廖智紅，陳燕燕，黃修影，甘日植，羅舜仁，呂美嫻，劉布鳴，梁 鋼

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2. 欽州市第二人民醫(yī)院藥劑科，廣西 欽州 535000；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530011；4. 廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣西 南寧 530022)

肝纖維化是慢性肝病在修復(fù)過程導(dǎo)致的病理狀態(tài)，若未得到合理的治療，其終末階段將發(fā)展為肝硬化、肝癌直至死亡。肝纖維化病理過程的主要特點之一是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白過量產(chǎn)生。抑制TGF-β途徑可以減少ECM沉積，改善肝纖維化[1]，有研究報道，TGF-β通過自分泌和旁分泌機制，促進肝纖維化的發(fā)展[2]。TGF-β1/Smad信號通路與肝纖維化關(guān)系密切，抑制TGF-β1/Smad信號通路能明顯改善肝纖維化程度[3]。目前，對肝纖維化的潛在機制研究較為廣泛，但是臨床仍缺乏能夠有效防治肝纖維化的化學(xué)藥物，除肝臟移植以外的治療措施，均遠未達到理想的治療效果。

近年來，中藥在抗肝纖維化方面的研究成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點之一，國際上多項中醫(yī)藥及中藥復(fù)方或中草藥提取物研究顯示，中醫(yī)藥在抗纖維化的治療中起重要作用[4-5]。因此，尋找開發(fā)低毒、高效的抗肝纖維化藥物成為廣大科研人員的重要任務(wù)。裂果薯(SchizocapsaplantagineaHance)為蒟蒻薯科植物，作為一種廣西特色中草藥，也屬壯、瑤藥，在廣西產(chǎn)量豐富，已有一定種植規(guī)模，具有清熱解毒、消腫止痛、收斂止血等功效。至今，對裂果薯公開報道的研究集中在其化學(xué)成分的分離、鑒定方面，其藥效學(xué)研究很少。本課題組從裂果薯分離得到的皂苷類化合物大都是結(jié)構(gòu)比較新穎的甾體皂苷，我們的前期研究表明，其皂苷成分對人肝癌細胞和鼻咽癌細胞增殖具有明顯的抑制作用[6-7]；體內(nèi)實驗研究表明，其對人肝癌裸鼠移植瘤也有抑制作用[8]。目前還未見其抗肝纖維化作用的報道，故本研究通過應(yīng)用裂果薯總皂苷(total saponins ofSchizocapsaplantagineaHance,SFSP)對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化進行干預(yù)和治療，探討SFSP抗肝纖維化作用，并試圖闡明其潛在機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑裂果薯塊莖，購自廣西壯族自治區(qū)資源縣瓜里鄉(xiāng)，由廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院黃云峰教授鑒定為SchizocapsaplantagineaHance；SFSP由本實驗室自行提取與鑒定；秋水仙堿，購自昆明制藥有限公司，實驗時用蒸餾水配制成混懸液。羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；Ⅳ型膠原(collagen Ⅳ,CⅣ)、Ⅲ型前膠原(procollagenⅢ，PCⅢ)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、層黏蛋白(laminin，LN)ELISA試劑盒，均購自上海源葉生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，購自TaKaRa公司；TGF-β1、Smad4、Samd7、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)、GAPDH引物，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 實驗動物♂SD大鼠 53只，體質(zhì)量(180±10)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(桂)2014-0002。

1.3 儀器StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；全自動生化分析儀、H-7650透射式電子顯微鏡(日本日立公司); SpectraMaxPlus384連續(xù)廣譜掃描式酶標(biāo)儀(香港分子儀器公司)；BX53正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；RM2235組織切片機(德國LEICA公司)；PTPS-2011彩色病理圖文分析系統(tǒng)(重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 肝纖維化動物模型的制備與干預(yù)將53只♂SD大鼠隨機分為正常對照組(11只)、造模組(42只)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，正常對照組灌胃同體積的生理鹽水，造模組灌胃50% CCl4橄欖油溶液2 mL·kg-1，每周2次(先后間隔2～3 d),連續(xù)10周。于造模后第6周，隨機抽取2只肝纖維化大鼠及1只正常對照組大鼠，進行病理學(xué)檢查，監(jiān)測肝纖維化形成情況。病理結(jié)果證實造模成功后，將其余肝纖維化大鼠隨機分為模型組、秋水仙堿組(Col)、SFSP低劑量組(SFSP-L)、SFSP高劑量組(SFSP-H)，每組10只。自造模6周后, SFSP干預(yù)組和Col組每日灌胃給藥, Col組大鼠灌胃秋水仙堿混懸液0.4 mg·kg-1；SFSP-H組大鼠灌胃SFSP 25 mg·kg-1(用0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用)；SFSP-L組灌胃SFSP 12.5 mg·kg-1；正常對照組和模型組則灌胃等容積溶媒,給藥體積為10 mL·kg-1，每日1次，連續(xù)4周。末次給藥后禁食 8 h，處死大鼠,腹主動脈取血，大鼠血液靜置2 h后，3 000 r·min-1離心15 min，取上清，-80 ℃凍存，備用。剝離肝臟稱重，計算肝臟重量與體質(zhì)量之比，得到肝臟指數(shù)。

2.2 肝組織病理學(xué)檢查迅速分離肝臟組織，取肝臟相同位置，用4%多聚甲醛充分固定24 h后，以乙醇呈濃度梯度常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，病理切片厚度4 μm, HE、 Masson染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)變化，并拍照。

2.3 電鏡觀察肝細胞超微結(jié)構(gòu)取大小為1 mm3肝組織標(biāo)本，用3%戊二醛固定，1%鋨酸后固定,丙酮梯度脫水,滲透處理后環(huán)氧樹脂包埋,再經(jīng)聚合、修塊后，制成超薄切片,染色,透射電鏡觀察，加速電壓為80 kV。

2.4 血清及肝組織生化指標(biāo)檢測采用全自動生化分析儀，檢測大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)。ELISA法檢測大鼠血清HA、LN及ECM成分CⅣ、PCⅢ水平，按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀上450 nm、630 nm處測定OD值，根據(jù)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙波長比色法，計算各組大鼠血清中各指標(biāo)含量。從-80 ℃冰箱中稱取50 mg肝組織，Hyp含量測定采用樣本堿水解法，嚴格按照試劑盒說明書檢測。

2.5 qPCR法檢測肝組織中α-SMA、TGF-β1、Smad4、Samd7 mRNA表達從-80 ℃冰箱中取大鼠肝組織約40 mg，置預(yù)冷的研缽中研磨成肝粉，加入裂解液充分研磨，用柱式法提取總RNA。測定RNA濃度后，采用10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系加入各組分，在PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為：37 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，85 ℃酶失活反應(yīng)5 s，cDNA置于-80 ℃冰箱保存。按照SYBR Green法配制反應(yīng)體系，按20 μL體系將各反應(yīng)物按反應(yīng)需要配制總管，混勻，確保所有反應(yīng)體系的組成一致，再取18.00 μL加至各個PCR反應(yīng)管中，每管加入cDNA 2.0 μL，組成每管共20 μL體系。每組至少3個復(fù)孔，冰上操作，引物序列見Tab 1。反應(yīng)條件按兩步法PCR擴增程序:95 ℃預(yù)變性，30 s；95 ℃變性5 s；65 ℃ 退火，30 s。共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過StepOne Software V2.2軟件讀取Ct值,以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

Tab 1 Primer sequences

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠的一般情況正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好、自主攝食、活動靈敏、皮毛發(fā)亮；肝纖維化模型組大鼠精神狀態(tài)一般，喜蜷臥，毛發(fā)光澤度降低，動作遲緩，活動度低。SFSP-L組、SFSP-H組和Col組大鼠一般情況較模型組明顯改善。與正常組相比，模型組大鼠的肝臟指數(shù)明顯升高；與模型組比較，SFSP組大鼠肝臟指數(shù)明顯降低(P<0.01)，Col組大鼠的肝指數(shù)也有降低的趨勢(Tab 2)。

Tab 2 Effect of SFSP on liver index in rats with

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group

3.2 SFSP對肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響HE染色和Masson染色結(jié)果如Fig 1所示，正常對照組大鼠肝臟表現(xiàn)出正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀整齊排列，肝細胞未見變性或壞死。模型組肝索排列紊亂，在中央靜脈至匯管區(qū)出現(xiàn)大量膠原纖維沉積，形成纖維橋連接，把肝小葉分割成大小不等的圓形或橢圓的假小葉,周圍纖維組織增生，小葉間纖維間隔也明顯增寬。SFSP各組大鼠可見炎細胞浸潤程度明顯減輕，亦可見藍色膠原纖維出現(xiàn)在匯管區(qū)，但是其纖維細且薄，肝小葉結(jié)構(gòu)雖有破壞，但肝小葉間纖維間隔形成減少、變細，纖維結(jié)締組織增生分布較模型組少，偶見匯管區(qū)形成纖維橋連接分割肝小葉，可觀察到肝組織病理損傷比模型組明顯減輕。其中，SFSP高劑量組的肝組織病變減輕，大部分肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉間纖維間隔形成較少，膠原纖維增生比模型組有明顯好轉(zhuǎn)。陽性對照組與模型組比較，膠原纖維間隔變窄，著色比模型組淺，仍可見少量假小葉結(jié)構(gòu)。

3.3 SFSP對肝纖維化大鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡結(jié)果顯示(Fig 2),正常對照組大鼠肝細胞核圓或橢圓，核膜清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布規(guī)律，線粒體呈圓形，未見明顯脂滴存在；模型對照組細胞核固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，無規(guī)律分布，線粒體腫脹，糖原減少，膠原纖維束明顯增生；SFSP作用后，肝細胞器病變改善，形態(tài)良好,纖維束細小,可見少量肝星狀細胞凋亡小體，其中SFSP-H組改善程度較SFSP-L組明顯；陽性對照組可見肝細胞形態(tài)等均較模型組有改善，但是與SFSP-H組相比，陽性組線粒體形態(tài)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列等均有所不及。

3.4 SFSP對肝纖維化大鼠肝功能及肝組織Hyp含量的影響如Tab 3所示，與對照組相比，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清AST和ALT活性明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，Col明顯降低血清AST和ALT活性(P<0.05)，SFSP-H組能明顯降低ALT水平(P<0.01)。與對照組比較，模型組肝組織Hyp水平明顯上升(P<0.01)；與模型組比較，SFSP-L組、SFSP-H組及Col組明顯降低Hyp水平(P<0.01)。

3.5 SFSP對肝纖維化大鼠血清HA、LN、CⅣ、PCⅢ含量的影響血清中HA、LN、CⅣ、PCⅢ含量是衡量肝纖維化發(fā)生的重要指標(biāo)。Tab 4結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組血清中HA、LN、CⅣ、PCⅢ含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01);與模型組比較，SFSP-L組與SFSP-H組均不同程度降低血清中HA、LN、CⅣ、PCⅢ含量(P<0.05，P<0.01)，但是SFSP-H組纖維化改善程度較SFSP-L組明顯，Col組明顯降低肝纖維化大鼠血清中HA、LN、CⅣ、PCⅢ含量(P<0.05)。

3.6 SFSP對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、Smad4、Smad7、α-SMA mRNA表達的影響如Tab 5所示，與正常對照組相比，模型組α-SMA、Smad4、TGF-β1 mRNA的表達明顯升高,Smad7 mRNA表達明顯降低；與模型組相比，給予SFSP后，肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、Smad4 mRNA表達明顯降低(P<0.01),Smad7 mRNA表達量明顯增高(P<0.05)。

Tab 3 Effects of SFSP on AST, ALT in serum and Hyp in rat liver , n=10)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig 1 Comparison of HE, Masson staining in each group

Fig 2 The protective effects of SFSP against CCl4-induced liver fibrosis in rats through TEM assay

Tab 4 Effects of SFSP on HA, LN, CⅣ, PCⅢ in serum of rats with hepatic fibrosis , n=10)

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Tab 5 Effects of SFSP on expressions of TGF-β1, Smad4, Smad7, α-SMA mRNA in rats n=3)

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

4 討論

肝纖維化是一種在世界范圍內(nèi)具有高發(fā)病率與高死亡率的疾病,如果肝纖維化得不到控制，則可進一步發(fā)展為死亡率極高的不可逆的終末期肝硬化、肝癌。SFSP是一種來源于廣西壯瑤藥裂果薯的天然活性成分，在本研究中，SFSP對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化表現(xiàn)出良好的抗肝纖維化作用。血清肝纖維化指標(biāo)HA、CⅣ、LN、PCⅢ升高，根據(jù)肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)以及肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果，判定該造模方法成功復(fù)制了大鼠肝纖維化模型。結(jié)果顯示，SFSP組肝組織病理形態(tài)學(xué)及纖維化較模型組明顯改善。ECM積聚是肝纖維化中的常見現(xiàn)象，而Hyp是膠原蛋白的主要成分，也是ECM累積的典型標(biāo)志物[9]。實驗結(jié)果顯示，SFSP低、高劑量均明顯降低肝組織Hyp含量，血清學(xué)肝纖維化直接標(biāo)志物HA、CⅣ、LN、PCⅢ 水平在SFSP干預(yù)后明顯低于模型組，表明SFSP抑制ECM積聚，明顯降低肝纖維化指標(biāo)，改善模型大鼠纖維化程度，并進一步抑制肝纖維化進程。

ALT和AST是反映肝細胞損傷的常用指標(biāo)。ALT主要分布于胞質(zhì)中，AST主要分布于線粒體和胞質(zhì)中。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組二者均明顯升高，SFSP干預(yù)后的大鼠AST水平比肝纖維化模型組略有下降，沒有明顯干擾CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中的AST水平。但是高劑量組與模型組相比，ALT明顯降低，且AST/ALT比值明顯升高。上述結(jié)果一方面提示，SFSP抗肝纖維化作用不是通過對肝細胞的保護實現(xiàn)的，另一方面說明ALT降低的比例明顯高于AST的比例，但是高劑量比低劑量SFSP組AST/ALT比值升高得更明顯，證實SFSP不加重已有的線粒體損傷情況。

現(xiàn)代研究顯示，皂苷類具有廣泛的藥理作用，但目前甾體皂苷類抗肝纖維化的作用研究報道較少，具體作用機制尚不清晰，該領(lǐng)域具有很大研究價值。近年文獻報道，重樓皂苷(其含甾體皂苷化學(xué)成分，與SFSP所含甾體皂苷極為相似)分別以40、300 mg·kg-1灌胃時，具有抗大鼠肝纖維化作用[10-11]。肝星狀細胞(HSC)的活化與增殖作為肝纖維化的中心環(huán)節(jié)已得到公認，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SFSP對HSC-T6的增殖具有極強的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，在相同給藥途徑情況下，與重樓皂苷比較，SFSP僅25 mg·kg-1劑量就能對肝纖維化大鼠血清及肝組織相關(guān)纖維化標(biāo)志物的生成有明顯下調(diào)作用，表現(xiàn)出良好的抗肝纖維化作用，有望成為新型抗肝纖維化藥物。

TGF-β1/Smad信號通路是肝纖維化主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[12]，抑制TGF-β1是抗肝纖維化重要策略之一。TGF-β1以一種潛在的形式在ECM中釋放,并且被激活，TGF-β1先與TGF-β受體Ⅱ結(jié)合，磷酸化TGF-β受體Ⅰ，共同形成異源四聚體進而活化，而后通過Smad2、Smad3、Smad4，激活下游的信號通路，進而激活HSC，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。目前認為Smad7是TGF-β1/Smad信號通路的最主要抑制性調(diào)控蛋白，上調(diào)Smad7是抑制TGF-β對HSC不良生物效應(yīng)的有效措施之一。抑制Smad7的表觀遺傳，促進Smad2和Smad3的磷酸化，是HSC持續(xù)活化和肝纖維化的重要分子機制[13]。通過抑制TGF-β1的生成和激活，下調(diào)TβRⅠ/Ⅱ受體，以及靶向阻斷Smad2/3蛋白的表達，上調(diào)TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制因子Smad7的水平，是治療肝纖維化的有效手段。α-SMA是HSC激活公認的標(biāo)志物[14]。在本研究中，CCl4損傷明顯增加α-SMA和TGF-β1 mRNA水平，相比之下，SFSP在纖維化肝臟中明顯抑制HSC活化標(biāo)志物α-SMA mRNA表達,通過下調(diào)TGF-β1、Smad4 mRNA的表達，來抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活，減少HSC的活化，減輕CⅣ和PCⅢ沉積，發(fā)揮抗纖維化作用。在我們的研究中，SFSP抑制TGF-β1的表達，阻斷Smad4表達，并上調(diào)Smad7基因的表達，發(fā)揮抗肝纖維化作用。這些結(jié)果表明，SFSP的抗肝纖維化作用可能是通過抑制TGF-β1/Smad途徑介導(dǎo)的。

本研究首次開展了SFSP抗肝纖維化動物實驗，綜上所述，SFSP抑制TGF-β1/Smad信號通路，進而減少ECM合成，是其抗纖維化作用機制之一，是一種非常有潛在價值的新藥。本研究為開發(fā)與應(yīng)用SFSP作為治療肝纖維化的潛在藥物提供了依據(jù)，其相關(guān)詳細機制值得進一步深入研究。

(致謝：本實驗于廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實驗平臺完成，感謝實驗室老師和同學(xué)的指導(dǎo)與幫助！)