張 帥章超樺,2,3,4高加龍,2,3,4秦小明,2,3,4鄭惠娜,2,3,4郝記明,2,3,4張 靜,2,3,4

(1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 湛江 524088；3. 廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088； 4. 國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心〔湛江〕，廣東 湛江 524088)

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)[1]，早在2010年中國15歲以上人群人均消耗純酒精量就高達(dá)6.7 L，而且呈逐年上升趨勢。過量飲酒會(huì)造機(jī)體酒精中毒，引起組織器官或者免疫改變，導(dǎo)致各種酒精性疾病。2016年全球有300多萬人因過量飲用酒精而死亡[2]。目前對(duì)于急性酒精性肝病的預(yù)防及治療的研究很多，其中包括不少對(duì)天然提取物解酒護(hù)肝的研究，如葛根、枳椇子[3]、姜黃[4]、朝鮮薊[5]等植物提取物，玉米肽、大豆肽等小分子多肽物質(zhì)[6]12-24，牡蠣[7]、珍珠貝[8]、貽貝[9]、河蜆[10-13]等水產(chǎn)動(dòng)物酶解產(chǎn)物或提取物。

河蜆(Corbiculafluminea)，雙殼類軟體動(dòng)物，又稱黃蜆、扁螺等，常棲息于淡水或咸淡水中，其可食部位味道鮮美，營養(yǎng)豐富，蛋白含量高且富含多種必需氨基酸?！侗静菥V目》中記載，河蜆具有治肝病、解酒毒等療效[14]。張磊等[10]和王一錚等[11]研究表明河蜆?biāo)嵛飳?duì)小鼠急性乙醇肝損傷具有保護(hù)作用，未涉及其解酒功效。劉晶晶等[12]和朱小燕等[13]研究表明河蜆酶解產(chǎn)物具有醒酒功效，但其是否具有抗急性酒精性肝損傷功效尚不清楚。采用酶解技術(shù)處理河蜆肉，會(huì)得到大量功能性氨基酸和肽，同時(shí)能釋放多糖等其他活性物質(zhì)于酶解產(chǎn)物中，本研究擬將從食品化學(xué)角度對(duì)河蜆肉酶解產(chǎn)物的基本營養(yǎng)成分和氨基酸組成進(jìn)行分析，并分別采用體外和體內(nèi)試驗(yàn)法系統(tǒng)研究河蜆肉酶解產(chǎn)物對(duì)乙醇脫氫酶(ADH)激活率、對(duì)小鼠的防醉醒酒和抗急性酒精性肝損傷的影響，為開發(fā)河蜆解酒護(hù)肝產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

鮮活河蜆(Corbiculafluminea)：購于廣州市黃沙市場，開殼取肉后200 g分裝，儲(chǔ)存于-40 ℃冰箱待用；

雄性昆明小鼠：SPF級(jí)，許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004，質(zhì)量18～22 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物研究所；

中性蛋白酶、堿性蛋白酶：2.0×105U/g，廣西龐博生物科技有限公司；

乙醇脫氫酶(ADH)：300 U/mg，美國Sigma公司；

血乙醇測定試劑盒、乙醇脫氫酶測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、還原型谷胱甘肽測定試劑盒：南京建成生物科技有限公司；

紅星二鍋頭：56% vol，北京紅星股份有限公司；

陽性藥物：河蜆姜黃肝臟水解物糖丸(含肝臟酶解物、河蜆提取物、牡蠣肉濃縮提取物和姜黃濃縮提取物等)，日本オリヒロプランデュ株式會(huì)社；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-1005型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

高速落地離心機(jī)：Thermo Lynx6000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：FDU-1100型，東京理化器械株式會(huì)社；

高速氨基酸分析儀：835-50型，日立儀器(上海)有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：Varioskan Flash型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 河蜆肉酶解產(chǎn)物制備 參照林孌等[15]河蜆肉酶解工藝方法，冷凍河蜆肉解凍后，按料水比1∶3 (g/mL)加水勻漿，調(diào)整pH至7.0，按原料質(zhì)量1.3%加入混合酶(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶質(zhì)量比3∶1)，于53 ℃恒溫?fù)u床中反應(yīng)260 min，然后沸水浴滅酶10 min，置冰浴中冷卻后以5 000 r/min離心20 min，收集上清液，測得水解度為31.6%，真空濃縮后冷凍干燥得到河蜆肉酶解產(chǎn)物干粉供試驗(yàn)備用。

1.2.2 基本成分測定

(1) 水分：按GB 5009.3—2016的常壓干燥法執(zhí)行。

(2) 粗蛋白：按GB 5009.5—2016的自動(dòng)凱氏定氮儀法執(zhí)行。

(3) 粗脂肪：按GB 5009.6—2016的索氏抽提法執(zhí)行。

(4) 總糖含量：按GB/T 9695.31—2008的苯酚硫酸法執(zhí)行。

(5) 灰分：按GB 5009.4—2016的高溫灼燒法執(zhí)行。

(6) 非蛋白氮：采用三氯乙酸沉淀法[16]。

1.2.3 氨基酸組成分析 采用氨基酸自動(dòng)分析儀測定，其中水解氨基酸參照GB 5009.124—2016方法，游離氨基酸測定參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.4 ADH激活率測定 參照文獻(xiàn)[6]17。

1.2.5 小鼠給酒量選擇 體重18～22 g SPF小鼠，暫養(yǎng)3 d 后，取30只隨機(jī)分為3組，禁食(不禁水)12 h后稱重，按體重分別灌胃0.14，0.16，0.18 mL/10 g·BW 紅星二鍋頭。參照高加龍[18]的方法，以翻正反射為指標(biāo)觀察小鼠是否醉酒，記錄小鼠醉酒只數(shù)和死亡只數(shù)，選擇醉酒率較高、死亡率較低的劑量為最適給酒量。

1.2.6 灌胃劑量確定 陽性對(duì)照組藥物濃度0.03 g/mL，是成人劑量的10倍，具有蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮物質(zhì)。河蜆酶解物組灌胃劑量按陽性對(duì)照中氮含量進(jìn)行配置。

1.2.7 小鼠防醉試驗(yàn)和解酒試驗(yàn) 將30只SPF雄性小鼠隨機(jī)分為3組，即陰性組、陽性組和河蜆組，每組10只，禁食(不禁水)12 h后稱重，按照體重分別灌胃0.1 mL/10 g·BW的蒸餾水、陽性藥物和河蜆肉酶解產(chǎn)物，其中陽性藥物和河蜆酶解產(chǎn)物的濃度分別為0.03，0.01 g/mL；初次灌胃30 min后，灌胃0.16 mL/10 g·BW的紅星二鍋頭。利用翻正試驗(yàn)觀察判斷小鼠醉酒狀態(tài)，記錄小鼠從灌酒到翻正反射消失(醉酒)所需時(shí)間和翻正反射消失(醉酒)到恢復(fù)(醒酒)所需時(shí)間。

1.2.8 急性飲酒小鼠血液乙醇濃度的測定 將30只SPF雄性小鼠隨機(jī)分為3組(陰性組、陽性組和河蜆組)，每組10只，按照1.2.6方法灌胃。在灌胃60 min后對(duì)各組小鼠眼球取血，采用血乙醇測定試劑盒測小鼠血液乙醇濃度。

1.2.9 河蜆酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷預(yù)防效果

將40只SPF雄性小鼠隨機(jī)分為4組(空白組、陰性組、陽性組和河蜆組)，每組10只。每天上午灌胃前稱量體重。陰性組、陽性組和河蜆組按照1.2.6方法分別灌胃蒸餾水、陽性藥物和河蜆肉酶解產(chǎn)物，30 min后灌胃0.12 mL/10 g·BW 的紅星二鍋頭，連續(xù)灌胃7 d；空白組每天灌胃蒸餾水。末次灌胃后引頸處死，解剖取肝臟組織，測定丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、谷胱甘肽(GSH)等生化指標(biāo)，具體方法參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果分析

2.1 河蜆肉酶解產(chǎn)物基本營養(yǎng)成分

河蜆肉酶解產(chǎn)物基本營養(yǎng)成分見表1。按干基計(jì)，河蜆肉酶解產(chǎn)物同牡蠣肉酶解產(chǎn)物[19]相比，其粗蛋白含量較高，為56.61%；總糖含量低于牡蠣肉酶解產(chǎn)物，為30.82%；粗脂肪和灰分含量與牡蠣肉酶解產(chǎn)物較接近?？梢姾油樔饷附馕锔煞凼且环N蛋白含量高，脂肪低并富含豐富礦物質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值很高的酶解蛋白粉。

2.2 河蜆肉酶解產(chǎn)物氨基酸組成

食物蛋白質(zhì)中的氨基酸是機(jī)體不可缺少的營養(yǎng)成分之一，對(duì)機(jī)體各種生理功能具有重要意義。如表2所示，可以看到河蜆肉酶解產(chǎn)物氨基酸種類齊全，水解氨基酸中必需氨基酸與總氨基酸比值為43.18%，必須氨基酸與非必須氨基酸比值為75.95%，符合FAO/WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)中理想蛋白模式[20]。河蜆肉酶解產(chǎn)物中的游離氨基酸含量較高，占總氨基酸的51.86%，說明河蜆肉經(jīng)過酶解產(chǎn)生了豐富的氨基酸。有報(bào)道稱賴氨酸[21]、脯氨酸[22]以及丙氨酸[23]等氨基酸可能與醒酒作用有關(guān)，牡蠣肉酶解產(chǎn)物[19]游離氨基酸中賴氨酸、脯氨酸和丙氨酸的占比分別為9.54%，5.27%，8.24%，對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)河蜆肉酶解產(chǎn)物中與解酒作用有關(guān)的氨基酸含量是相當(dāng)豐富的。有研究[24]表明目前臨床上常用于治療肝病的藥物有天門冬氨酸—鳥氨酸二肽注射液，可改善肝病患者的肝功能，促進(jìn)肝細(xì)胞自我修復(fù)和再生。如何使河蜆中富集更多的氨基酸和多肽片段，利用蛋白酶對(duì)河蜆肉進(jìn)行酶解是一個(gè)很好的選擇。

表1 河蜆肉酶解產(chǎn)物與其他貝類酶解產(chǎn)物的一般營養(yǎng)成分含量

表2 河蜆肉酶解產(chǎn)物氨基酸組成?

? *為必需氨基酸。

2.3 河蜆肉酶解產(chǎn)物體外對(duì)ADH活性的影響

解酒護(hù)肝研究的經(jīng)典評(píng)價(jià)方法是體內(nèi)試驗(yàn)法(動(dòng)物模型)，但該方法試驗(yàn)周期較長，目前常用瓦勒—霍赫法[25]并稍加改良后測定ADH的活性，來高效快速測定樣品是否有解酒活性。劉鵬[6]19-20研究表明大豆肽和玉米肽對(duì)ADH的活性具有促進(jìn)作用。蘆潔等[26]利用體外ADH激活率的方法，證實(shí)白豆蔻、復(fù)方解酒保肝茶、葛花水提物和市售葛花王水提取物對(duì)ADH活性具有促進(jìn)作用。本研究采用體外試驗(yàn)法對(duì)受試樣品活性進(jìn)行初步測定，再進(jìn)一步對(duì)樣品進(jìn)行體內(nèi)活性評(píng)價(jià)。由圖1所示，河蜆組對(duì)ADH激活率為52%，且高于陽性組(P<0.05)。從本試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出河蜆肉酶解產(chǎn)物對(duì)ADH具有激活作用。

2.4 河蜆肉酶解產(chǎn)物對(duì)急性飲酒小鼠的防醉及解酒效果

2.4.1 小鼠給酒量選擇 為了確定急性飲酒小鼠的醉酒劑量，將30只小鼠按照1.2.5 中所述方法進(jìn)行灌酒試驗(yàn)，所得結(jié)果如表3所示。

小鼠灌酒劑量過高會(huì)酒精中毒死亡，灌酒劑量偏低小鼠不會(huì)醉酒或醉酒只數(shù)較少。由表3可知，灌酒0.14 mL/10 g·BW 后醉酒只數(shù)為6只，灌酒0.16，0.18 mL/10 g·BW 后小鼠全部醉酒。觀察發(fā)現(xiàn)灌酒0.14 mL/10 g·BW 小鼠醉酒后睡眠淺，心臟跳動(dòng)加快，個(gè)別出現(xiàn)興奮和急躁，而另外2個(gè)劑量的小鼠醉酒后出現(xiàn)沉睡，翻正反射消失，且0.18 mL/10 g·BW組有3只死亡。因此，選擇小鼠的醉酒劑量為0.16 mL/10 g·BW。

不同字母表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

Figure 1 Effect of hydrolysate from soft tissue ofCorbiculaflumineaon ADH activation rate in vitro

表3 小鼠給酒量選擇結(jié)果

2.4.2 對(duì)小鼠醉酒時(shí)間和醒酒時(shí)間的影響 如表4所示，與陰性組相比，河蜆組和陽性組均能延長小鼠的醉酒時(shí)間(P<0.05)，二者無顯著性差異；與陰性組比較河蜆組醉酒時(shí)間延長率為69.42%。與陰性組相比，河蜆組和陽性組均能縮短小鼠的醒酒時(shí)間(P<0.05)，二者無顯著性差異；與陰性組比較河蜆組醒酒時(shí)間縮短率為13.40%。試驗(yàn)結(jié)果表明河蜆肉酶解產(chǎn)物能延長小鼠的醉酒時(shí)間和縮短醒酒時(shí)間。

2.4.3 對(duì)急性飲酒小鼠血液乙醇濃度的影響 乙醇經(jīng)口腔進(jìn)入胃、小腸、大腸和十二指腸之后，一小部分經(jīng)胃腸道中的ADH進(jìn)行第一關(guān)卡代謝，然后排出體外；但大部分乙醇會(huì)被胃腸道吸收，進(jìn)入血液，經(jīng)循環(huán)到達(dá)肝臟中進(jìn)行代謝。圖2是小鼠在飲酒后第60 min的血液乙醇濃度，與陰性組相比，陽性組和河蜆組均能顯著降低小鼠血液乙醇濃度(P<0.05)，二者無顯著性差異。左光揚(yáng)等[8]和韓麗娜[27]的研究表明，醒酒物可以通過促進(jìn)乙醇代謝的方式降低小鼠血液乙醇的含量。本研究結(jié)果表明河蜆肉酶解產(chǎn)物可以降低急性飲酒小鼠血液乙醇濃度。

表4 河蜆肉酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠醉酒和醒酒時(shí)間的影響?

? 不同字母表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

不同字母表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

Figure 2 Effect of hydrolysate from soft tissue ofCorbiculaflumineaon the concentration of ethanol in serum of acute drunken mice

2.5 對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷預(yù)防效果

飲酒會(huì)對(duì)機(jī)體的肝組織造成損傷，主要是通過乙醇代謝物對(duì)肝臟的損傷，如：乙醛的化學(xué)性損傷、氧化還原反應(yīng)的改變、氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷和鐵負(fù)荷等[28]，通過對(duì)肝臟生化相關(guān)指標(biāo)的測定，來驗(yàn)證這些損傷反應(yīng)是否發(fā)生，或者有無變化，從而來證明灌胃樣品是否對(duì)機(jī)體急性酒精性肝損傷起著積極的預(yù)防效果。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)規(guī)范》的判定方法，肝組織MDA、TG和GSH 3項(xiàng)檢測指標(biāo)其中任意2項(xiàng)結(jié)果為陽性，即可判定該物質(zhì)對(duì)酒精性肝損傷具有輔助保護(hù)功能[29]。

2.5.1 對(duì)肝臟組織中MDA的影響 乙醇在肝臟進(jìn)行代謝會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，而自由基會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA等物質(zhì)[30]。所以MDA作為脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物，其含量的多少也代表著肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接地反映了肝細(xì)胞的受損程度。由圖3(a)所示，河蜆組小鼠肝臟組織中的MDA含量顯著小于陰性組(P<0.05)，說明河蜆肉酶解產(chǎn)物能緩解急性飲酒小鼠肝臟組織中MDA的累積。

2.5.2 對(duì)肝臟組織中TG的影響 機(jī)體在大量飲酒后，乙醇會(huì)在乙醇脫氫酶的催化下大量地脫去氫原子被氧化，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)發(fā)生障礙，脂肪酸氧化減弱，從而影響脂肪的代謝，而且乙醇可致磷酸甘油增多而促進(jìn)甘油三酯的合成，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，TG含量增多[31]。如圖3(b)所示，河蜆組小鼠肝臟組織中的TG含量顯著小于陰性組(P<0.05)，說明河蜆肉酶解產(chǎn)物能降低急性飲酒小鼠肝臟組織中TG的含量。

2.5.3 對(duì)肝臟組織中GSH的影響 GSH在機(jī)體中起著很多有益的生化作用，它是抗氧化劑同時(shí)又是自由基的清除劑，能保護(hù)細(xì)胞的完整性，對(duì)維持細(xì)胞的正常代謝起著一定的作用。乙醇經(jīng)體內(nèi)代謝后可產(chǎn)生大量的自由基，對(duì)機(jī)體造成毒害作用，但GSH能清除自由基保護(hù)機(jī)體不受損傷[32]。由圖3(c) 所示，陰性組小鼠肝臟組織中GSH的含量低于空白組(P<0.05)，反映了陰性組小鼠因飲酒造成了GSH的大量消耗，含量降低，河蜆組小鼠肝臟組織中GSH的含量多于陰性組(P<0.05)，且與空白組無顯著性差異(P>0.05)。

不同字母表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

Figure 3 Effect of hydrolysate from soft tissue ofCorbiculaflumineaon liver tissue MDA,TG and GSH of acute drunken mice

3 結(jié)論

河蜆肉酶解物是一種蛋白含量高，脂肪低的酶解蛋白粉，其游離氨基酸含量占總氨基酸的51.86%。通過體外測定法檢出河蜆肉酶解產(chǎn)物對(duì)ADH具有激活作用；通過體內(nèi)活性評(píng)價(jià)顯示河蜆肉酶解產(chǎn)物可顯著延長小鼠的醉酒時(shí)間和縮短醒酒時(shí)間，證明其具有防醉及醒酒功效。同時(shí)相關(guān)生化指標(biāo)表明，其能顯著降低小鼠血液乙醇濃度，且能降低小鼠肝組織中MDA、TG的含量，減緩GSH的消耗。表明河蜆肉酶解產(chǎn)物具有解酒護(hù)肝的功效，但其具體功效成分有待進(jìn)一步研究探明。