余 娜 ，李瓊瑜 ，陳友琴 ，4，Thomas Joseph SFERRA，4，褚劍鋒 ，2，3，林 珊 ，3，彭 軍 ，2，3

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建 福州 350122；4.凱斯西儲(chǔ)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，美國(guó) 克利夫蘭 44106）

動(dòng)脈血管重構(gòu)是高血壓靶器官損害的病理過(guò)程，控制血壓，改善動(dòng)脈血管重構(gòu)，是防治高血壓并發(fā)癥的基礎(chǔ)［1］。血管重構(gòu)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，包括血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的增殖、遷移、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)合成、降解、重排等一系列過(guò)程。VSMCs的異常增殖和遷移引起的血管平滑肌變厚、收縮力增加和血管順應(yīng)性下降，導(dǎo)致血壓明顯升高［2］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在高血壓的發(fā)生發(fā)展和終末器官損害中起重要作用［3］。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為RAAS中血壓和心血管穩(wěn)態(tài)的主要生理調(diào)節(jié)因子，能夠介導(dǎo)VSMCs活化、增殖和遷移等多種反應(yīng)，進(jìn)一步引起血管平滑肌變厚，血管收縮力及阻力增加，血壓升高［4-6］，因此，抑制 AngⅡ誘導(dǎo)的 VSMCs異常增殖和遷移對(duì)防治高血壓具有重要意義。

清達(dá)顆粒（QDG）化裁自清眩降壓湯，是陳可冀院士60余年防治高血壓的臨床專(zhuān)方，主治新發(fā)高血壓或高血壓前期陽(yáng)亢證患者（肝火上炎、肝陽(yáng)上亢證等），臨床療效穩(wěn)定、可靠。課題組前期研究證實(shí)：清眩降壓湯可顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，參與調(diào)控高血壓引起的血管重構(gòu)［7-8］。為了探討清眩降壓湯化裁方QDG是否參與調(diào)控高血壓引起的血管重構(gòu)，本文研究了QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖和遷移的影響，以期為QDG臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6只8周齡雄性SD大鼠，體重（150～200）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 清達(dá)顆粒組成：天麻12 g，鉤藤10 g（后下），黃芩6 g，蓮子心 5 g，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1704306。

1.3 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶（trypsin）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；AngⅡ干粉（美國(guó) Sigma 公司）；Hoechst染色液（南京凱基生物科技有限公司）；α-SM-actin抗體（美國(guó)Abcam公司）；CCK-8試劑（日本同仁化學(xué)公司）；結(jié)晶紫（北京索萊寶科技有限公司）。

1.4 主要儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）；Forma系列CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；Countes全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Life Technologies公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica儀器有限公司）；ECLIPSE Ti-DH型熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs原代培養(yǎng)及鑒定 采用組織貼塊法。在無(wú)菌操作下取出大鼠胸主動(dòng)脈，在DMEM高糖培養(yǎng)基中剝離外膜結(jié)締組織，剖開(kāi)血管，輕輕刮去內(nèi)皮細(xì)胞，剝離出來(lái)的中膜用眼科剪剪成約1 mm3左右的組織塊，均勻地平鋪于培養(yǎng)瓶中；瓶底朝上，瓶?jī)?nèi)加入含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1 h后將培養(yǎng)瓶翻正，使組織塊完全浸泡在培養(yǎng)液中；靜止培養(yǎng)5 d后換液，于倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。VSMCs采用表型標(biāo)志蛋白α-SM-actin進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，取3～6代的VSMCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)分組 將VSMCs分為：① 對(duì)照組：未加入 AngⅡ及 QDG；② AngⅡ組；③ AngⅡ＋QDG 0.125 mg／mL 組；④ AngⅡ＋QDG 0.25 mg／mL 組；⑤ AngⅡ＋QDG 0.5 mg／mL組。以上②～⑤組AngⅡ的濃度均為10-6mol／L。

1.5.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 在96孔板中接種細(xì)胞，每孔加入3×103個(gè)細(xì)胞，每組做6個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)24 h后，用無(wú)血清的DMEM饑餓24 h，按以上分組給藥干預(yù)；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，配制含10%CCK-8的空白培養(yǎng)基以換液形式加入，4 h后終止培養(yǎng)，充分振蕩混勻后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A值）。根據(jù)公式計(jì)算：

細(xì)胞增殖率／%＝［AngⅡ組 A值／（對(duì)照組 A值－1）］×100%

細(xì)胞抑制率／%＝［（1－AngⅡ＋QDG組A值）／AngⅡ組A值］×100%

1.5.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)劃痕損傷修復(fù) 在6孔板中接種細(xì)胞，每孔加入3×105個(gè)細(xì)胞，每組做3個(gè)復(fù)孔；當(dāng)匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用無(wú)血清的DMEM饑餓24 h，進(jìn)行劃痕；隨后吸出原培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，最后一遍PBS保留不吸出，進(jìn)行拍照，記為0 h；吸棄PBS，按以上分組給藥干預(yù)，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6、12、24 h隨機(jī)取6個(gè)視野，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察拍照。

1.5.5 Transwell遷移分析 在6孔板中接種細(xì)胞，每孔加入3×105個(gè)細(xì)胞，每組做3個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)24 h后，用無(wú)血清的DMEM饑餓24 h，按以上分組給藥干預(yù)24 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，消化離心收集細(xì)胞，用空白培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)／mL；上室內(nèi)加入200μL重懸的細(xì)胞，下室加入700μL完全培養(yǎng)基，每組做3個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中培育；24 h后棄去培養(yǎng)基，用蘸有PBS的棉簽輕輕擦拭小室膜上側(cè)的細(xì)胞，將小室膜下側(cè)的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，PBS洗滌后于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，不符合正態(tài)分布以中位數(shù)表示。計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠VSMCs原代培養(yǎng) 組織塊貼壁第7天，組織塊邊緣開(kāi)始有少量細(xì)胞爬出，大部分呈長(zhǎng)梭形，小部分呈多角形或不規(guī)則形（圖1A）；第10天，可見(jiàn)細(xì)胞沿著組織塊周邊大量爬出，呈放射性生長(zhǎng)（圖1B）；第12天，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%左右，細(xì)胞為梭形、長(zhǎng)梭形，呈典型“峰-谷”狀生長(zhǎng)現(xiàn)象（圖1C）。結(jié)果表明原代培養(yǎng)成功。

圖1 大鼠VSMCs原代培養(yǎng)圖片（×100）

2.2 大鼠VSMCs免疫熒光染色并用Hoechst和表型標(biāo)志蛋白 α-SM-actin進(jìn)行免疫熒光染色顯示：藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核 （圖2A），綠色熒光代表α-SM-actin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞（圖2B），圖2C為細(xì)胞核和α-SM-actin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞合并圖，陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)95%以上，表明所培養(yǎng)的原代細(xì)胞為VSMCs。

2.3 QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖的影響 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖能力顯著升高（P＜0.01）；不同濃度的QDG可以顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的 VSMCs增殖（P＜0.01）；且隨 QDG 濃度的增加，對(duì)VSMCs增殖的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。說(shuō)明QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖有抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性。

2.4 QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs劃痕損傷修復(fù)的影響 與對(duì)照組比較，AngⅡ能顯著增加VSMCs劃痕損傷的修復(fù)，不同濃度的QDG可以顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs劃痕損傷的修復(fù)，見(jiàn)圖3。

2.5 QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs遷移的影響 見(jiàn)圖4。與對(duì)照組比較，AngⅡ能夠顯著增加VSMCs的遷移能力（P＜0.01）；不同濃度的QDG能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的 VSMCs遷移（P＜0.01），且隨 QDG 濃度的增加，對(duì)VSMCs遷移的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。說(shuō)明QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs遷移有抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性。

圖2 大鼠VSMCs免疫熒光染色圖（×100）

表1 QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖的影響（±s）

表1 QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，1） P＜0.01；與 AngⅡ組比較，2） P＜0.01；與 AngⅡ＋QDG 0.125 mg／mL 組比較，3） P＜0.01；與 AngⅡ＋QDG 0.25 mg／mL 組比較，4） P＜0.01。

組別對(duì)照組AngⅡ組AngⅡ＋QDG 0.125 mg／mL 組AngⅡ＋QDG 0.25 mg／mL 組AngⅡ ＋QDG 0.5 mg／mL 組24 h 100.00±4.00 123.98±1.341）115.03±2.702）108.39±1.732）3）97.21±1.222）3）4）細(xì)胞活力／%48 h 100.00±3.73 126.68±5.621）113.25±2.262）104.61±2.942）3）99.21±2.322）3）4）

圖3 QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs劃痕損傷修復(fù)的影響（×100）

3 討 論

血壓主要是由血管張力維持的，而血管張力主要是由血管平滑肌決定的［9］。VSMCs位于血管中膜，在正常成人體內(nèi)是通過(guò)緩慢和輕度收縮來(lái)維持血管壁的張力［10］。VSMCs根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為收縮型和合成型兩種表型，在胚胎時(shí)期或病理因素刺激下VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，合成型的VSMCs可從中膜遷移至內(nèi)膜，并在內(nèi)膜中大量增殖，成為高血壓等血管性疾病的主要原因［11］。

RAAS可通過(guò)調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡以及血管張力等方面在高血壓的發(fā)生發(fā)展和終末器官損害中扮演著重要的角色。AngⅡ作為腎素血管緊張素的一種重要的生物活性肽，與VSMCs上的AT1受體結(jié)合后，可通過(guò)激活多條胞內(nèi)信號(hào)通路促進(jìn)VSMCs增殖、遷移，導(dǎo)致血管壁硬化、管腔狹窄等［3，12］。 因此，抑制AngⅡ介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移是緩解或降低血壓升高的重要途徑之一。

圖4 QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs遷移的影響

本研究中，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示：不同濃度的QDG可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。VSMCs遷移是血管重構(gòu)的重要驅(qū)動(dòng)因素，劃痕實(shí)驗(yàn)是測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法，通過(guò)體外觀(guān)察細(xì)胞是否生長(zhǎng)（修復(fù)）至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的遷移能力。在本實(shí)驗(yàn)中，QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs劃痕損傷修復(fù)具有明顯的抑制作用，提示QDG可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs遷移能力。Transwell是通過(guò)計(jì)算相同時(shí)間內(nèi)穿過(guò)小孔膜的細(xì)胞數(shù)來(lái)反映細(xì)胞遷移能力，穿過(guò)小孔膜的細(xì)胞數(shù)越多，遷移能力越強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，AngⅡ誘導(dǎo)后有較多的VSMCs穿過(guò)小孔膜，QDG干預(yù)后，穿過(guò)小孔的VSMCs數(shù)量逐漸減少，進(jìn)一步說(shuō)明QDG能顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs遷移能力。

鑒于QDG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移具有顯著作用，其相關(guān)調(diào)控機(jī)制、作用靶點(diǎn)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)值得進(jìn)一步研究，其結(jié)果有望為QDG的臨床運(yùn)用提供充足的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。