蘇木乙酸乙酯提取液靶向調(diào)控miRNA-99a抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制研究*

于 玲 曹麗娟 孫 靜 周亞濱△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040）

心源性死亡仍然是目前世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因，據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，每年有超過(guò)1 700萬(wàn)人死于心血管疾病［1］。作為心源性死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素之一，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變是導(dǎo)致管腔狹窄、閉塞的主要原因，能夠引發(fā)心肌缺血或心肌壞死，增加冠狀動(dòng)脈不良事件的風(fēng)險(xiǎn)［2］。因此，減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變是改善患者預(yù)后的主要途徑之一。

作為血管壁最豐富的固有細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）在維持血管張力和血管壁結(jié)構(gòu)的構(gòu)成中扮演著重要的角色。既往研究證實(shí)，VSMC的過(guò)度增殖是造成動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄和肺動(dòng)脈高壓的病理學(xué)基礎(chǔ)，故調(diào)控VSMC的增殖和凋亡，是預(yù)防冠狀動(dòng)脈病變的關(guān)鍵［3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，蘇木乙酸乙酯提取液（SAEE）不僅能夠抑制炎性因子的分泌，還能夠改善動(dòng)脈粥樣硬化大鼠腹主動(dòng)脈的組織形態(tài)和內(nèi)皮細(xì)胞功能，并且抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表達(dá)，從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［4］。因此本研究以細(xì)胞中miRNA-99a的表達(dá)為媒介，并通過(guò)觀察VSMC的增殖和凋亡水平，進(jìn)一步探索SAEE的抗動(dòng)脈硬化作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 大鼠主動(dòng)脈VSMC購(gòu)于湖南豐暉生物科技有限公司，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2。每3日換1次培養(yǎng)液，并以0.25%的胰酶消化傳代，取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器 蘇木生藥購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，經(jīng)乙醇提取、乙酸乙酯萃取后得SAEE（生藥質(zhì)量濃度設(shè)置為200 μg/mL）；氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）購(gòu)于廣州奕元生物科技有限公司；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)于上海酶聯(lián)生物研究所；Hilymax轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于上海東仁化學(xué)科技有限公司；MTT細(xì)胞增殖試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、MMP-1、TIMP-1、β-actin 單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)于北京博爾邁生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 miRNA-99a模擬劑（mimics）和抑制劑（inhibitor）由上海拓然生物科技公司設(shè)計(jì)并化學(xué)合成，按照試劑盒設(shè)定的轉(zhuǎn)染濃度，分別將miRNA-99a mimics和miRNA-99a inhibitor配制成終濃度為80 nmol/L和50 nmol/L的溶液。分別加入3 μL Hilymax轉(zhuǎn)染試劑，混勻，冰上靜置20 min。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照1×105/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，更換為無(wú)胎牛血清的無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為5組，空白組（20%無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM），模型組（50 μg/mL ox-LDL），SAEE 組（200 μg/mL SAEE），miRNA-99a mimics組（80 nmol/L miRNA-99a micmics）和 miRNA-99a inhibitor組（50 nmol/L miRNA-99a inhibitor）。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 1）MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取不同處理方法干預(yù)后VSMC細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)平行設(shè)置24、48、72、96 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。每孔加入 20 μL MTT（5 mg/mL）后繼續(xù)孵育 1 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔570 nm處吸光度（OD值）。2）流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將不同處理方法干預(yù)后24 h的VSMC細(xì)胞接種于96孔板中，用1×Binding buffer配制成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。分別加入5 μL Annexin V和10 μL的PI溶液染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。3）Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)：各組細(xì)胞經(jīng)處理48 h后，用PBS沖洗2次，加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液洗滌5次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯影后，凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖片并分析各蛋白條帶灰度值。4）RT-PCR檢測(cè)miRNA-99a的表達(dá)：各組細(xì)胞經(jīng)處理48 h后，Trizol一步法提取總RNA，經(jīng)純化、定量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green I real-time PCR檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)如下（上海生工公司合成）：miRNA-99a上游5′-CATTACTAAACCCGTAGATCCGAT-3′；下游 5′-TAT GGTTTTGACGACTGTGTGAT-3′；U6 上 游 5′-ATTGGAA CGATACAGAGAAGATT-3′；下游 5′-GGAACGC TTCACGAATTTG-3′。PCR循環(huán)條件為 95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，并采用2-△△CT法分析miRNA-99a的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組數(shù)據(jù)以（±s）表示，符合正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，則組間比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組VSMC細(xì)胞增殖情況的比較 見(jiàn)表1。ox-LDL刺激后的VSMC細(xì)胞增殖能力顯著增加，4個(gè)時(shí)間段與空白組比較，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；miRNA-99a inhibitor組中VSMC細(xì)胞增殖能力顯著增加，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而SAEE組與miRNA-99a mimics組均能顯著抑制VSMC細(xì)胞增殖，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 各組VSMC細(xì)胞凋亡率的比較 見(jiàn)表2，圖1。模型組中VSMC細(xì)胞凋亡率顯著增加，其中早期凋亡與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而晚期凋亡和總凋亡率與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；miRNA-99a inhibitor組中晚期凋亡和總凋亡率亦顯著增加，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。SAEE組與miRNA-99a mimics組均能顯著抑制VSMC細(xì)胞凋亡，其中以晚期凋亡和總凋亡率顯著，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），早期凋亡與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組VSMC細(xì)胞增殖情況的比較（吸光度值，x±s）

表1 各組VSMC細(xì)胞增殖情況的比較（吸光度值，x±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6 24 h 48 h 72 h 96 h 0.34±0.11 0.68±0.12 1.08±0.23 1.43±0.18 0.51±0.06△△ 1.07±0.13△△ 1.52±0.23△△ 2.02±1.10△△0.37±0.03**0.72±0.10**1.08±0.18** 1.45±0.23**miRNA-99a mimics組 6 0.40±0.03**0.79±0.11**1.14±0.13**1.52±0.17**miRNA-99a inhibitor組 6 0.64±0.06**1.32±0.23**1.86±0.15**2.44±0.29**

表2 各組VSMC細(xì)胞凋亡率的比較（%，x±s）

表2 各組VSMC細(xì)胞凋亡率的比較（%，x±s）

組別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6總凋亡率 早凋 晚凋6.64±1.08 1.96±0.03 4.68±1.10 11.66±1.60△△ 1.94±0.08 9.71±1.59△△6.98±1.28**2.04±0.12 4.94±1.18**miRNA-99a mimics組 6 8.72±1.01**2.04±0.09 6.68±1.02**miRNA-99a inhibitor組 6 14.03±1.42**1.86±0.09 12.17±1.40**

圖1 各組VSMC細(xì)胞的流式凋亡結(jié)果

2.3 各組VSMC細(xì)胞中 Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)表3，圖2。模型組中Ki-67、PCNA、Bax蛋白的表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值顯著增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；SAEE 組與 miRNA-99a mimics組中Ki-67、PCNA、Bax蛋白的表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著增加，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），miRNA-99a inhibitor組中Ki-67、PCNA、Bax蛋白的表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值顯著增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 各組VSMC細(xì)胞中Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較（x±s）

表3 各組VSMC細(xì)胞中Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較（x±s）

組 別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6 Bcl-2 β-actinBax/Bcl-2 1.23±0.24 0.18±0.03 0.55±0.11△△ 1.69±0.43△△1.03±0.19**0.33±0.07**miRNA-99a mimics組 6 0.77±0.11** 0.76±0.25** 0.44±0.05** 0.89±0.11**0.50±0.09**miRNA-99a inhibitor組 6 1.50±0.23** 2.01±0.40** 1.21±0.26** 0.30±0.04**4.05±0.89**Ki-67 β-actin PCNA β-actin Bax β-actin 0.30±0.09 0.37±0.10 0.22±0.03 1.12±0.27△△ 1.41±0.28△△ 0.90±0.15△△0.58±0.14** 0.62±0.15** 0.34±0.04**

圖2 各組VSMC細(xì)胞中Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較

2.4 各組VSMC細(xì)胞中MMP-1、TIMP-1蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)表4。模型組中MMP-1蛋白的表達(dá)及MMP-1/TIMP-1的比值顯著增加，TIMP-1蛋白的表達(dá)顯著降低，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SAEE組與miRNA-99a mimics組中MMP-1蛋白的表達(dá)及MMP-1/TIMP-1的比值顯著降低，TIMP-1蛋白的表達(dá)顯著增加，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），miRNA-99a inhibitor組中 MMP-1 蛋白的表達(dá)及MMP-1/TIMP-1的比值顯著增加，TIMP-1蛋白的表達(dá)顯著降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表4 各組VSMC細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)的比較（x±s）

表4 各組VSMC細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)的比較（x±s）

組 別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6 MMP-1 β-actin TIMP-1 β-actin MMP-1/TIMP-1 0.39±0.06 1.01±0.18 0.39±0.05 1.24±0.22△△ 0.49±0.14△△ 2.76±1.05△△0.62±0.12** 1.14±0.27** 0.59±0.23**miRNA-99a mimics組 6 0.70±0.23** 0.85±0.09** 0.83±0.28**miRNA-99a inhibitor組 6 1.53±0.22** 0.22±0.03** 7.25±1.27**

圖3 各組VSMC細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)的比較

2.5 各組VSMC細(xì)胞中miRNA-99a表達(dá)的比較 見(jiàn)表5。與空白組比較，模型組中miRNA-99a的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；SAEE能夠顯著增加VSMC細(xì)胞中miRNA-99a的表達(dá)，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與 miRNA-99a mimics作用相同，與miRNA-99a inhibitor作用相反。

表5 各組VSMC細(xì)胞中miRNA-99a表達(dá)的比較（x±s）

表5 各組VSMC細(xì)胞中miRNA-99a表達(dá)的比較（x±s）

組 別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6 miRNA-99a的相對(duì)表達(dá)量1.03±0.08 0.57±0.11△△3.09±0.15**miRNA-99a mimics組 6 3.58±0.40**miRNA-99a inhibitor組 6 0.24±0.04**

3 討 論

脈粥樣硬化形成的初期，低密度脂蛋白匯集于斑塊的中央部位，其內(nèi)的不飽和脂肪酸在自由基和其他致氧因素作用下，經(jīng)過(guò)一系列的氧化和修飾過(guò)程，最后形成 ox-LDL［5］。 ox-LDL 能夠通過(guò)刺激 VSMC、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放多種趨化因子和炎性因子，是促進(jìn)斑塊的形成和失穩(wěn)的關(guān)鍵［6］。本研究采用ox-LDL刺激的方式復(fù)制VSMC模型，能夠更加可靠地反映動(dòng)脈粥樣硬化形成及失穩(wěn)過(guò)程中的病理變化。

VSMC的增殖能夠引起內(nèi)膜增厚和斑塊形成，是管腔狹窄和動(dòng)脈粥樣硬化的病理學(xué)基礎(chǔ)。Ki-67與細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程密切相關(guān)，是目前公認(rèn)的檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)志物［7］。作為DNA復(fù)制過(guò)程和細(xì)胞增殖的關(guān)鍵標(biāo)志物之一，PCNA是一種分子量為36KD的DNA聚合酶δ的輔助蛋白，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，在調(diào)控細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)和甲基化的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［8］。雖然VSMC的凋亡能在一定程度上抗衡增殖引起的斑塊形成，但是近年來(lái)大量的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡亦與動(dòng)脈粥樣硬化的生成和穩(wěn)定性密切相關(guān)［9］。 VSMC 的凋亡能夠?qū)е?IL-8、IL-1α 等細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和加重斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)，令斑塊失穩(wěn)；同時(shí)，晚期凋亡的VSMC能夠增加凝血酶的合成和局部凝血酶的活性，促進(jìn)血栓形成［10］。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的主要成分，其能夠阻止線粒體細(xì)胞色素C釋放發(fā)揮抗凋亡的作用［11］。Bax作為Bcl-2家族的前凋亡蛋白，能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C和促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12］。

細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽的主要成分之一［13］。ECM的合成、降解和成分的穩(wěn)定，取決于MMP和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）之間的動(dòng)態(tài)平衡。在生理狀態(tài)下MMP-1處于低濃度水平，而在炎癥因子的刺激下MMP-1的分泌持續(xù)增加，TIMP-1能夠結(jié)合MMP-1形成非共價(jià)的復(fù)合物，限制其降解膠原的作用［14］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，SAEE能顯著抑制VSMC細(xì)胞增殖和晚期凋亡，降低細(xì)胞中Ki-67、PCNA、Bax、MMP-1 蛋白的表達(dá)及 Bax/Bcl-2、MMP-1/TIMP-1的比值，增加Bcl-2和TIMP-1蛋白的表達(dá)，說(shuō)明SAEE具有促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定和防止斑塊的脫落或破裂的作用，其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)控VSMC細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降解實(shí)現(xiàn)的。

近年來(lái)大量的的研究表明，MicroRNA在動(dòng)脈硬化的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，發(fā)揮著重要的作用［15］。其中miRNA-99a能夠通過(guò)抑制IGF-1R and mTOR信號(hào)通路的活化，從而抑制VSMC的增殖，延緩動(dòng)脈硬化的發(fā)生與發(fā)展［16］。本研究結(jié)果顯示，SAEE能夠顯著增加VSMC細(xì)胞中miRNA-99a的表達(dá)，與miRNA-99a mimics組結(jié)果相同，與miRNA-99a inhibitor結(jié)果相反，因此我們推斷SAEE調(diào)控VSMC細(xì)胞增殖、凋亡和ECM的合成、降解的作用，可能是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中miRNA-99a的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，SAEE能夠抑制VSMC細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定和防止纖維帽的破裂，其作用機(jī)制是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中miRNA-99a的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。