宋靜武 彭 磊

(1.秭歸縣林業(yè)局 林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣中心 宜昌 443600; 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院 昆明 650201)

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

核桃(JuglansregiaL.)又被稱為胡桃、羌桃，是一種胡桃科植物。核桃極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，核桃中脂肪和蛋白質(zhì)含量較高，又含有人體所需很多種礦物質(zhì)和微量元素，又富含多種維生素。核桃是一種極為重要的經(jīng)濟(jì)樹種，能為我國(guó)核桃產(chǎn)區(qū)帶來(lái)極大地經(jīng)濟(jì)效益。核桃樹抗寒能力較弱，在受到低溫凍害、寒害以及晚霜等非生物脅迫時(shí)會(huì)造成花芽枯死和枝條抽干，這會(huì)影響樹體的正常生長(zhǎng)結(jié)實(shí)，會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并限制了良種核桃的地理分布。為了提高核桃的經(jīng)濟(jì)和產(chǎn)業(yè)價(jià)值，研究人員利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)方法，希望能夠改良核桃品質(zhì)、探索核桃抗寒機(jī)制的分子機(jī)理、運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高抗性核桃新品種等工作進(jìn)行研究。

CBF/DREB1(C-repeat binding factors /dehydration response element binding factors1)蛋白是植物體內(nèi)低溫信號(hào)傳導(dǎo)途徑中研究最為廣泛的轉(zhuǎn)錄因子基因[1]。這個(gè)家族在抗寒，抗堿，抗鹽方面有很大作用[2]。擬南芥作為一種常用模式植物，Yamaguchii[3]在極端的干旱和低溫脅迫的條件下對(duì)擬南芥進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)擬南芥的RD29A基因的啟動(dòng)子區(qū)域中分離出了了DRE順式作用元件(1994)，這些元件含有相同的CCGAC序列。隨著研究發(fā)現(xiàn)CRT/DRE和其核心序列，常出現(xiàn)在冷誘導(dǎo)以及干旱誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子中，這是冷誘導(dǎo)過(guò)程中必要的一類基因[4]。2002 年，Haake等又分離出了這個(gè)家族的第 4 個(gè)成員CBF4，CBF4的轉(zhuǎn)基因植物能觀測(cè)與表達(dá)和CBF1一樣具有抗寒性顯著提高結(jié)果[5]。氨基酸序列分析表明，CBF中含有AP2結(jié)構(gòu)區(qū)，AP2結(jié)構(gòu)域第一個(gè)DNA結(jié)合區(qū)，它的作用是結(jié)合CRT/DRE順式作用元件，誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，通過(guò)合成膜穩(wěn)定蛋白、脯氨酸、糖類等物質(zhì)，改變細(xì)胞生理環(huán)境進(jìn)而提高植物的抗寒性[6]。CBF基因的冷誘導(dǎo)不會(huì)受自身調(diào)節(jié)影響，所以這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)該是其他蛋白，他們假設(shè)這種轉(zhuǎn)錄因子為ICE(inducer of CBF expression)。正常條件下ICE不處于活動(dòng)狀態(tài)，植物體可能通過(guò)某種條件將ICE隔離在體內(nèi)，當(dāng)植物受到冷刺激時(shí)ICE會(huì)被釋放出來(lái)，從而激活一條信號(hào)途徑，使CBF基因能夠進(jìn)行表達(dá)[7]。Chinnusamy等在2003年首次分理出ICE1基因[8]，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)查詢發(fā)現(xiàn)ICE1的C端含有一個(gè)近似MYCbHLH(MYC-likebasic helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)與bHLH蛋白相似，bHLH蛋白能夠識(shí)別DNA中的某些元件，而CBF3中含有多個(gè)這樣的元件[9]，這也說(shuō)明了ICE能特異的與CBF3中的特定識(shí)別序列結(jié)合。LOS4-1是CBF基因的一個(gè)正向調(diào)控因子，是由Guo研究擬南芥突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)的(2002)，這種基因突變的擬南芥對(duì)低溫的抵抗能力比野生型在24H內(nèi)降低了40%[10]。LOS基因編碼一種能夠抑制STZ/ZAT10的活性的生物活性酶(STZ/ZAT10能夠抑制冷誘導(dǎo)基因RD29的表達(dá))[11]，但是LOS的一個(gè)突變LOS4-2卻會(huì)增強(qiáng)CBF及其靶基因的表達(dá)[12]。Lee[13]等發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與滲透壓相關(guān)的CBF負(fù)調(diào)節(jié)因子稱為HOS1(high expression of osmoticstress regulated gene expression 1)，HOS編碼環(huán)脂蛋白，當(dāng)受到低溫刺激時(shí)會(huì)在細(xì)胞核內(nèi)大量積聚，抑制CBF基因表達(dá)。Liu等的研究表明，正常狀況下PtrHOS1基因在枳(Poncirus trifoliata (L.) Raf.)莖葉、根部都有很強(qiáng)的表達(dá)，經(jīng)過(guò)低溫處理后出現(xiàn)了短暫的下調(diào)，說(shuō)明HOST1基因表達(dá)受到低溫影響[14]。SFR6蛋白(sensitive to freezing 6)是一種對(duì)低溫敏感的蛋白也是一個(gè)特例，這種蛋白是CBF下游正調(diào)節(jié)因子，能夠下調(diào)那些啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)不含有CRT/DRE元件的基因[15～17]。在植物受到低溫刺激時(shí)，CBF基因轉(zhuǎn)錄水平會(huì)迅速提高，隨后含有CRT/DRE調(diào)節(jié)元件的COR基因啟動(dòng)子會(huì)與CBF基因結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)COR表達(dá)。COR基因在低溫條件系會(huì)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)的一部分多余物質(zhì)的含量，從而提高植物抗寒性[18～19]。COR是一種冷應(yīng)答蛋白，當(dāng)植物受到干旱鹽堿寒冷的脅迫時(shí)會(huì)被誘導(dǎo)產(chǎn)生[20]。目前對(duì)于COR類基因的研究較多，如擬南芥的COR78基因啟動(dòng)子常用于非生物脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子來(lái)增強(qiáng)植物抗逆性，這種啟動(dòng)子比組成型啟動(dòng)子更能減小植物生長(zhǎng)中的一些負(fù)面作用[21]。COR15a基因表達(dá)產(chǎn)生的物質(zhì)會(huì)與葉綠體結(jié)合，形成一種能夠保護(hù)原生質(zhì)體和葉綠體的物質(zhì)，進(jìn)而提高植物細(xì)胞的抗寒性[22]。 有關(guān)研究表明，CBF基因?yàn)锳P2/EREBP 超家族的DREB家族成員，是從擬南芥、甘薯等植物中發(fā)現(xiàn)的基因，在植物抗寒性研究中都起到關(guān)鍵性的作用。

CBF/DREB1蛋白是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的控制植物體內(nèi)低溫信號(hào)傳導(dǎo)的一類轉(zhuǎn)錄因子基因，也是現(xiàn)在研究最為廣泛的基因之一。近年來(lái)，隨著基因工程學(xué)科的不斷發(fā)展，從核桃中成功克隆出了許多影響核桃抗寒性的功能基因，相關(guān)研究只在研究單一低溫核桃相關(guān)基因的表達(dá)，但CBF基因在不同溫度處理表達(dá)的研究未見報(bào)道，因此，該課題對(duì)前人的研究進(jìn)行了深入和完善，這對(duì)研究核桃抗寒機(jī)制是十分必要的。為了了解核桃內(nèi)CBF基因?qū)Σ煌錅囟鹊捻憫?yīng)的變化，采用不同低溫梯度進(jìn)行處理，利用RT-PCR技術(shù)研究了在不同時(shí)間不同溫度下下‘陽(yáng)光’‘云新’核桃葉片內(nèi)CBF基因在寒冷脅迫下表達(dá)量的變化規(guī)律，為以后選育核桃優(yōu)良抗寒品種等提供更多的參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年12月～2017年3月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院果樹生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)材料為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物育種實(shí)驗(yàn)室盆栽‘陽(yáng)光’、‘云新’核桃幼苗葉梢對(duì)生葉片，樹齡0.5 a，處于幼年期，樹高1 m，沒有嚴(yán)重病害，在正常生長(zhǎng)條件下‘陽(yáng)光’長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于‘云新’核桃，但‘陽(yáng)光’核桃更易受自然低溫和病害影響?！菩隆癁樵颇媳づc新疆核桃早實(shí)豐產(chǎn)雜交品種，‘陽(yáng)光’為云南省選育的新品種。其中無(wú)病害室溫盆栽核桃作為空白對(duì)照，將整株核桃幼苗放入恒溫冰箱內(nèi)進(jìn)行活體2、4、6、8℃低溫脅迫處理，處理時(shí)間為2、4、8、24 h。處理完成后采摘新鮮葉片用錫紙包裹放入液氮浸泡，后放入超低溫冰箱保存。另一部分生理實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)處理后的新鮮核桃葉片立刻進(jìn)行殺青、曬干、研磨成粉狀放入塑封袋密封保存。

2.1.2 試驗(yàn)試劑

植物RNA提取試劑盒；cDNA第一鏈合成試劑盒、10×Loading Buffer、Marker為DL2000；2×Power Taq PCR MasterMix；氯仿、瓊脂糖等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2.1.3 儀器

移液器、大號(hào)研缽、冷凍離心機(jī)、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，eppendorf熒光定量系統(tǒng)；將清潔后的研缽等用錫紙包裹后，置于200℃以上烤箱烘烤處理；96孔0.2 mL PCR管盒、巴洛克無(wú)RNA酶槍頭、八連管、1.5 mL離心管、1.5 mL離心管盒、0.2 mL PCR管、96孔冷凍鋁板。

2.1.4 PCR 引物設(shè)計(jì)與合成

進(jìn)入NCBI網(wǎng)站，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入物種拉丁名Juglans regia L.及相關(guān)基因名稱CBF獲得取該基因的DNA或mRNA序列后，以其為模板使用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)完成后，委托昆明碩擎生物科技有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物信息

2.2 方法

2.2.1 核桃葉片總 RNA 的提取

液氮覆蓋核桃新鮮葉片將其研磨成細(xì)粉末，待液氮揮發(fā)完后，用離心管估算裝取0.1 g樣品(可使用離心管稱取)，加入1 mL細(xì)胞裂解液，在振蕩器上振蕩30秒后使其混勻后取1 mL勻漿物轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL離心管中；在離心管加入300 μL去蛋白液和200 μL氯仿，在振蕩器上振蕩30 秒左右混勻；在常溫12 000 轉(zhuǎn)/分離心8分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移入干凈的1.5 mL離心管中，加入等體積的漂洗液，充分顛倒混勻，將混合物分2次在12 000 r/min常溫條件下離心1分鐘，棄去穿透液；加入500 μL洗柱液，12 000 r/min常溫離心1 分鐘，棄穿透液，重復(fù)一次該操作，然后常溫12 000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘；將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 mL離心管中，加入50 μL RNA洗脫液，放置片刻，12 000 r/min常溫離心1分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品。分裝成5份，每份10 μL存放于超低溫冰箱待用。

2.2.2 RNA樣品電泳分析

取5 μL RNA樣品與等量的Buffer混勻，在1.5%瓊脂糖凝膠，1×TAE為電泳緩沖液，電壓為80 V的條件下電泳25 min，在凝膠成像儀上觀察RNA條帶呈像情況、并采集照片數(shù)據(jù)。

2.2.3 合成 cDNA 第一鏈

第一條鏈cDNA的合成按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa公司)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.2.4 基因特異引物的PCR

驗(yàn)證以cDNA為模板，用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)設(shè)定合適的循環(huán)參數(shù)，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

樣本的制備后，上機(jī)進(jìn)行樣品檢測(cè)。

2.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，利用軟件DPS 7.05對(duì)組間進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 核桃抗寒相關(guān)基因在‘陽(yáng)光’‘ 云新’核桃葉片受到不同溫度和時(shí)間脅迫后的表達(dá)分析

3.1.1 總RNA質(zhì)量及cDNA質(zhì)量檢測(cè)

由圖1和圖3可見，RNA 28S和18S條帶亮度的比例約為2∶1，泳道無(wú)明顯背景表明RNA樣品的完整性較好、純度較高，無(wú)明顯降解，可用來(lái)接下來(lái)的的反轉(zhuǎn)錄。

1：2℃2H；2：2℃4H；3：2℃8H；4：2℃24H；5：4℃2H；6：4℃4H；7：4℃8H圖1 ‘陽(yáng)光’核桃總RNA提取凝膠電泳圖像

1：6℃2H；2：6℃4H；3：6℃8H；4：6℃24H；5：8℃2H；6：8℃4H；7：8℃8H圖3 ‘陽(yáng)光’核桃總RNA提取凝膠電泳圖像

1：2℃2H；2：2℃4H；3：2℃8H；4：2℃24H；5：4℃2H；6：4℃4H；7：4℃8H圖4 ‘陽(yáng)光’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測(cè)凝膠呈像

1：4℃24H；2：6℃2H；3：6℃4H；4：6℃8H；5：6℃24H；6：8℃2H；7：8℃4H圖5 ‘陽(yáng)光’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測(cè)凝膠呈像

1：8℃8H；2：8℃24H；3：常溫1號(hào)；4：常溫2號(hào)；5：常溫3號(hào)圖6 ‘陽(yáng)光’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測(cè)凝膠呈像

1：2℃2H；2：2℃4H；3：2℃8H；4：2℃24H；5：4℃2H；6：4℃4H；7：4℃8H圖7 ‘云新’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測(cè)凝膠呈像

1：4℃24H；2：6℃2H；3：6℃4H；4：6℃8H；5：6℃24H；6：8℃2H；7：8℃4H圖8 ‘云新’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測(cè)凝膠呈像

1：8℃8H；2：8℃24H；3：常溫1號(hào)；4：常溫2號(hào)；5：常溫3號(hào)圖9 ‘云新’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測(cè)凝膠呈像

如圖7和圖9所示，以加入上述提取的‘云新’核桃葉片cDNA為模板，可擴(kuò)增獲得1條清晰的片段，說(shuō)明此方法提取的總RNA能夠滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR等以RNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3.1.2 CBF基因在‘陽(yáng)光’‘云新’核桃葉片受不同溫度脅迫后隨時(shí)間變化在葉片內(nèi)的表達(dá)量分析

通過(guò)對(duì)‘陽(yáng)光’核桃葉片組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CBF在核桃葉片中有表達(dá)，在三個(gè)不同時(shí)間CBF在核桃葉片內(nèi)表達(dá)量均無(wú)明顯變化(圖10)。以核桃 18S 基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析‘陽(yáng)光’核桃葉片CBF在2、4、6、8℃四個(gè)低溫脅迫下隨時(shí)間延長(zhǎng)核桃葉內(nèi)基因表達(dá)量變化情況。其中在2℃條件下‘陽(yáng)光’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)有較小幅度的升高，并在2 h處理時(shí)達(dá)到最高值，在4 h時(shí)有小幅下降，在8 h時(shí)又有小幅升高，處理24 h后基本不再變化(圖11)。4℃條件下‘陽(yáng)光’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)有小幅變化，且變化并不明顯(圖12)。6 ℃條件下‘陽(yáng)光’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)在2 h升高達(dá)到最高值后在4 h降低,處理8 h后又有小幅升高，24 h后又出現(xiàn)小幅降低(圖3-13)，其中2 h處理與0、4、24 h處理相比差異性顯著。8 ℃條件下‘陽(yáng)光’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)先升高，后隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐步降低，并在2H處理時(shí)達(dá)到最高值(圖14)與8 h、24 h處理相比差異性顯著。

圖10 CBF基因在常溫下不同時(shí)間在兩個(gè)品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

圖11 CBF基因在2℃處理不同時(shí)間在兩個(gè)品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

圖12 CBF基因在4℃處理不同時(shí)間在兩個(gè)品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

圖13 CBF基因在6℃處理不同時(shí)間在兩個(gè)品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

圖14 CBF基因在8℃處理不同時(shí)間在兩個(gè)品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

通過(guò)對(duì)‘云新’核桃葉片組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CBF在核桃葉片中有表達(dá)，在三個(gè)不同時(shí)間CBF在核桃葉片內(nèi)表達(dá)量均無(wú)明顯變化(圖3-11)。以核桃 18S基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析‘云新’核桃葉片CBF在2、4、6、8 ℃四個(gè)低溫脅迫下隨時(shí)間延長(zhǎng)核桃葉內(nèi)基因表達(dá)量變化情況。但在2、4、6、8 ℃四個(gè)低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)均只有小幅變化，且變化不明顯(圖12～圖14)。在2℃低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高，然后趨于穩(wěn)定。在4 ℃低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高之后再次降低，并在8 h達(dá)到最高值。在6 ℃低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量出現(xiàn)很小幅變化，在2 h達(dá)到最高值。在8 ℃低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，并在2 h時(shí)達(dá)到最高值。

由以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，CBF在‘陽(yáng)光’核桃低溫脅迫中起作用，在‘云新’核桃低溫脅迫中有表達(dá)，但表達(dá)量變化并沒有陽(yáng)光核桃明顯。

CBF抗寒途徑是在高等植物中廣泛存在的抗寒抗旱、抗鹽堿信號(hào)傳導(dǎo)通路，植物通過(guò)CBF轉(zhuǎn)錄因子，激活下游COR、LTI、KIN基因的表達(dá)來(lái)提高植物抗寒性。李勇鵬從香樟中低溫誘導(dǎo)分離出了4種類CBF基因找到了控制香樟抵御逆境脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc和CcCBFd[23]。吳純倩將擬南芥CBF3和CR15a冷誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入煙草，提高了煙草的抗寒性及在低溫時(shí)的光合作用率[24]。雷恒久等通過(guò)平歐雜交榛克隆出ChaCBF1基因，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)該基因會(huì)使植株積累較高水平的可溶性糖和游離脯氨酸來(lái)提高自身抗寒能力[25]。馮勛偉等將從結(jié)縷草中克隆出了CBF同源基因ZjCBF轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)即使不進(jìn)行冷馴化ZjCBF過(guò)量表達(dá)的植株也比野生型抗寒性強(qiáng)[26]。張建朋等從麻核桃中克隆出jhCBF，序列分析說(shuō)明JhCBF與樺木科白樺的親緣關(guān)系最近，優(yōu)先聚為一類[27]。近些年來(lái)，研究者們從茶樹、巨桉(Eucalyptusgrandis)、葡萄、番茄(LycopersiconesculentumMill.)、扁桃(AmygdaluscommunisLinn.)等中都克隆出了類CBF基因，這些成果對(duì)研究抗低溫品種改良優(yōu)化起著重要作用[28-32]。雷恒久[25]等對(duì)平歐雜交榛葉片進(jìn)行4℃低溫處理發(fā)現(xiàn)ChaCBF1表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)均有升高。徐麗[33]等對(duì)‘香玲’核桃葉片在4℃脅迫后發(fā)現(xiàn)JrCBF基因隨處理時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)。這些研究均說(shuō)明CBF基因在植物抗寒過(guò)程中起到了重要作用。

‘陽(yáng)光’核桃中CBF基因在6℃和8℃低溫脅迫下表達(dá)量有所升高，這暗示CBF基因在低溫脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但‘陽(yáng)光’核桃中CBF基因在4℃脅迫下并無(wú)明顯的表達(dá)量變化，而是在6℃和8℃時(shí)出現(xiàn)明顯變化，但受冷脅迫刺激后基因表達(dá)量變化趨勢(shì)相同。徐麗等所處的地區(qū)為山東省地理氣候環(huán)境與云南省地理氣候環(huán)境差異較大，是否能夠說(shuō)明不同地域的不同品種的核桃的抗寒能力存在不同，所以導(dǎo)致CBF基因受低溫刺激表達(dá)變化的溫度區(qū)間不同。本實(shí)驗(yàn)就云南省廣泛種植的‘云新’‘陽(yáng)光’兩種核桃中CBF基因進(jìn)行了低溫脅迫下表達(dá)量的研究。在實(shí)驗(yàn)最后討論時(shí)發(fā)現(xiàn)‘云新’核桃在2℃～8℃CBF基因變化量不明顯，現(xiàn)階段并不能對(duì)討論所做的假設(shè)下定論。希望進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)煞N核桃的綜合性抗寒指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，并選用不同樹齡植株材料，提供更大量的數(shù)據(jù)參考及使用更多品種核桃進(jìn)行冷脅迫基因表達(dá)量分析，來(lái)推斷這種特殊情況是否只在‘云新’這個(gè)品種出現(xiàn)。

4 結(jié)論

結(jié)論：‘陽(yáng)光’‘云新’核桃CBF基因在葉片不同溫度處理下均有表達(dá)，但各個(gè)時(shí)間段表達(dá)量之間有一定的差異。其中‘云新’核桃在2 、4、6、8 ℃四個(gè)處理溫度中表達(dá)量較為平均，沒有明顯變化，而‘陽(yáng)光’核桃在6 ℃處理組中2 h處理后和8 ℃處理組中2 h處理后CBF基因的表達(dá)量較高。各個(gè)核桃產(chǎn)地均處于獨(dú)特的地理氣候環(huán)境中，也都有適應(yīng)本土條件的核桃良種，核桃分子領(lǐng)域的研究基本為空白，希望通過(guò)這些研究為研究本土良種核桃抗寒生理及選育優(yōu)良抗性核桃品種提供一定參考與思路。