楊帆*，王蘇儀，劉曉飛，崔琳琳，MARCHISIO Mario

1. 黑龍江省第二醫(yī)院，暨黑龍江省中毒搶救治療中心，黑龍江省勞動衛(wèi)生職業(yè)病研究院（哈爾濱 150000）；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院（哈爾濱 150000）；3. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（哈爾濱 150000）

食品安全是一個與人們健康息息相關(guān)的重大問題，許多導(dǎo)致人類疾病的高風(fēng)險因素是通過食品傳播的。近年來，食品成分中含有害有毒物質(zhì)，如殺蟲劑[1]、鹽酸克倫特羅[2]、獸藥[3]、生物毒素[4]等，已引起許多食品安全事故，而對于復(fù)合污染物、過敏原、病原體、添加劑等的檢測分析和制作過程控制，對維護(hù)人們健康同樣具有重大意義[5]。加強食品安全監(jiān)管已成為各級政府的重要而緊迫的任務(wù)之一，但是檢測食品中的有害有毒物質(zhì)存在許多困難，例如復(fù)雜基質(zhì)樣品，需要測試的有害有毒物質(zhì)的各種類型和復(fù)雜成分，以及測試低含量的化合物等。利用氣相色譜和高效液相色譜等傳統(tǒng)測試儀器價格昂貴，樣品處理步驟復(fù)雜，檢測周期長，檢測成本高，難以滿足現(xiàn)場快速測量的要求，也不能用于有毒有害物質(zhì)的早期監(jiān)測。因此，食品工業(yè)需要適當(dāng)?shù)姆治龇椒凹夹g(shù)手段來檢查食品的安全性和質(zhì)量[6]。

生物傳感芯片是20世紀(jì)90年代在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)。生物芯片的主要特點是高通量、微型化和自動化，能在短時間內(nèi)對生物樣品進(jìn)行分析，快速準(zhǔn)確地獲取樣品中大量的生物信息，其效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍[7]。而生物傳感芯片技術(shù)的原理，在于其采用原位合成或微矩陣點樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽片段（甚至組織切片）、細(xì)胞等樣品有序地固定在硅膠片或聚丙烯酰胺凝膠等支持物表面，組成密集的二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器（如激光共聚焦掃描）對雜交信號的強度進(jìn)行快速、并行、高效的檢測分析，判斷樣品中靶分子的數(shù)量，從而達(dá)到分析檢測的目的[8]。

具體論述已經(jīng)開發(fā)的幾種不同類型的生物傳感芯片，包括用于檢測食品中有毒有害物質(zhì)的基于免疫測定和PCR的生物傳感芯片，及表面等離子體共振傳感芯片等，總結(jié)其各自的分析性能，包括檢測的限制條件和分析時間。

1 生物傳感芯片

1.1 側(cè)流測定（LFA）

側(cè)向流動測定（LFA）是一種極簡單的免疫測定形式，其在診斷市場上獲得極大的普及，源于LFA最著名的妊娠試驗。使用者將一滴尿液樣品施加到盒式裝置上或?qū)l帶浸入尿液樣品中。如果出現(xiàn)兩條粉紅色的線條，懷孕；一條粉紅色的線，沒有懷孕；沒線，測試失敗。LFA本質(zhì)上是預(yù)裝有幾種不同抗體的膜。這被認(rèn)為是最簡單的生物傳感芯片形式之一，LFA當(dāng)然可以用于檢測食品中有毒有害物質(zhì)的檢測。

硝酸纖維素膜是LFA中最常用的材料，這種膜的孔徑在0.05～12 μm之間變化，這決定了液體轉(zhuǎn)運的速度和試驗的靈敏度。當(dāng)樣品具有高黏度或含有脂肪球（例如牛奶）時，膜的材料選擇和孔徑特別重要[9]。核酸LFA利用一對引物（即對病原體核酸特異的核酸的短序列）代替抗體，并檢測樣品中這種核酸序列的存在。由于樣品中此類核酸的量可能非常低，因此通常需要PCR擴增。Kong等[10]通過LFA檢測能量飲料和牛奶中葉酸的含量，Liu等[11]則采用LFA方法快速地檢測出食品中的相思豆毒素的含量。但是該方法由于PCR的擴增要求，核酸LFA并不適合外出應(yīng)用[12]。

LFA非常易于使用，且價格低廉。它可以在室溫下儲存，是一次性的，因此沒有交叉污染問題。目前已報道的檢測限為10 ng/mL，用于蚊子血粉中的IgG[13]、血吸蟲的0.2 ng/mL尿液[14]、魚精子中肺炎鏈球菌1 ng/mL[15]、血清中梅毒螺旋體5 ng/mL[16]。

1.2 ELISA 生物傳感芯片

ELISA通常在微板上進(jìn)行，并且用酶標(biāo)儀對其結(jié)果進(jìn)行定量。在某種程度上，這是一種光學(xué)免疫傳感器。這種方法可以使用微通道替換孔，其中目標(biāo)溶液連續(xù)地流過微通道（流動注射分析），將抗體固定在微通道的特定位置的內(nèi)表面上，這種連續(xù)流動的特性使漂洗非常有效。實際上，該方法既不需要抽吸-分配循環(huán)又不需要攪拌，因為流動應(yīng)該從微通道的內(nèi)表面除去任何過量的分子，將光照射到固定抗體的位置，而光傳感器從微通道的另一側(cè)讀取信號。

最近，已經(jīng)證明了使用ELISA型實驗室芯片檢測食源性病原體的許多新型檢測方案，其擁有近乎實時且具有優(yōu)異的靈敏度。Guan等[17]證明大腸桿菌O157：H7（使用抗大腸桿菌）的生物發(fā)光檢測，檢測限為3.2×101CFU/mL，測定時間為20 min。Wojciechowski等[18]使用抗體包被的有機光電二極管檢測葡萄球菌腸毒素B，檢測限為0.5 ng/mL。除此以外，Dong等[19]則通過ELISA生物傳感芯片在牛肉中成功檢測出口蹄疫病毒，其采用鎳螯合化學(xué)方法將重組蛋白（抗原）固定在聚苯乙烯微球上，測定牛血清中FMDV抗體。結(jié)果表明，在25 min的檢測時間內(nèi)，僅用10 mU/L樣品量就能成功地檢測出口蹄疫病毒。最大陽性百分率（NPPV）為303%，稀釋倍數(shù)為32倍，評價分析靈敏度。該方法的批內(nèi)變異系數(shù)（CV）值分別為15.5%和17.1%，完全符合世界動物衛(wèi)生組織（OIE）傳染病診斷試驗驗證原則。ELISA生物傳感芯片還被應(yīng)用在檢測食物中黃曲霉素[20]，Sciancalepore等[21]則在30 min內(nèi)對150 nL的起始樣品，檢測出15個食源性細(xì)菌細(xì)胞。

1.3 基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的生物傳感芯片

自20世紀(jì)80年代中期以來，PCR技術(shù)已被證明是檢測食品中病原體的寶貴方法，并發(fā)表了許多關(guān)于不同食源性病原體的PCR檢測的論文，包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、金黃色葡萄球菌等。實時PCR是用于定量特定DNA片段的最常用技術(shù)。通過檢測由于特異性擴增產(chǎn)生的熒光信號，實時測量PCR過程中合成的產(chǎn)物量。實時PCR需要特殊的熱循環(huán)儀和通常特定的熒光探針。

目前已有的微PCR芯片可分為三種：第一種是固定室微PCR芯片作為傳統(tǒng)熱循環(huán)的納米/微微升儲庫；第二種是連續(xù)流微PCR芯片，其中在不同的溫度區(qū)域內(nèi)建立不同位置，使樣品可以在各個溫度的各個區(qū)域之間移動，以此進(jìn)行循環(huán)；第三種是基于液滴的PCR系統(tǒng)，其中擴增反應(yīng)在每個擴增子的油包水滴中進(jìn)行[22]。

Chin等[23]用天然污染的豬肉樣品進(jìn)行多重直接PCR檢測沙門氏菌的敏感性和特異性。以常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法為參考，評價多重直接PCR的效果。其相對準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性分別為98.8%，97.6%和100%。Bai等[5]發(fā)現(xiàn)了一種用于檢測食源性病原體的光學(xué)薄膜生物傳導(dǎo)芯片的方法。主要原理是將醛標(biāo)記的探針排列并共價連接到肼衍生的芯片表面上，然后將生物素化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增子與探針雜交，再用抗生素免疫球蛋白G-辣根過氧化物酶結(jié)合物和可沉淀的辣根過氧化物酶底物洗滌和短暫溫育后，將與探針結(jié)合的生物素化鏈可視化為芯片表面上的顏色變化（金色至藍(lán)色/紫色）。PCR片段靶標(biāo)的高靈敏度和準(zhǔn)確檢測可在30 min內(nèi)完成。該測定非常穩(wěn)健，靈敏，特異且經(jīng)濟，并且可以適應(yīng)不同的通量。但有時顯示假陽性和假陰性結(jié)果，需要進(jìn)一步確認(rèn)，如探針雜交和限制性片段長度多態(tài)性問題等。

1.4 表面等離子體共振傳感芯片

基于表面等離子體共振（Surfaceplasmon resonance，SPR）的SPR傳感芯片的基本原理是：將某種單鏈DNA分子結(jié)合在金屬膜表面，加入與其互補的單鏈DNA，兩者的結(jié)合將使金屬膜與溶液界面的折射率上升，從而導(dǎo)致共振角度改變。如果固定入射光角度，就能根據(jù)共振角的改變程度對互補的單鏈DNA進(jìn)行定量。這一原理可用于分子雜交的快速檢測。與納米技術(shù)等先進(jìn)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，SPR技術(shù)被廣泛用來研究生物分子，如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、藥物-蛋白質(zhì)、核酸-蛋白質(zhì)、核酸-核酸之間相互作用的反應(yīng)動力學(xué)、結(jié)合位點和反應(yīng)物濃度等信息，其優(yōu)越性是常規(guī)分析技術(shù)所無法比擬的[24]。

LFA和ELISA兩種生物傳感芯片都需要具有標(biāo)簽的二抗，例如金納米顆粒、熒光染料和化學(xué)發(fā)光染料，隨后進(jìn)行多次漂洗步驟。目前有幾種不涉及標(biāo)記的替代方法，如無標(biāo)記免疫測定生物芯片?；诓煌男盘栟D(zhuǎn)換機制，無標(biāo)記型生物傳感器又分為SPR、石英晶體微量天平（QCMs）和微懸臂梁等[25]，其中SPR可能是最受歡迎的無標(biāo)記免疫分析生物傳感芯片之一。

在SPR在食品有毒有害物質(zhì)檢測中應(yīng)用的先期報道中，Li等[26]通過一種便攜式基于免疫抑制原理的高靈敏和可重復(fù)利用的SPR免疫傳感器，檢測出香豆素和鹽酸克侖特羅的抗體-抗原免疫應(yīng)答，并通過競爭性和連續(xù)檢測方法檢測了香豆素分子，印證該方法可以通過減少實驗步驟、延長服務(wù)時間、增長生物傳感芯片壽命和降低測試成本，來快速實現(xiàn)大量樣品現(xiàn)場檢測。Hana等[27]則在復(fù)雜的漢堡包和黃瓜樣品中發(fā)現(xiàn)，基于厚度低至20 nm的pCBAA刷的SPR生物傳感器能夠檢測大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌，兩種細(xì)菌的檢測限分別為57 CFU/mL和大腸桿菌17 CFU/mL，沙門氏菌分別為7.4×103和11.7×103CFU/mL，具有非凡的靈敏度和特異性。

1.5 乳膠免疫凝集試驗（LIA）芯片

另一種更簡單的免疫測定形式可以在芯片實驗中重復(fù)顯示，稱為乳膠免疫凝集測定（LIA）。雖然這不是無標(biāo)簽，但它可能是無沖洗的（ELISA和SPR實驗室芯片都需要沖洗步驟）。在LIA中，顆粒用針對給定靶標(biāo)的抗體包被并與所討論的樣品液體混合。如果抗體存在于流體中，則顆粒會形成更大的聚集體，這種抗體-抗原相互作用稱為免疫凝集。過去已在視覺上被觀察到，檢測極限是凝集物沉淀并變得可見的點，但在芯片實驗中通過前向光散射測量免疫凝集更為合適，因為凝集的亞微米或納米顆粒不需要從溶液中沉淀出來以獲得正信號[28]。Heinze等[29]在1%稀釋的雞糞中檢測到禽流感病毒，檢出限為10 pg/mL。You等[30]檢測到10%稀釋的萵苣中檢測限為10 CFU/mL的大腸桿菌。Fronczek等[31]在10%稀釋的雞肉組織中檢測到沙門氏菌，檢測限為10 CFU/mL，所有檢測時間均為10 min或更短。

但是，LIA并不總能提供完美的結(jié)果。特異性始終是一個問題，因為非特異性結(jié)合可能導(dǎo)致假陽性讀數(shù)。為了抑制非特異性結(jié)合，在顆粒懸浮液中加入了表面活性劑，而表面活性劑有時即使在存在靶抗原時也會阻止顆粒凝集（假陰性）。為了解決這個問題，高羧化膠乳顆粒（即表面被羧基側(cè)鏈飽和）可用于LIA實驗室芯片，因為高度羧化的膠乳顆粒能夠在不使用表面活性劑的情況下提高顆粒穩(wěn)定性，在微流體混合中具有優(yōu)勢[32]。

1.6 具有電化學(xué)檢測的免疫分析實驗室芯片

1.6.1 阻抗免疫分析芯片

該芯片利用電化學(xué)而非光學(xué)檢測，是將抗體固定在表面上，其中兩個電極稱為交叉指型微電極（IME）的構(gòu)型圖案化。當(dāng)像細(xì)菌這樣的大靶標(biāo)與表面結(jié)合的抗體結(jié)合時，一些靶標(biāo)能夠橋接兩個電極，從而降低電阻。如果電極圖案非常?。ㄎ㈦姌O），那么可以檢測到較小的靶，例如病毒和蛋白質(zhì)。IME免疫傳感器已經(jīng)成功地用于檢測許多不同食物樣品基質(zhì)中的病原體，包括Guo等[33]使用電化學(xué)阻抗譜檢測大腸桿菌，檢測限為102CFU/mL。

1.6.2 碳納米管（CNT）免疫分析芯片

CNT在電化學(xué)免疫測定中的主要優(yōu)點是增強的電子性質(zhì)，大的邊緣平面/基面比和快速的電極動力學(xué)。因此，基于CNT的免疫測定通常具有比傳統(tǒng)碳電極更高的靈敏度、更低的檢測限和更快的電子轉(zhuǎn)移動力學(xué)。CNT的優(yōu)異機械和導(dǎo)電性能（高致動應(yīng)力、低驅(qū)動電壓和高能量密度）使它們非常有希望開發(fā)用于疾病診斷的超靈敏和小型化免疫傳感器。Li等[34]通過結(jié)合CNT多層生物傳感器和基于微流控芯片的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP），對大腸桿菌O157：H7及其毒性基因進(jìn)行視覺和即時檢測，功能化的CNT多層生物傳感器可以選擇性地捕獲復(fù)雜樣品中的目標(biāo)細(xì)菌大腸桿菌O157：H7。隨后用基于微流體芯片的LAMP分析釋放的細(xì)菌的DNA濃度，在系統(tǒng)優(yōu)化捕獲和檢測條件后，傳感平臺能夠檢測低至1 CFU/mL的濃度而無需復(fù)雜儀器，這比以前報道的方法靈敏得多。

1.7 光纖或光波導(dǎo)入生物傳感芯片中的使用

生物傳感芯片的一個傳統(tǒng)缺點是它們的高檢測限（因此靈敏度差），這是因為小體積減少了可檢測信號。而通過使用光學(xué)檢測，將光纖與芯片實驗室微流體裝置集成，可以獲得更低的檢測限（在單分子水平上），以提高靈敏度。通常光纖用于從其光源傳輸光，而另一組光纖用于檢測生物反應(yīng)，但只有在相對干凈的環(huán)境中才能使用光學(xué)方法檢測。此外，樣品體積必須足以維持如此低的檢測限。

通常，在傳導(dǎo)芯片中使用的光纖分為嵌入式光纖、接近光纖兩類纖維取向。嵌入式光纖實際上包含在傳感芯片中，與微通道結(jié)構(gòu)物理接觸，這使其發(fā)揮了最佳性能，信號損失微不足道，但是它需要極其復(fù)雜的制造工藝。此外，接近光纖位于芯片附近但不接觸芯片。因此，它們易于開發(fā)，盡管它們可能在其信號中引入額外的噪聲。

2006年，Rindorf等[35]首次將微結(jié)構(gòu)光纖（MOF）嵌入到生物芯片中應(yīng)用。一個16 mm長的MOF被整合到光學(xué)流體耦合器芯片中，該芯片是使用CO2激光器在PMMA聚合物中制造的。開發(fā)的芯片配置允許通過MOF的液體流量和瞬時的光學(xué)特性產(chǎn)生連續(xù)控制。當(dāng)MOF集成在芯片中時，MOF通過將傳感層固定在光纖的微結(jié)構(gòu)化內(nèi)，而表面上功能化，以捕獲特定的單鏈DNA串。傳感層含有與靶DNA序列互補的DNA鏈，通過高選擇性DNA雜交過程進(jìn)行操作。這是一種使用消逝波傳感原理進(jìn)行捕獲DNA的光學(xué)檢測。由于芯片尺寸小，所提出的技術(shù)允許分析低至300 nL的樣品體積以及制造小型化便攜式設(shè)備。Han等[36]則使用接近光纖（即纖維緊密接觸但不接觸微流體裝置）來量化備檢物，由于微流體裝置中乳膠免疫凝集引起光散射增加，該檢測限低于（優(yōu)選在單細(xì)胞水平上）其他傳統(tǒng)方法，他們實驗證明了大腸桿菌的實時檢測，且該方法基本上是一步法，并且不需要樣品預(yù)處理或細(xì)胞培養(yǎng)。檢測限低至每個裝置40 CFU/mL或每臺設(shè)備4 CFU（僅限活細(xì)胞），或每個裝置＜10 CFU/mL或每臺設(shè)備＜1 CFU（包括死細(xì)胞和游離抗原），該結(jié)果優(yōu)于在微流體裝置中進(jìn)行的大腸桿菌檢測的其他結(jié)果。該技術(shù)非常適于應(yīng)用，因為它允許光源和檢測器在非?？拷酒臋z測區(qū)域處的精確定位，這消除了對更大和昂貴的光學(xué)定位階段的需要。

2 結(jié)語與展望

近幾年，食品安全在我國已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，食品的安全性成為消費者、政府監(jiān)管機構(gòu)的重要關(guān)注對象。生物芯片作為新興的生物技術(shù)，具有高效、大信息量和高特異性的特點，能夠在很短時間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們能快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的靶信息，檢測效率比傳統(tǒng)檢測手段有了極大的提高。目前，隨著科研的不斷深入，納米技術(shù)和半導(dǎo)體技術(shù)已經(jīng)開始助力生物芯片的發(fā)展，這使得生物傳導(dǎo)芯片可以微小化、精密化。而在此基礎(chǔ)上，接下來的發(fā)展方向還要集中在如何不斷提升生物傳導(dǎo)芯片的實際檢測效率，使其快速又真實可靠地產(chǎn)生結(jié)果。在生物傳導(dǎo)芯片的研發(fā)過程中，應(yīng)該不斷加強、不斷健全與芯片配套的分析系統(tǒng)，形成高度的集成化。隨著食品安全問題日益突出，食品檢測項目不斷復(fù)雜化，生物傳導(dǎo)芯片不僅要滿足快速、穩(wěn)定、可視的基本要求，還應(yīng)不斷增大芯片的信息容納能力，具備同時檢測多種項目的能力[37-40]。如此可見，生物傳導(dǎo)芯片雖然擁有廣闊的發(fā)展市場和應(yīng)用前景，但研究還需不斷深入，任重道遠(yuǎn)。