由飲食。

1.3 標(biāo)本采集

LPS注射24 h后，各組半數(shù)小鼠采用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，眼球取血，室溫靜置15 min后，1500 r/min離心15 min，離心半徑15 cm，收集血清分裝，-80℃凍存。采血后脫頸處死小鼠。各組其余半數(shù)小鼠，在LPS注射72 h后，麻醉后頸椎脫臼處死，迅速切取雙側(cè)腎臟，部分組織用體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛固定，部分組織-80℃凍存。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 腎臟組織形態(tài)? 取各組甲醛固定的腎臟組織標(biāo)本，酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚切片，脫蠟后HE染色，智能生物圖像導(dǎo)航儀400倍鏡下觀察組織形態(tài)。

1.4.2 血清Cr、BUN含量? 將收集到的血清稀釋10倍后測定腎功能生化指標(biāo)Cr和BUN的含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 腎臟組織中Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達(dá)? 采用蛋白質(zhì)印跡法（Westen blot）進(jìn)行檢測。將各組每只小鼠凍存腎臟組織標(biāo)本50 mg加組織細(xì)胞裂解液勻漿，提取蛋白，BCA定量。蛋白樣本均以50 μg上樣，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濕法轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入兔抗鼠Cleaved-caspase-3、Bax一抗（稀釋比例均為1∶1000），4℃孵育過夜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1∶3000），37℃孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光、顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)行灰度掃描分析，系統(tǒng)自帶軟件分析蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 腎臟組織中IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)? 取各組每只小鼠凍存腎臟組織標(biāo)本50 mg，用Trizol試劑提取總RNA，測定RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA。引物由日本TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，序列及產(chǎn)物大小見表1。按照SYRB Green熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行PCR，以GAPDH為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火與延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用△循環(huán)閾值（Ct）法處理結(jié)果并計(jì)算腎臟組織中IL-1β、IL-6 mRNA相對表達(dá)量，即2-△△Ct。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 腎臟組織中miRNA-146的表達(dá)? 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測。取各組每只小鼠凍存腎臟組織標(biāo)本50 mg，用Trizol試劑提取總RNA，測定RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA。引物由日本TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，序列分別為miR-146a：5′-TGAGAACTGAATTCCATAGGC-3′;U6：5′-GTGCTCGCTTCGGC-AGCACATAT-3′。按照SYRB Green熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行PCR，以U6為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)條件不變。采用△循環(huán)閾值（Ct）法處理結(jié)果計(jì)算腎臟組織中miR-146a相對表達(dá)量，即2-△△Ct。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，三組間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠腎臟組織形態(tài)比較

傷后24 h，Sham組小鼠腎臟組織與正常腎臟組織無異;NS組腎小球固縮，腎小管上皮變性壞死，腎間質(zhì)充血嚴(yán)重，大量炎癥細(xì)胞浸潤;MT組腎臟組織損傷程度遠(yuǎn)低于NS組。見圖1。

2.2 三組小鼠血清Cr及BUN水平比較

三組小鼠血清Cr及BUN水平總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。NS組、MT組明顯高于Sham組（P < 0.01），MT組明顯低于NS組（P < 0.01）。見表2。

2.3 三組小鼠腎臟組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

三組小鼠腎臟組織中Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。MT組、NS組腎臟組織中凋亡相關(guān)分子Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達(dá)水平明顯高于Sham組（P < 0.01），NS組明顯高于MT組（P < 0.01）。見表3、圖2。

2.4 三組小鼠腎臟組織中IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)水平比較

三組小鼠腎臟組織中IL-1β、IL-6的mRNA水平總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。MT組、NS組IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯高于Sham組（P < 0.01），MT組明顯低于NS組（P < 0.01）。見表4。

2.5 三組小鼠腎臟組織中miR-146a的表達(dá)水平比較

Sham組、MT組及NS組小鼠腎臟組織miR-146a的表達(dá)水平分別為（1.00±0.03）、（3.44±0.95）、（2.12±0.61），總體比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。MT組及NS組均高于Sham組（P < 0.01），MT組顯著高于NS組（P < 0.01）。

3 討論

膿毒癥是ICU患者死亡的重要原因，而腎臟則是膿毒癥最常累及的臟器之一[2]。膿毒癥伴急性腎損傷發(fā)病率高，且病死率明顯高于未合并急性腎損傷的膿毒癥患者，亦高于非膿毒癥急性腎損傷患者[8]。因此，在膿毒癥患者的治療過程中腎損傷的治療十分重要。膿毒癥發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究認(rèn)為膿毒癥的發(fā)病與宿主炎性反應(yīng)平衡失調(diào)和免疫功能紊亂密切相關(guān)[9]。而膿毒癥導(dǎo)致的腎血流動(dòng)力學(xué)的改變和大量炎性因子在腎臟的聚集是膿毒癥伴發(fā)急性腎損傷的主要致病因素[10]。研究表明，MT具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、調(diào)節(jié)免疫及改善微循環(huán)等多種生物學(xué)作用[5-6]，這對炎性疾病的治療有重要意義。

本研究通過對比分析不同分組小鼠的腎臟病理改變情況，發(fā)現(xiàn)MT組小鼠腎臟組織炎癥細(xì)胞浸潤水平和腎臟組織損害程度要明顯低于未經(jīng)治療的小鼠。同樣，MT組的小鼠血清中Cr、BUN含量也明顯低于未治療小鼠，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示MT對膿毒癥伴發(fā)的急性腎損傷起到了一定的治療作用。Caspase-3與Bax蛋白在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路中發(fā)揮著重要作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，NS組活化的Caspase-3及Bax水平明顯高于Sham組，提示LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生了顯著的腎損傷;而經(jīng)過MT治療后，活化的Caspase-3及Bax水平有了顯著的下降，提示MT治療對抑制腎臟細(xì)胞凋亡具有一定的意義。IL-1β、IL-6作為重要的促炎及免疫調(diào)控因子，在膿毒癥發(fā)展過程中具有重要的作用[9]。經(jīng)MT治療的小鼠體內(nèi)IL-1β、IL-6水平明顯降低，提示MT可顯著降低小鼠體內(nèi)的炎性因子水平，減輕過度活化的炎性反應(yīng)對組織的損傷，從而起到改善膿毒癥的作用。

microRNA是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中，在體液中穩(wěn)定存在，幾乎不受RNA酶、溫度等因素影響的物質(zhì)[12]，在細(xì)胞分化、增殖凋亡中起到重要作用[13]。此外，微小RNA作為一種血清學(xué)標(biāo)志物，其在惡性腫瘤、組織損傷等方面的診斷價(jià)值也得到了諸多學(xué)者的認(rèn)同[14-15]，并對膿毒癥早期診斷及其嚴(yán)重程度、預(yù)后的判斷具有重要的意義[16-17]。miR-146a是miR-146家族中的一員，研究表明，miR-146a為核因子κB（NF-κB）依賴性基因，通過對其作用靶點(diǎn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF-6）與白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1（IRAK-1）進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而起到降低TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎性因子的作用，抑制炎性因子的表達(dá)和炎性細(xì)胞的浸潤[18-20]。在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷中，研究者發(fā)現(xiàn)提高miR-146a的水平，可有效抑制膿毒癥引起的炎癥反應(yīng)[21]，且有研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在固有免疫中發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)控作用[22]。因此，提高miR-146a的水平成為許多炎性疾病潛在的治療策略。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NS組小鼠體內(nèi)miR-146a的水平高于Sham組，這可能與促炎因子刺激使miR-146a表達(dá)升高有關(guān)[23]。MT組中miR-146a顯著升高，且膿毒癥癥狀顯著減輕，結(jié)合既往研究，提示MT組腎損傷情況的好轉(zhuǎn)可能與miR-146a水平的升高密切相關(guān)。

綜上，本研究認(rèn)為，MT可提高動(dòng)物體內(nèi)miR-146a的水平，進(jìn)而拮抗炎性因子的表達(dá)，減少組織細(xì)胞凋亡，抑制炎性反應(yīng)，減輕膿毒癥導(dǎo)致的急性腎損傷，進(jìn)而改善膿毒癥結(jié)局。

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（收稿日期：2018-06-08? 本文編輯：羅喬荔）