李潤成，方 超，卿任科，葛 猛，趙 墩，胡玉立，余興龍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，M.hyo)廣泛分布于世界各地，患豬主要表現(xiàn)為生長速度減慢，飼料轉(zhuǎn)化率低[1]，該病原致死率不高，但如果繼發(fā)感染可造成嚴(yán)重死亡，給養(yǎng)豬場帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，用于預(yù)防豬肺炎支原體的疫苗主要是弱毒苗和滅活苗，疫苗免疫雖可提高豬群抵抗力，改善生產(chǎn)性能，但難以完全阻止該病原在豬群的傳播[3-5]。新型疫苗以及免疫評估方法的研究一直受到廣泛關(guān)注。其P36、P46、P97蛋白常作為基因工程疫苗或ELISA抗體檢測方法研究的重要目的蛋白[6-10]，另外，同樣作為豬肺炎支原體黏附因子的P146蛋白也開始受到關(guān)注[11]。對這些蛋白基因在當(dāng)前流行菌株進(jìn)化、變異情況進(jìn)行調(diào)查和分析，對于生豬豬肺炎支原體疫苗研究、評估方法的開發(fā)均具有重要的意義，但至今，GenBank登錄的相關(guān)蛋白基因序列很少，不同蛋白分別只有8～17條左右的序列，且多數(shù)序列為2010年以前上傳。目前也沒有關(guān)于湖南省生豬豬肺炎支原體感染菌株遺傳變異情況的研究報(bào)道。因此，本研究選取了2014-2017年從湖南省長沙市屠宰場收集的不同時(shí)間、不同來源地的豬肺炎支原體陽性樣本，進(jìn)行P36、P46、P97R1、P146基因測序，并結(jié)合GenBank登錄的菌株進(jìn)行了氨基酸序列的比對分析，以便為該病原的防控研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

PCR金牌Mix購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 豬肺炎支原體陽性樣本DNA模板

于2014-2017年不同時(shí)間，從湖南省長沙市2個(gè)大型屠宰豬場收集了530個(gè)肺臟，用生理鹽水進(jìn)行氣管灌洗，收集灌洗液、提取DNA進(jìn)行豬肺炎支原體檢測后，保存。本試驗(yàn)根據(jù)采樣時(shí)間和屠宰豬來源地挑選了17個(gè)不同時(shí)間收集，不同來源地的豬肺炎支原體陽性的DNA樣本作為研究對象。

1.3 豬肺炎支原體P36、P46、P97 R1、P146基因PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登錄的相關(guān)基因序列(CP003131.1、AE017332.1、CP002274.1、AE017243.1、CP003802.1)，按照包含基因重要功能區(qū)、基因多變區(qū)和便于設(shè)計(jì)引物的原則，在P36基因的前后兩端50～100個(gè)堿基處設(shè)計(jì)引物，P46基因選在起始與終止區(qū)域附近的合適位置設(shè)計(jì)引物，P97則在使豬肺炎支原體具備黏附呼吸道纖毛功能所不可或缺的區(qū)域，R1區(qū)[12-13]前后設(shè)計(jì)引物，P146基因則根據(jù)GenBank登錄序列同源性比對情況，選在基因多變區(qū)的前后設(shè)計(jì)引物。具體引物信息見表1。引物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

1.4 不同基因片段的PCR擴(kuò)增與測序

以選定的肺臟灌洗液DNA作為模板，采用高保真的金牌PCR Mix，按照表1中退火溫度進(jìn)行不同基因的PCR擴(kuò)增，具體操作按常規(guī)進(jìn)行，PCR完畢后進(jìn)行DNA 電泳鑒定，并將陽性PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物科技有限公司進(jìn)行測序。

表1 豬肺炎支原體P36、P46、P97 R1、P146基因引物信息Tab.1 Primer used for P36,P46,P97 R1,P146 gene of M.hyo

注：63/55.前10個(gè)循環(huán)63 ℃；后20個(gè)循環(huán)55 ℃。

Note：63/55.The first 10 cycles at 63 ℃; The next 20 cycles at 55 ℃.

1.5 不同基因片段所編碼氨基酸序列的比對分析

根據(jù)PCR測序峰圖，將PCR測序結(jié)果進(jìn)行處理后，利用Lasergene生物軟件翻譯成氨基酸序列，結(jié)合GenBank登錄的豬肺炎支原體菌株相應(yīng)序列(疫苗相關(guān)菌株M.hyoJ株、168株、168-L株，及其他不同菌株序列)，采用Lasergene軟件進(jìn)行同源性比較，并采用DNAStar生物軟件對不同蛋白差異明顯的功能區(qū)域進(jìn)行抗原表位預(yù)測?？疾焱涝棕i肺臟樣本中菌株與GenBank登錄的菌株之間各蛋白氨基酸序列的遺傳變異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 P36、P46、P97 R1、P146基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用設(shè)計(jì)的引物，以挑選的豬肺炎支原體陽性DNA樣本為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，代表性結(jié)果圖片見圖1-4。由圖可見，各基因均擴(kuò)增出了預(yù)期大小的特異性條帶。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-5.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；-.陰性對照。圖3同。M.DNA Marker;1-5.Product of PCR;-. Negative control.The same as Fig.3.

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-9.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；-.陰性對照。M.DNA Marker;1-9. Product of PCR; -. Negative control.

圖3 P97 R1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 Fig.3 PCR amplification of P97 gene R1 region

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-7.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；-.陰性對照。M.DNA Marker; 1-7. Product of PCR; -.Negative control.

表2 屠宰豬豬肺炎支原體基因序列GenBank登錄號Tab.2 Accession number of different gene of M.hyo from slaughter pigs

2.2 P36、P46、P97 R1、P146基因測序結(jié)果

將各基因PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送公司進(jìn)行測序，然后根據(jù)測序峰圖將序列進(jìn)行編輯，結(jié)果表明，獲得P36基因?yàn)?48 bp的完整序列；P46為5′端缺少114 bp(該區(qū)域在GenBank已登錄的13個(gè)序列中僅有2個(gè)序列出現(xiàn)1個(gè)核苷酸的差異，氨基酸序列無差異)、3′端缺少60 bp(該區(qū)域在GenBank已登錄的13個(gè)序列中一致性為100%)，共1 086 bp的基因片段；P97則為包含R1區(qū)在內(nèi)的1 107 bp的部分基因片段；P146則為包含多變區(qū)在內(nèi)的1 312 bp的基因片段。各序列GenBank登錄號見表2。

2.3 P36氨基酸序列比對分析結(jié)果

利用生物軟件Lasergene將測出的P36基因序列與GenBank登錄的，包括3個(gè)疫苗菌株在內(nèi)的9個(gè)豬肺炎支原體P36基因進(jìn)行演繹氨基酸序列比對分析，結(jié)果見圖5。由圖可見各菌株間P36蛋白氨基酸序列同源性均在99%以上。

2.4 P46氨基酸序列比對分析結(jié)果

利用生物軟件Lasergene將測出的P46基因序列與GenBank登錄的，包括3個(gè)疫苗菌株在內(nèi)的13個(gè)豬肺炎支原體P46基因進(jìn)行演繹氨基酸序列的比對分析，結(jié)果見圖6。由圖可見各菌株間P46蛋白氨基酸序列同源性較高，相互之間存在99%以上的一致性。

MG813441-MG813457.屠宰豬豬肺炎支原體菌株。MG813441-MG813457.Strains detected from bronchoalveolar lavage fluid of slaughter pigs.

MG813458-MG813474.屠宰豬豬肺炎支原體菌株。MG813458-MG813474.Strains detected from bronchoalveolar lavage fluid of slaughter pigs.

2.5 P97 R1區(qū)氨基酸序列比對分析結(jié)果

利用生物軟件Lasergene將測出的P97R1區(qū)基因演繹氨基酸序列與GenBank登錄的豬肺炎支原體氨基酸序列進(jìn)行比對分析，同時(shí)統(tǒng)計(jì)各序列R1區(qū)重復(fù)氨基酸的類型及數(shù)量。結(jié)果見圖7、表3。R1區(qū)重復(fù)氨基酸序列數(shù)量在9以下的有3個(gè)Gen-Bank登錄的菌株(該3個(gè)菌株均為加拿大研究人員2003年上傳的菌株)；R1區(qū)包含9～11個(gè)重復(fù)氨基酸序列的菌株有3個(gè)疫苗相關(guān)菌株 168株(11個(gè))、168-L(10個(gè))、J株(9個(gè))，4個(gè)檢測自屠宰豬肺臟的菌株，以及4個(gè)GenBank登錄的非疫苗菌株(1個(gè)2003年上傳序列，2個(gè)2005年上傳序列，1個(gè)2012年上傳序列)；包含14個(gè)以上重復(fù)氨基酸序列的菌株有11個(gè)來自屠宰豬樣本的菌株，5個(gè)GenBank登錄的序列。34個(gè)被比較的序列中，重復(fù)氨基酸序列在14個(gè)以上者占總數(shù)的47%。另外，從圖7和表3可見，包含疫苗菌株J株在內(nèi)的只有9或9個(gè)以下重復(fù)氨基酸序列的4個(gè)菌株間，在重復(fù)氨基酸的類型(AAKPE/AAKPV/TTKPV/TAKPV/AVKPV/GAKPE)和數(shù)量之間只有2個(gè)菌株具有完全的一致性(AY512898、AY512903)。 通過DNAStar生物軟件將R1區(qū)進(jìn)行抗原表位預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含不同類型、數(shù)量重復(fù)氨基酸序列的菌株之間存在明顯差異。尤其是存在16個(gè)以上重復(fù)序列組成的抗原表位與M.hyoJ 株相應(yīng)區(qū)域的抗原表位明顯不同。

MG821209-MG821225.屠宰豬豬肺炎支原體菌株。表3同。MG821209-MG821225.Strains detected from bronchoalveolar lavage fluid of slaughter pigs.The same as Tab.3.

菌株或登錄號Strain or Accession NumberAAKPEAAKPVTTKPVTAKPV/AVKPV/GAKPE合計(jì)TotalAY512898、AY51290343108AY51290234018M.hyo J53109M.hyo 168-L550010CP003802511310AE017244370010MG821224451010MG821225、MG821223550010MG821214730111AY957500650011M.hyo 168650011AY380565550111MG821209651012AY512904660012U27294570012MG821217670013MG821216、821215、821210、821222、821221、821220770014U50901、AE017332770014MG821213、MG821211880016MG821219、MG821218961016AY512900、AY512895890017AY380564980017MG821212980018

2.6 P146多變區(qū)氨基酸序列比對分析結(jié)果

利用生物軟件Lasergene將樣本中測出的P146序列與GenBank登錄的豬肺炎支原體菌株進(jìn)行P146氨基酸序列的比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株間氨基酸序列差異主要集中在2個(gè)重復(fù)氨基酸序列區(qū)(P146 R1 PQ重復(fù)區(qū)、P146 R2 PS重復(fù)區(qū))。2個(gè)重復(fù)區(qū)氨基酸序列同源性比較結(jié)果見圖8，J 株、168株、168-L和2個(gè)GenBank登錄序列(AE017244、DQ088147)、1個(gè)屠宰豬肺臟樣本(MH290015)在R1區(qū)出現(xiàn)較多的氨基酸缺失；168株、168-L株及3個(gè)GenBank登錄序列、6個(gè)屠宰豬肺臟樣本在R2區(qū)出現(xiàn)3～9個(gè)氨基酸的缺失。通過DNAStar生物軟件將P146多變區(qū)氨基酸序列進(jìn)行抗原表位預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)R1、R2區(qū)氨基酸的缺失導(dǎo)致了相應(yīng)區(qū)域抗原表位出現(xiàn)明顯的變化。

MH290001-MH290017.屠宰豬豬肺炎支原體菌株。MH290001-MH290017.Strains detected from bronchoalveolar lavage fluid of slaughter pigs.

3 結(jié)論與討論

豬肺炎支原體P36、P46基因比較保守[14-15]，這在本研究中也得到了相同的結(jié)果。P46是豬肺炎支原體膜表面蛋白,具有種特異性和很強(qiáng)的免疫原性，常作為新型疫苗研究或ELISA抗體檢測診斷抗原的研究靶蛋白[6,16]。P36蛋白是細(xì)胞胞漿蛋白,同樣具有強(qiáng)的免疫原性，但產(chǎn)生抗體的時(shí)間比較晚[14]，P97蛋白是主要參與豬肺炎支原體對豬呼吸道上皮纖毛細(xì)胞黏附的因子[12-13]。 P146蛋白是P97的同源類似物之一,同樣具有黏附纖毛的作用， Bogema等[11]通過免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)P146能被豬肺炎支原體疫苗免疫豬血清和康復(fù)豬血清識別，但目前尚沒有關(guān)于該蛋白的進(jìn)一步研究。Feng 等[17]采用P97 R1、P46、P36 3個(gè)蛋白作為抗原，檢測豬肺炎支原體感染豬的免疫反應(yīng)，證明針對P97R1的IgG出現(xiàn)相對更早、更明顯，且抗P97R1的sIgA濃度最高。此外，也有研究證明，用P97 C末端蛋白免疫生豬可產(chǎn)生特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并可對豬肺炎支原體的攻毒具有較好的保護(hù)作用[8], Okamba等[9]用P97 C末端蛋白通過肌肉和滴鼻免疫小鼠，在血液和肺泡灌洗液均產(chǎn)生明顯的特異性抗體，并認(rèn)為重組P97 C末端蛋白疫苗可能成為控制豬肺炎支原體感染的新策略。豬肺炎支原體在呼吸道是否能夠定殖主要取決于其吸附于生豬氣管纖毛的能力[18]，P97蛋白是主要參與豬肺炎支原體對豬呼吸道上皮纖毛細(xì)胞黏附的因子，其R1區(qū)中的重復(fù)氨基酸序列(AAPKE/V)為P97發(fā)揮纖毛黏附作用所必需的氨基酸序列，該重復(fù)序列在不同菌株間可出現(xiàn)變異并且該變異可影響病原對纖毛的黏附能力[12-13]。 一株豬肺炎支原體要具備纖毛黏附能力，其P97蛋白R1區(qū)至少應(yīng)具備8個(gè)以上的重復(fù)氨基酸序列，并且至少要具備3個(gè)以上重復(fù)序列，該重復(fù)區(qū)才能被抗體識別[13]。豬肺炎支原體黏附生豬支氣管纖毛過程，主要是通過纖毛相應(yīng)受體配位基與豬肺炎支原體P97、P146等黏附因子結(jié)合來實(shí)現(xiàn)[19]。針對P97蛋白的抗體能夠體外抑制豬肺炎支原體對宿主細(xì)胞的黏附[20-21]。P97重復(fù)氨基酸的增加或減少，將會導(dǎo)致蛋白發(fā)生改變，從而干擾免疫系統(tǒng)識別[22]并且支原體某些表面蛋白基因的變異可使其逃避動物抗體的攻擊[23]。此外，不同豬場流行菌株P(guān)97黏附因子R1區(qū)氨基酸重復(fù)數(shù)量可能存在差異，多數(shù)豬場可能有2個(gè)以上的菌株同時(shí)存在，且同一頭豬感染2個(gè)以上菌株后，肺臟病變更嚴(yán)重[24]。

豬肺炎支原體基因組A、T含量高，且存在較多重復(fù)序列，PCR擴(kuò)增和測序均存在較大難度。本試驗(yàn)首次對湖南生豬豬肺炎支原體感染菌株遺傳變異情況進(jìn)行了初步調(diào)查以及重要蛋白氨基酸序列分析。17個(gè)樣本中有11個(gè)樣本豬肺炎支原體P97 R1區(qū)重復(fù)序列數(shù)量比GenBank登錄的3個(gè)疫苗相關(guān)菌株[25-28](J株、168株、168-L株)要多3～10個(gè)不等，但與豬肺炎支原體活疫苗菌株RM48株及Z株比較，17個(gè)樣本中豬肺炎支原體除有1株P(guān)97R1區(qū)比R48株、Z株(17個(gè)重復(fù)序列[28])多1個(gè)重復(fù)序列外，其他都低于17個(gè)重復(fù)序列。此外，樣本與M.hyoJ株、168株、168-L株之間P146均存在較大的差異，168株、168-L株在R1、R2重復(fù)區(qū)均存在氨基酸的缺失，J株在R1重復(fù)區(qū)存在氨基酸缺失，至于其他疫苗菌株，由于沒有相應(yīng)基因序列上傳至GenBank，所以未進(jìn)行比較分析。

已有研究表明，豬肺炎支原體滅活疫苗或活苗均可以誘導(dǎo)生豬產(chǎn)生系統(tǒng)和局部的免疫反應(yīng)[10,29-30]，并且可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對P36、P46、P97 R1區(qū)蛋白的抗體[10]。但當(dāng)前豬肺炎支原體滅疫苗或活苗僅可減輕生豬感染豬肺炎支原體的臨床癥狀，改善健康水平，提高飼料轉(zhuǎn)化率，并不能完全阻止該病原的感染傳播[3-5,22]。是否與菌株間某一個(gè)或某一些蛋白的變異存在關(guān)系，尚沒有詳細(xì)的報(bào)道。鑒于P97、P146等蛋白的作用與特性，提示開展P97、P146等黏附因子的氨基酸序列篩選和研究或許能進(jìn)一步通過疫苗阻止豬肺炎支原體對氣管纖毛的黏附，從而進(jìn)一步提高疫苗的免疫效果。本研究進(jìn)一步豐富了豬豬肺炎支原體4個(gè)重要功能蛋白的序列資料，首次對湖南省生豬豬肺炎支原體感染菌株遺傳變異情況進(jìn)行了初步調(diào)查。