阿地力江·薩吾提，艾尼瓦爾·吾買爾，買爾旦·玉蘇甫，吉米麗汗·司馬依，阿布來提·阿布力孜,艾合麥提江·納曼，艾再提·克熱木，周文婷

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的日益發(fā)展與深入研究，人們開始逐漸認(rèn)識(shí)到疾病治療需要干預(yù)多個(gè)靶點(diǎn)和多條信號(hào)通路。中醫(yī)藥治療疾病具有整體觀和辨證論治的特點(diǎn),而且在治療復(fù)雜疾病方面顯示出了更好的預(yù)期效果。中藥及其復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，這種復(fù)雜特征成為解釋中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的一個(gè)瓶頸。因此，天然藥物主要有效成分的多靶點(diǎn)研究和配伍研究，成為新一代藥物研究的熱點(diǎn)。

羅勒(OcimumbasilicumL.)為唇形科羅勒屬，1年生草本植物。味辛、性溫，其全草部分和種子均可入藥，具有疏風(fēng)解表、解毒消腫、強(qiáng)心安神、化濕和中、消散瘀腫、行氣活血、止痛等功效[1]。在我國主要生長在新疆、四川、云南等地。化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、酚酸，黃酮、甾體類化合物。眾多研究表明[2]，羅勒水提物或醇提物有細(xì)胞毒性、清除自由基、抗炎、抗腫瘤、抗菌/抗毒、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用。雖然羅勒藥理作用豐富，其作用機(jī)制尚未完全闡明，為此，系統(tǒng)揭示羅勒主要活性成分及其藥理作用機(jī)制具有重要意義。

近年來，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究天然藥物越發(fā)被人們關(guān)注。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體的角度研究藥物與疾病間的聯(lián)系，將藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，基于系統(tǒng)生物學(xué)，聯(lián)合應(yīng)用多向藥理學(xué)、生物分析等多種學(xué)科，經(jīng)過不同網(wǎng)絡(luò)模型的可視化表達(dá)，闡明中草藥的藥理學(xué)性質(zhì)。這種新方法特別適合用于反映天然藥物的多成分-多靶點(diǎn)的作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一概念的提出，突破了單一靶點(diǎn)作用于單一疾病的思想限制，為研究中藥及其復(fù)方中的潛在活性成分和作用靶點(diǎn)，提供了有效的研究策略[3]。本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及公開的文獻(xiàn)報(bào)道為基礎(chǔ)，利用多種數(shù)據(jù)庫資源，系統(tǒng)研究了羅勒揮發(fā)油的活性成分、治療疾病的靶點(diǎn)及其主要作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)、DrugBank (https://www.drugbank.ca/)等數(shù)據(jù)庫，獲取羅勒揮發(fā)油成分規(guī)范化的三維分子結(jié)構(gòu)描述符，SIB(https://www.sib.swiss/)數(shù)據(jù)庫檢索出揮發(fā)油成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及靶點(diǎn)信息，根據(jù)UniProt(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)信息作為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，利用治療靶點(diǎn)(therapeutic target disease，TTD, https://db.idrblab.org/ttd/)數(shù)據(jù)庫，檢索疾病靶點(diǎn)，經(jīng)KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫，檢索出預(yù)測(cè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的疾病靶點(diǎn)通路。

1.2 成分收集及整理羅勒揮發(fā)油化學(xué)成分的收集按照以下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：① 通過文獻(xiàn)已經(jīng)公開報(bào)道的新疆地區(qū)羅勒揮發(fā)油成分；② 羅勒中已經(jīng)定量的揮發(fā)油化學(xué)成分。對(duì)收集到的成分進(jìn)行預(yù)處理及標(biāo)準(zhǔn)化，去除離群樣本和多余的分子描述，最終將成分名稱輸入PubChem數(shù)據(jù)庫，檢索出規(guī)范化的三維分子結(jié)構(gòu)描述符，用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.3 活性成分的篩選按照上述標(biāo)準(zhǔn)整理到的羅勒揮發(fā)油規(guī)范化的三維分子結(jié)構(gòu)描述符，輸入到SIB(http://www.swissadme.ch)數(shù)據(jù)庫中，導(dǎo)出化學(xué)成分相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，根據(jù)ADME參數(shù)選出具有生物活性的成分，進(jìn)一步研究。

1.4 成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)到的活性成分，按照同樣的方法在Swiss Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)中檢索，獲取成分靶點(diǎn)，并利用UniProtKB (http://www.uniprot.org/)核對(duì)靶點(diǎn)信息、篩選并整理，利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白的富集分析。

1.5 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建收集到的活性成分及對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)輸入到Cytoscape6.0網(wǎng)絡(luò)可視化軟件中，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)(compound-target，C-T)網(wǎng)絡(luò)，基于邊數(shù)、節(jié)點(diǎn)、關(guān)聯(lián)性設(shè)置顏色、大小。

1.6 疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建活性成分預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)，利用治療靶點(diǎn)疾病數(shù)據(jù)庫TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)等檢索平臺(tái)，獲取其相關(guān)的疾病靶點(diǎn)及靶點(diǎn)通路信息，進(jìn)行整理。

2 結(jié)果

按照成分收集標(biāo)準(zhǔn)，在已經(jīng)公開的文獻(xiàn)報(bào)道中整理出了134個(gè)羅勒揮發(fā)油成分，對(duì)這些成分進(jìn)一步研究。

2.1 成分篩選標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是藥物吸收、分布、代謝、排泄(absorption,distribution,metabolism,excretion，ADME)特性中尤為重要的參數(shù)之一，它表示單位口服劑量產(chǎn)生藥效的百分?jǐn)?shù)，在Swiss中，胃腸道吸收的高低被用來指示口服生物利用度。較高的OB值是表明藥效分子及類藥性的關(guān)鍵指數(shù)。藥效可以影響ADME過程，因而導(dǎo)致藥物生物利用度的變化[4]。細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)均能在胃腸道中高度表達(dá)，且兩者的底物能夠相互重疊，因此，腸道細(xì)胞CYP450 對(duì)已吸收藥物的生物轉(zhuǎn)化作用和腸道細(xì)胞中P-gp對(duì)已吸收藥物的主動(dòng)外排作用是影響OB的重要因素[5]。影響藥物生物利用度的這些同工酶的抑制，進(jìn)一步影響了藥物-藥物相互作用，藥物或其代謝物在體內(nèi)累積，進(jìn)一步導(dǎo)致了藥物的毒性或其他不良反應(yīng)。Swiss ADME中CYP450及P-gp作為界定OB的參數(shù)，進(jìn)一步提高了數(shù)據(jù)的可靠性。

質(zhì)量高的化合物應(yīng)該具備一些良好的化合物特性，其中包括類藥性(drug-likenesses，DL)。DL是指有良好的臨床療效藥物的物理化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)特性(包括ADME/Tox)。Lipinski指出,類藥化合物系具有足以被人體接受的ADME特性和安全性，在I期臨床試驗(yàn)結(jié)束后，待進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的化合物[6]。從生物學(xué)角度看，DL總和了藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)與藥物的安全性。Swiss ADME提供了5種不同規(guī)則的藥物相似性指標(biāo)(Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge)。在活性成分的篩選中，我們選擇了典型的Lipinski五項(xiàng)原則作為活性成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

最初按照標(biāo)準(zhǔn)，從文獻(xiàn)[7-11]來源的134個(gè)羅勒揮發(fā)油成分，從PubChem等數(shù)據(jù)庫獲取其規(guī)范化的三維分子結(jié)構(gòu)描述符，經(jīng)Swiss ADME獲取相關(guān)的化學(xué)成分參數(shù)，根據(jù)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中OB與DL篩選活性成分，最終從134個(gè)揮發(fā)油中篩選出了6個(gè)有生物活性的成分(Tab 1)。這些成分分別為棕櫚酸(hexadecanoic acid，含量為0.7)、十六酸甲酯(methyl hexadecanoate，含量為0.5)、9,12-十八碳二烯甲酯(9,12-octadecadienoic acid，含量為0.1)、亞麻酸(linolenic acid，含量為13.83)、亞麻酸甲酯(linoleic acid methyl ester，含量為0.32)、6,10,14-三甲基十五烷-2-酮(6,10,14-trimethylpentadecane-2-one，含量為0.09)，均表現(xiàn)為高胃腸道吸收、高類藥性和較高的生物利用度。

Tab 1 Active ingredients of essential oil of Ocimum basilicum L.

*Lipinski's rule of five also known as the Pfizer′s rule of five or simply the rule of five(RO5), including the rule of MW≤500, MLOGP≤4.5, N or O≤10, NH or OH≤5; All of these six active ingredients were violated by MLOGP>4.15 respectively.

2.2 蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果與分析具有生物活性的生物小分子與蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)其活性[12]。因此，預(yù)測(cè)有生物活性小分子的靶標(biāo)是揭示其藥物活性，以及預(yù)測(cè)其潛在的副作用或交叉反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。Swiss Target Prediction是通過二維和三維結(jié)構(gòu)的相似性，來測(cè)量成分與已知配體的組合，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)分子靶點(diǎn)的一個(gè)免費(fèi)的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫是通過已知配體的2D和3D結(jié)構(gòu)相似性，來預(yù)測(cè)出待測(cè)成分的作用靶點(diǎn)。對(duì)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，最終得到了6個(gè)活性成分相對(duì)應(yīng)的91個(gè)蛋白靶點(diǎn)。將這些靶點(diǎn)進(jìn)行整理，最終獲取了與人類同源性的25個(gè)不同的相關(guān)蛋白靶點(diǎn)(Tab 2)，這些預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)蛋白經(jīng)UniProt進(jìn)行核對(duì)并統(tǒng)一。

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果與分析6個(gè)活性成分及其相對(duì)應(yīng)的25個(gè)蛋白靶點(diǎn)，分別以節(jié)點(diǎn)、靶點(diǎn)輸入到網(wǎng)絡(luò)可視化軟件CytoScape6.0中，得到C-T網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 1)，有31個(gè)節(jié)點(diǎn)，47個(gè)邊緣，其中六邊形的節(jié)點(diǎn)表示6個(gè)活性成分，青色圓表示該成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。由Fig 1可以看出，靶點(diǎn)碳酸酐酶(carbonic anhydrase)亞型CA5A、CA7、CA3、CA5B、CA13在化合物十六酸甲酯和6,10,14-三甲基十五烷酮中均被預(yù)測(cè)到，脂氧合酶(lipoxygenase family)亞型ALOX12B、ALOX12、ALOX15、ALOXE3和ALOX15均在亞麻酸甲酯和9,12-十八碳二烯甲酯中作為共有的靶點(diǎn)蛋白。MBNL2和MBNL3對(duì)應(yīng)于十六酸甲酯和棕櫚酸中,大腦中的脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein)FABP7出現(xiàn)在亞麻酸、棕櫚酸和9,12-十八碳二烯甲酯的交集中，過氧化物酶體增殖物激活受體-δ(peroxisome proliferator-activated receptor delta，PPARD)交集在亞麻酸、亞麻酸甲酯和9,12-十八碳二烯甲酯中。C-T網(wǎng)絡(luò)表明，PPARD、PPARA、CA5A、CA7、CA3、CA5B、CA13、ALOX12B、ALOX12、ALOX15、ALOXE3是羅勒揮發(fā)油成分的主要作用靶點(diǎn)。將這些靶點(diǎn)信息利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集分析，選擇P<0.01，結(jié)果顯示這些預(yù)測(cè)靶點(diǎn)蛋白可能主要參與亞油酸代謝過程、脂氧合酶途徑、花生四烯酸代謝過程、糖代謝過程、脂氧素A4生物合成過程、hepoxilin生物合成過程、建立皮膚屏障、細(xì)胞-基質(zhì)黏附的正調(diào)節(jié)、傷口愈合、調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞的吞噬、適應(yīng)性免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控、過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、對(duì)白細(xì)胞介素-13的反應(yīng)、磷脂酰乙醇胺生物合成等過程。

2.4 靶點(diǎn)-通路結(jié)果與分析預(yù)測(cè)到的48個(gè)靶點(diǎn)，通過整理和刪除重復(fù)后，經(jīng)TTD、KEEG等數(shù)據(jù)庫獲取其對(duì)應(yīng)的疾病靶點(diǎn)及通路信息，經(jīng)整理得到19個(gè)不同的作用通路(Tab 3)。結(jié)果顯示，這些靶點(diǎn)主要是通過5-羥色胺突觸(serotonergic synapse)信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路(PPAR signaling pathway)、代謝途徑信號(hào)通路(metabolic pathways)、花生四烯酸代謝信號(hào)通路(arachidonic acid metabolism)等信號(hào)通路。

Fig 1 Active components of basil and their corresponding targets(compound-target, C-T) network

The pink hexagon represents the six active ingredients in basil essential oil, and 25 cyan-blue circles represent the predicted target corresponding to the component.

Tab 3 Predicted signaling pathway based on active ingredient-target

將這些靶點(diǎn)與化學(xué)成分相互聯(lián)系，用Cytoscape6.0構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)(compound-target-pathway)圖(Fig 2)，這些靶點(diǎn)與信號(hào)通路還原到DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行通路分析，選擇P<0.05，結(jié)果預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中描述的主要信號(hào)通路一致。

3 討論

自從2007年 Hopkin提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念以來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)開始用于闡釋中草藥藥效作用機(jī)制，突破了單個(gè)成分治療單一疾病的局限。天然產(chǎn)物具有復(fù)雜的生物學(xué)活性，在中醫(yī)藥領(lǐng)域中，常用于疾病治療，其獨(dú)特的生物活性表現(xiàn)在中草藥與生物體的作用特殊且較為復(fù)雜,進(jìn)入人體后的作用途徑與方式各有差異，有的直接作用于特定靶點(diǎn)，有的經(jīng)代謝后產(chǎn)生新的產(chǎn)物，再作用于特定靶點(diǎn), 還有的通過調(diào)控內(nèi)源性物質(zhì)間接發(fā)揮作用,或作用于不同的多個(gè)靶點(diǎn)，并發(fā)生協(xié)同作用等。

羅勒是在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用歷史悠久的藥材之一，常用其干燥的全草和干燥的果實(shí)。近年來，隨著羅勒水提物研究的不斷深入，明確指出羅勒水提物有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓等藥理活性。臨床上羅勒是治療心腦血管疾病的首選藥材之一。作為天然藥物，羅勒化學(xué)成分多、藥理作用復(fù)雜，用于疾病的作用機(jī)制尚未完全闡明。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，系統(tǒng)地闡述了羅勒揮發(fā)油中的活性成分，對(duì)活性成分預(yù)測(cè)出的蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，結(jié)合信號(hào)通路描述了成分與作用靶點(diǎn)之間的直接聯(lián)系。結(jié)果表明，羅勒揮發(fā)油成分中的亞油酸、亞麻酸甲酯、9,12-十八碳二烯甲酯等揮發(fā)油活性成分的作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)不同的信號(hào)通路，相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)，主要通過脂氧合酶(lipoxygenase family)亞型ALOX15、ALOX12、PTGS1、PPARD、PPARA等靶點(diǎn)，通過5-羥色胺突觸信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、代謝途徑信號(hào)通路、花生四烯酸代謝信號(hào)通路等，共同作用于心血管疾病、神經(jīng)性疾病等不同疾病，從不同角度揭示了活性成分的主要作用靶點(diǎn)和作用于疾病的主要途徑。Magnusson等[13]通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在缺氧狀態(tài)下，心肌細(xì)胞、頸動(dòng)脈斑塊中ALOX15的表達(dá)均有增加。我們的研究結(jié)果表明，羅勒揮發(fā)油中活性成分可能通過花生四烯酸代謝途徑作用于ALOX15，從而治療缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。Levi等[14]研究結(jié)果表明，F(xiàn)ABP5是乳腺癌細(xì)胞增長的關(guān)鍵因素。我們的研究結(jié)果表明，羅勒揮發(fā)油中的有效成分亞油酸能夠與FABP5結(jié)合，從而通過PPAR信號(hào)通路作用于乳腺癌細(xì)胞的增殖。研究證明，亞油酸誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞中肌成束蛋白表達(dá)的增加，亞油酸通過癌細(xì)胞中的肌成束蛋白依賴途徑，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲和MMP-9分泌[15]。本研究結(jié)果吻合了亞油酸抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和促進(jìn)凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步可以從亞油酸是否通過FABP5與PPAR信號(hào)通路，來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移的生物學(xué)驗(yàn)證進(jìn)行研究。除了上述以外，這些成分靶點(diǎn)與信號(hào)通路可以用于治療高脂蛋白血癥、2型糖尿病、遺傳性肥胖、早期嬰兒型癲癇性腦病、抑郁癥、先天性魚鱗癬等皮膚病、神經(jīng)系統(tǒng)障礙性疾病、心血管疾病、癌癥、碳酸酐酶VA缺乏致高氨血癥等疾病。通過對(duì)羅勒揮發(fā)油活性成分-多靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，羅勒揮發(fā)油中的多個(gè)活性成分作用于不同的靶點(diǎn)，經(jīng)不同途徑作用于多種疾病，呈現(xiàn)出天然產(chǎn)物的多成分、多靶點(diǎn)相互調(diào)節(jié)，發(fā)揮“異病同治”的特點(diǎn)。更能清楚地解釋羅勒總提取物中的具體成分經(jīng)某一靶點(diǎn)治療疾病的作用機(jī)制，在藥物研發(fā)中為藥物成分的入選提供了佐證。

Fig 2 Essential active components of basil volatile oil-target-pathway

Purple hexagons indicate active ingredients of volatile oil, blue circles indicate component targets, and red triangles indicate signal pathways for the role of major targets.

本研究結(jié)果與先前研究的羅勒提取物的藥理作用相吻合，說明預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性。此外，對(duì)于上述靶點(diǎn)以外的潛在靶點(diǎn)，相關(guān)文獻(xiàn)研究報(bào)道較少，為今后對(duì)羅勒活性成分及其作用機(jī)制的研究提供了線索。