李云琴，陳中華，原曉龍，王 毅

(云南省林業(yè)科學(xué)院云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

神經(jīng)酸(Nervonic acid，NA)具有促進(jìn)大腦發(fā)育、改善記憶、調(diào)節(jié)血脂等功效，對(duì)心血管疾病及免疫性疾病的治療效果顯著[1-3]，是大腦中神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維的核心天然成分，神經(jīng)酸還可以作為香料原料加以利用[4]。雖然神經(jīng)酸用途廣泛，對(duì)人體健康有益，但難以通過人體自身合成，需要從外界攝取。神經(jīng)酸最早在鯊魚油中獲取[5]，但鯊魚資源稀少且成本高昂，加之國(guó)際社會(huì)禁止大量捕殺鯊魚，神經(jīng)酸的來源受到限制，造成資源緊缺，市場(chǎng)供不應(yīng)求。通過化學(xué)方法[6]和生物化學(xué)[2]合成神經(jīng)酸，終因副產(chǎn)物多、工藝路線長(zhǎng)、得率低而失敗。后來，研究發(fā)現(xiàn)一些植物中富含神經(jīng)酸，如蒜頭果(Malaniaoleifera)及盾葉木(Macarangaadenantha)種仁，雞爪槭(Acerpalmatum)果實(shí)及遏藍(lán)菜(Thlaspiarvense)種子[7]、元寶楓(Acertruncatum)種子[8]等。而我國(guó)特有的鐵青樹科(Olacaceae)蒜頭果屬單種屬植物蒜頭果，為目前發(fā)現(xiàn)的自然界中神經(jīng)酸含量最高的植物[9]。研究顯示，蒜頭果種仁含油率高達(dá)64.5%[10]，其果仁油脂中神經(jīng)酸含量高達(dá)60%以上。因此，從蒜頭果果仁中提取神經(jīng)酸將為可持續(xù)開發(fā)利用植物神經(jīng)酸開創(chuàng)一條新路[11]。

神經(jīng)酸為超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸(VLCMFA)[12]。VLCMFA以油酸為底物，通過超長(zhǎng)鏈脂肪酸鏈延長(zhǎng)循環(huán)進(jìn)行碳鏈的延長(zhǎng)，每循環(huán)1次延長(zhǎng)2個(gè)碳原子，相繼形成鱈油酸(20∶1Δ9c)、芥酸(22∶1Δ13c)、神經(jīng)酸(24∶1Δ15c)[3]。這個(gè)延長(zhǎng)過程受3-酮酯酰-CoA合酶、3-酮酯酰-CoA還原酶、3-羥酯酰-CoA脫水酶和羥酯酰-CoA還原酶形成的酶復(fù)合體的組合催化和調(diào)控，其中3-酮酯酰-CoA 合酶(KCS)目前被認(rèn)為是關(guān)鍵催化步驟[13-15]，在整個(gè)超長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶復(fù)合體中起到了極其重要的作用，因此也作為限速酶被廣泛應(yīng)用[16-18]。目前對(duì)KCS的研究主要在油菜(Brassicanapus)[18]、大豆(Glycinemax)[19-20]、油桐(Verniciafordii)[21]、滇牡丹(Paeoniadelavayi)[22]等傳統(tǒng)油料植物中，而對(duì)蒜頭果的KCS相關(guān)研究未見報(bào)道，特別是超長(zhǎng)鏈KCS在蒜頭果中神經(jīng)酸生物合成的作用并不清楚。因此，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得蒜頭果果實(shí)中超長(zhǎng)鏈KCS基因序列，同時(shí)，利用RT-PCR克隆獲得該基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析，為最終揭示蒜頭果神經(jīng)酸生物合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所需蒜頭果樹生長(zhǎng)于文山州廣南縣舊莫鄉(xiāng)巖臘村，采集花謝后1、2、3、4個(gè)月的蒜頭果果實(shí)為材料，并采集花謝2個(gè)月后蒜頭果樹葉作為對(duì)照。樣品采集后即刻放入液氮中保存。

總RNA小量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司，pESY-T3克隆試劑盒與感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，LA-Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。電泳儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組分析

將花謝后3個(gè)月的蒜頭果果實(shí)送到華大基因通過Illumina Hiseq2000平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)序列進(jìn)行組裝拼接后，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組Unigene進(jìn)行本地Blast,尋找蒜頭果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中的KCS基因，同時(shí)，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的Unigene注釋到NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索注釋結(jié)果中的KCS基因，并對(duì)獲得的Unigene進(jìn)行分析。

1.2.2 提取RNA

提取蒜頭果果實(shí)RNA，按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。分別提取每個(gè)樣品的RNA后，用1%的瓊脂膠進(jìn)行電泳檢測(cè)RNA完整性。并分別取1 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。將各樣品cDNA保存在-20℃冰箱備用。

1.2.3 蒜頭果KCS基因克隆

通過對(duì)蒜頭果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，獲得表達(dá)量高、并擁有完整開放閱讀框的KCS基因序列。以獲得的KCS基因序列,設(shè)計(jì)含有起始密碼子的特異引物(MoKCSF:5′-ATGGCTCAACCAAAGCTTGT-3′)和含有終止密碼子的特異引物(MoKCSR:5′-TTAGATGGCCGAGACTTGCG-3′)。以蒜頭果果實(shí)cDNA 為模板，用HiFi高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)后將目的片段連接到pGMT載體上，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌落PCR篩選出陽性克隆，送上海生工測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，最終通過序列比對(duì)確定獲得KCS全長(zhǎng)基因片段，并永久保存在-80℃冰箱。

1.2.4 蒜頭果KCS蛋白生物信息學(xué)分析

用NCBI在線軟件ORFFinder對(duì)KCS基因進(jìn)行蛋白翻譯后，并用在線軟件ProtParam對(duì)KCS蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，KCS保守結(jié)構(gòu)域分析由在線蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析軟件完成，其氨基酸同源序列比對(duì)則用DNAMAN 軟件完成，最終確定KCS的保守結(jié)構(gòu)域。并將蒜頭果KCS蛋白與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)已知其他植物的超長(zhǎng)鏈KCS蛋白進(jìn)行多重比對(duì)后，采用MEGA7中自帶的ClusterW進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)后，采用Neighbor-joining算法(自檢舉1 000 次)，繪制并進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.2.5 蒜頭果KCS基因不同組織表達(dá)分析

分別取蒜頭果不同組織的RNA 2 μg，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明合成cDNA第一條鏈。以不同組織的cDNA為模板，用特異引物TMoKCSF(5′-ATCTTTGGTGTTCTTGATCG-3′)和TMoKCSR(5′-ATTGAATAAG CTACAATTGA-3′)進(jìn)行熒光定量PCR分析，并以elongation factor 1-alpha基因作為內(nèi)參基因，具體反應(yīng)體系如下：分別向PCR管中加入2×SYBR Green master mix(含ROX) 12.5 μL； 引物TMo-KCSF和TMoKCSR各0.5 μL，cDNA 1 μL,最終用 PCR water nucle-free補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性溫度95℃，時(shí)間10 min，然后，變性溫度95℃，時(shí)間15 s；退火和延伸溫度為 60℃，時(shí)間為30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，收集信息進(jìn)行Ct值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組分析

通過Illumina Hiseq2000平臺(tái)測(cè)序?qū)λ忸^果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總計(jì)產(chǎn)出6 299 384 146 bp數(shù)據(jù)。組裝結(jié)果得到165 110個(gè)Unigene。對(duì)所獲得的Unigene進(jìn)行本地Blast以及在NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析， 最終獲得13個(gè)可能的KCS基因片段(見表1)。

表1 轉(zhuǎn)錄組分析得到的KCS基因信息

由表1可知，根據(jù)已知其他植物KCS基因大小在1 kb以上,從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中最終得到大于1 kb的KCS基因片段有2個(gè)。通過蛋白序列分析以及表達(dá)量分析最后確定c55526_g1作為后續(xù)克隆分析的對(duì)象。

2.2 RNA提取與基因克隆

將蒜頭果不同時(shí)期的果實(shí)和葉片樣品，經(jīng)過液氮磨碎后，用RNA提取試劑盒提取各樣品RNA，并進(jìn)行電泳檢測(cè)查看其完整性，電泳結(jié)果見圖1。

注：F1、F2、F3、F4分別為花謝1、2、3、4個(gè)月后蒜頭果果實(shí); Leaf為花謝2個(gè)月后蒜頭果樹葉。

圖1 提取的RNA電泳結(jié)果

由圖1可看出，所有樣品均有完整的28S和18S兩個(gè)條帶，說明RNA完整性比較好。條帶明亮度不一樣說明提取的各個(gè)樣品RNA濃度不一樣。用分光光度計(jì)測(cè)量各樣品RNA在260、280 nm下的吸光度。檢測(cè)顯示各樣品OD260/OD280值均在1.8～2.1之間，適合于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的KCS基因片段序列的特異引物(MoKCSF和MoKCSR)，以MoKCSF和MoKCSR為引物，以蒜頭果花謝2個(gè)月后的果實(shí)cDNA為模板，進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增出來的目的片段連接到克隆載體中，并進(jìn)行測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證。最終獲得 1 539 bp的蒜頭果KCS基因全長(zhǎng)cDNA，并命名為MoKCS1。

2.3 蒜頭果KCS蛋白序列分析

用NCBI在線軟件ORFFinder對(duì)KCS基因進(jìn)行蛋白翻譯后，并用在線軟件ProtParam對(duì)KCS蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示KCS基因共編碼512個(gè)氨基酸，其相對(duì)分子質(zhì)量為57 730.49，等電點(diǎn)為9.39。利用NCBI在線結(jié)構(gòu)域分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)以及DNAMAN軟件對(duì)與KCS親緣關(guān)系近的其他植物KCS蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，見圖2。由圖2可以看出，該蛋白與已報(bào)道的KCS含有KCS家族的3個(gè)功能保守結(jié)構(gòu)域“FGNTSSSS”“GSGFKCNSAVW”和“GMGCSA”，表明該蛋白屬于KCS 家族蛋白。蒜頭果KCS與榴蓮(Duriozibethinus)KCS的蛋白序列同源性為80.66%，與芝麻(Sesamumindicum)KCS同源性為79.49%，與山黃麻(Tremaorientalis) KCS同源性為78.72%。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將推導(dǎo)出來的KCS蛋白序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)進(jìn)行比對(duì)，用MEGA7中自帶的ClusterW進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)后，采用Neighbor-joining算法(自檢舉1 000 次)，繪制出蒜頭果KCS與其他植物的KCS蛋白的進(jìn)化樹，見圖3。從圖3可以看出，蒜頭果的KCS蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹上自成一支，與目前發(fā)現(xiàn)的KCS蛋白的親緣關(guān)系都相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)KCS基因不同組織表達(dá)

為了解KCS基因在蒜頭果不同個(gè)體之間的表達(dá)差異，以特異引物TMoKCSF和TMoKCSR，用熒光定量PCR檢測(cè)KCS基因在不同樣品中的表達(dá)情況，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，KCS基因在不同個(gè)體中以花謝3個(gè)月后蒜頭果果實(shí)表達(dá)量最高，花謝2個(gè)月后蒜頭果果實(shí)次之，而在花謝1個(gè)月及4個(gè)月后的蒜頭果果實(shí)和蒜頭果葉中表達(dá)都非常微弱。

MoKCSMAQPKLVKPLIAP---SASPRLPDFKQGVKLKYVKLGYHYLVTHAMYLFLPPLAVIAAVQDzKCSMSESYPSTPLIPK---STSYKLPDFKQSVKLKYVKLGYHYLITHGMYIFLTPLAVVIAAQSiKCSMSETTASTPLIPP---SSSRKLPDFKQSVKLKYVKLGYHYLITHGMYLFLSPLVVVIAAQToKCSMSDSNPKTPLVPPQSSSSSRKLPDFKQSVKLKYVKLGYHYLITHGMYLFLSPLLIVIAAQ?.??.?.?.???????????????????.????.????..??MoKCSLSTFSLQDVHDLLGQLRYNLISVILCSSTLVFLSTLYFLTRPRPVYLVDFSCFKPDDDDKDzKCSLSTFSLQDLHDLWDHLRFNLISVILCSALLVFFSTLYFLTRPRPVFLVDFSCYKPDDA-RSiKCSVSTFSLQDLYVLWDHLRFNLISVIVCSALLVFLSTVYFLTRPRPVYLVNFSCYKPNDD-RToKCSVSTFSLQDVHDLWDHLRFNLISVILCSTLLVFLLTLYFLTRPRPVYLVDFSCYKPEDA-R.???????.?.??.??????.??.????.?????????.?????.???.MoKCSKCSWQRFMKCSESRGTFTEENIEFQRKIMARSGIGESTYLPPAVMKIPPNSSMAEAREEADzKCSKCTRQIFMERSRLTGTFTEENLEFQRKILERSGLGESTYLPEAVLRVPPNPCMAEARKEASiKCSKCTRQIFMERSRLTGTFTEENLEFQRKILERSGLGESTYLPEAVLRVPPNPCMAEARKEAToKCSKCTRQIFMDRSRLTGTFTEENLEFQRKILERSGLGESTYLPEAVLRVPPNPCMAEARKEA??.???????????.??????.???.?????????...???.???????MoKCSKMIIFGVLDRLFEKTSVKPKDISILIVNCSLFNPVPSLSAMVVNHYKLRGNTRTYNLGGMDzKCSETVMFGALDQLFEKTCLKPKDIGILIVNCSLFNPTPSLSAMVINHYNLRGNIISYNLGGMSiKCSETVMFGAIDELLAKTSLKPKDIGILIVNCSLFNPTPSLSAMVINHYKLRGNIISYNLGGMToKCSELVMFGALDQLFEKTSLKPKDIGILIVNCSLFNPTPSLSAMIVNHYKLRGNIISYNLGGM..??.????..??????????????????????..???????.??????MoKCSGCSAGLISIDLAKDLLRVHPNSYALVVSMESITMNWYFGNERSMIVPNCLFRMGGAAVLLDzKCSGCSAGLISIDLAKDLLLAHPNSYALVISMENITLNWYFGNERSMLVSNCLFRMGGAAILLSiKCSGCSAGLISIDLAKDLLQVHPNTYALVISMENITLNWYFGNERSMLVSNCLFRMGGAAILLToKCSGCSAGLISIDLAKDLLQVHPNSYALVISMENITLNWYFGNDRSMLVSNCLFRMGGAAILL???????????????????.????.?????.??????.???.???????????.??MoKCSSNKMSDRWHSKYKLVHTVRTHKGSDDKCYTCVTQREDSIGKIGISLSKDLMAVAGDALKADzKCSSNKRSDGWRSKYRLVQTVRTHKGADDKCFTCVTQKEDSTGRIGVSLSKDLMAVAGDALKTSiKCSSNKRSDYWRSKYRLVHTVRTHKGSDDKCFSCVTQMEDSKGKIGVALSKDLMAVAGDALKTToKCSSNKRSDRWRSKYQLVHTVRTNKGADDKCFSCVTQKEDDMGKIGVSLSKDLMAVAGDALKT??????.???.??.????.??.????..???????.??..??????????????.MoKCSNITTLGPLVLPMSEQLLFFATLVGRKFFKVKVKPYIPDFKLAFEHFCIHAGGRAVLDELQDzKCSNITTLGPLVLPMSEQLLFFATLVARKLFKMKVKPYIPDFKLAFEHFCIHAGGRAVLDELESiKCSNITTLGPLVLPMSEQLLFFATLVGKKLFKMKLKPYIPDFKLAFEHFCIHAGGRAVLDELEToKCSNITTLGPLVLPMSEQLLFFATLVGKKLFKMKLKPYIPDFKLAFEHFCIHAGGRAVLDELE???????????????????????.???.?.???????????????????????????.MoKCSKNLQLTDWHIEPSRMTLYRFGNTSSSSLWYELAYTEAKGRVKKGDRTWQIAFGSGFKCNSDzKCSKNLQLSDWHMEPSRMTLYRFGNTSSSSLWYELAYTEAKGRVRKGDRTWQIAFGSGFKCNSSiKCSKNLQLSDWHMEPSRMTLYRFGNTSSSSLWYELAYSEAKGRIKRGDRTWQIAFGSGFKCNSToKCSKNLQLSDWHMEPSRMTLHRFGNTSSSSLWYELAYSEAKGRIRKGDRTWQIAFGSGFKCNS?????.???.???????????????????????.?????...?????????????????MoKCSAVWEALRTINPAKEKNPWMTEIHQFPINVPQVSAI--DzKCSAVWKALRTINPAKEKNPWMDEIHQFPVDVPKVSAI--SiKCSAVWKALRTINPAKEKNPWMDEIHQFPVEVPKVSAI--ToKCSAVWKAIRTVNPAKEKNPWMDEIHQFPVDVPKVSALKA????.??.????????????????.??.???.

注：MoKCS.蒜頭果KCS(登錄號(hào)：MK210592);DzKCS.榴蓮KCS(登錄號(hào)：XP_022729498.1)；SiKCS.芝麻KCS(登錄號(hào)：XP_011081914.1)；ToKCS.山黃麻KCS(登錄號(hào)：PON90748.1)。

圖2 KCS蛋白序列比對(duì)

圖3 蒜頭果KCS與其他植物KCS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

注：MoF1、MoF2、MoF3、MoF4分別為花謝1、2、3、4個(gè)月后蒜頭果果實(shí)KCS基因;MoLe為花謝2個(gè)月后蒜頭果樹葉KCS基因。

圖4 蒜頭果KCS基因表達(dá)情況

3 討 論

神經(jīng)酸(C24∶1)具有獨(dú)特的工業(yè)用途和潛在的藥用保健功效，近年來得到了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。特別是從植物中獲取神經(jīng)酸受到許多研究者的青睞。雖然很多植物含有神經(jīng)酸，但是大多含量很低，蒜頭果是目前神經(jīng)酸含量最高的植物，因此可以在揭示蒜頭果中神經(jīng)酸生物合成機(jī)理的情況下，利用分子輔助育種等方式培育出高產(chǎn)神經(jīng)酸的蒜頭果新品種，或利用基因工程通過異源表達(dá)的方式利用酵母[23-24]大量獲得神經(jīng)酸。因此，本研究開展蒜頭果中神經(jīng)酸生物合成關(guān)鍵酶KCS基因的克隆及表達(dá)分析。

目前已有一些關(guān)于KCS基因通過異源表達(dá)提高神經(jīng)酸含量的研究，如Guo等[18]報(bào)道通過引入銀扇草的KCS基因來增加酵母和轉(zhuǎn)基因植物中神經(jīng)酸含量；Taylor等[25]報(bào)道了在碎米薺屬油籽中，一種KCS基因的分子克隆和特性，以及其在碎米薺屬油籽中的異源表達(dá)，為潛在的醫(yī)療和工業(yè)用途提供高神經(jīng)酸油。針對(duì)MoKCS基因，未來的研究可以將MoKCS基因?qū)肽壳坝椭弋a(chǎn)的植物中，通過MoKCS及超長(zhǎng)鏈脂肪酸生物合成復(fù)合體合成神經(jīng)酸；同時(shí)，也可以將MoKCS導(dǎo)入目前已經(jīng)開發(fā)出來的高產(chǎn)油脂酵母中，通過酵母發(fā)酵的方式獲得神經(jīng)酸。最終為神經(jīng)酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)首先獲得蒜頭果果實(shí)中KCS基因序列，并利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得全長(zhǎng)開放閱讀框MoKCS1，其全長(zhǎng)1 539 bp，編碼含512個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，MoKCS1含有KCS蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域“FGNTSSSS”“GSGFKCNSAVW”和“GMGCSA”，與已報(bào)道的KCS具有高度一致性，表明該蛋白屬于KCS家族蛋白。蒜頭果KCS與榴蓮(Duriozibethinus)KCS的蛋白序列同源性最高，為80.66%，與芝麻(Sesamumindicum)和山黃麻(Tremaorientalis)KCS同源性分別為79.49%、78.72%。通過與NCBI中已知KCS構(gòu)建分子進(jìn)化樹分析，顯示MoKCS1非常特殊，自成一支，說明MoKCS1非常特殊。熒光定量PCR顯示MoKCS1在不同個(gè)體中以花謝3個(gè)月的蒜頭果果實(shí)表達(dá)量最高，而花謝3個(gè)月正是蒜頭果果實(shí)膨大期，神經(jīng)酸的累積期。這說明MoKCS1與蒜頭果神經(jīng)酸生物合成密切相關(guān)。