納豆激酶對(duì)大鼠酒精性肝損傷的改善效果及免疫調(diào)節(jié)作用

卓怡云，呂 婧，劉 穎，王子龍，劉 曼，梁 惠,*

（1.青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266021；2.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球大約有4%的死亡與酗酒有關(guān)，已成為國(guó)際性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。酒精性肝損傷（alcoholic liver injury，ALD）的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，包括免疫功能及脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激等因素，其中，免疫功能失調(diào)在酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中扮演著十分重要的角色[3]。納豆是大豆經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵成的豆制品，在發(fā)酵過(guò)程中，枯草芽孢桿菌可分泌大量納豆激酶，這是一種堿性絲氨酸蛋白酶，以其較強(qiáng)的溶栓能力著稱[4]，此外，還具有降血壓[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]等功效。研究顯示，納豆能提高醉酒小鼠肝臟乙醇脫氫酶活性，拮抗酒精引起的肝臟超氧化物歧化酶活力降低和丙二醛含量升高，抑制肝組織腫瘤壞死因子-α基因表達(dá)，保護(hù)酒精性肝損傷[8]；有研究表明，納豆芽孢桿菌能顯著提高雞脾臟中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的比例，增強(qiáng)免疫功能[9]；納豆激酶被認(rèn)為是納豆中最活躍的功能性成分之一，以上研究均提示，納豆保護(hù)酒精性肝損傷及其改善免疫功能可能是其中的納豆激酶成分發(fā)揮了作用，但關(guān)于納豆激酶能否通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能改善酒精性肝損傷的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以納豆激酶為干預(yù)物，以酒精性肝損傷大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定其肝臟功能指標(biāo)和免疫水平指標(biāo)，初步探討納豆激酶對(duì)酒精性肝損傷大鼠的改善效果及其免疫增強(qiáng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

S P F級(jí)雌性W i s t a r大鼠，8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（魯）2014-0007。

納豆激酶粉（530.39 FU/g） 湯臣倍健股份有限公司；甘利欣（甘草酸二胺膠囊） 江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司；白酒（酒精體積分?jǐn)?shù)56%） 北京紅星股份有限公司；抗TCRαβ-FITC抗體、抗CD161a-PE抗體 美國(guó)BD Biosciences公司；抗CD3-FITC抗體、抗 CD4-PE抗體、抗 CD8a-APC抗體 美國(guó)BioLegend公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Shandon半自動(dòng)組織包埋機(jī) 美國(guó)Thermo公司；LKB-5超薄切片機(jī) 瑞典LKB公司；JEM1200EX透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；600型全自動(dòng)生化分析儀日本日立公司；Accuri C6型流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立及分組

飼喂普通飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，采用隨機(jī)數(shù)字表法按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組，每組12 只。正常對(duì)照組給予生理鹽水灌胃；酒精模型組給予白酒灌胃（第1周灌胃6 mL/（kg·d mb），第2周灌胃8 mL/（kg·d mb），第3周灌胃1 0 m L/（k g·d mb），第4～1 0周灌胃11 m L/（k g·d mb）；納豆激酶對(duì)照組給予530.39 FU/（kg·d mb）納豆激酶灌胃；納豆激酶干預(yù)組給予530.39 FU/（kg·d mb）納豆激酶和酒精灌胃；甘利欣干預(yù)組給予200 mg/（kg·d mb）甘利欣和酒精灌胃。后兩組灌胃受試物1 h后給予酒精，酒精劑量同酒精模型組，其他組在同等時(shí)間給予等量生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)持續(xù)10 周。

1.3.2 標(biāo)本的收集與指標(biāo)檢測(cè)

末次灌胃后禁食不禁水12 h，依次稱質(zhì)量后給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，留取部分全血用于流式細(xì)胞術(shù)測(cè)免疫細(xì)胞比例，剩余血離心分離血清用于生化指標(biāo)檢測(cè)，留取肝、脾組織，脾稱質(zhì)量，固定部分肝臟用于組織病理學(xué)觀察和超微結(jié)構(gòu)觀察，其余-80 ℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 肝組織病理學(xué)觀察

取肝組織（1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm），用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4 肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察

取各組肝組織樣品，體積均為l mm×l mm×l mm，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定24 h，0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3 次；l%鋨酸固定l h，pH 7.2 PBS漂洗3 次；丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂（EPON8l2）包埋，溫箱固化，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3.5 肝功指標(biāo)測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gamma-glutamyl transpeptidase，GGT）、膽堿酯酶（cholinesterase，CHE）活力。

1.3.6 脾指數(shù)的計(jì)算

根據(jù)1.3.2節(jié)方法取樣并稱質(zhì)量后，按下式計(jì)算脾指數(shù)。

1.3.7 T淋巴細(xì)胞亞群及自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞檢測(cè)

每只大鼠腹主動(dòng)脈取全血（抗凝）分3 支試管，每支試管100 μL，分別加入300 μL紅細(xì)胞裂解液，漩渦混勻，冰上放置15 min；4 ℃、450×g離心10 min分離沉淀白細(xì)胞，吸棄上清液；向白細(xì)胞沉淀中加入200 μL紅細(xì)胞裂解液，重復(fù)上述步驟1 次。向各個(gè)試管中加入100 μL pH 7.2 PBS，分別加入3種抗體組合：抗CD3-FITC 1 μL/抗 CD4-PE 2.5 μL、抗CD3-FITC 1 μL/抗CD8a-APC 1 μL、抗TCRαβ-FITC 2 μL/抗CD161a-PE 3 μL（將正常對(duì)照組分5 個(gè)單染對(duì)照，分別只加其中一種抗體，劑量同上）；輕輕振蕩混勻，室溫避光孵育30 min，加2 mL PBS，400×g離心5 min，棄上清液后加1 mL PBS，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差齊的數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用最小顯著性差異法-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)均為α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠肝組織病理學(xué)觀察

圖1 大鼠肝組織HE染色觀察Fig. 1 HE staining of liver tissues in rats

由圖1可知，正常對(duì)照組和納豆激酶對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細(xì)胞排列整齊，胞漿完整充盈；酒精模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索排列紊亂，可見大小不等、形狀不一的胞漿空泡和脂肪變性，中央靜脈和匯管區(qū)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，肝索排列較為整齊，有少量空泡和脂滴，散在可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；甘利欣干預(yù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，偶見空泡和脂滴，肝竇無(wú)擴(kuò)張，肝細(xì)胞無(wú)明顯變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變，匯管區(qū)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)

由圖2可知，正常對(duì)照組和納豆激酶對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核膜完整清晰，線粒體形態(tài)正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，核糖體豐富；酒精模型組細(xì)胞核出萎縮、變形等改變，線粒體數(shù)量減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張斷裂，排列紊亂無(wú)序，核糖體脫落稀疏，溶酶體數(shù)量增加；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組細(xì)胞核明顯恢復(fù)，線粒體病變明顯減輕且數(shù)目增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂與排列紊亂程度改善，溶酶體數(shù)量減少；甘利欣干預(yù)組大鼠核膜較規(guī)則，線粒體結(jié)構(gòu)正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列較整齊，核糖體數(shù)量相對(duì)增多，偶見溶酶體。

圖2 大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)Fig. 2 Ultrastructure of rat liver tissues

2.3 納豆激酶對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、GGT、CHE活力的影響

表1 納豆激酶對(duì)大鼠血清ALT、AST、GGT、CHE活力的影響（n＝12）Table 1 Changes in serum levels of ALT, AST, GGT and CHE in rats from different groups (n= 12)

由表1可知，與正常對(duì)照組相比，酒精模型組大鼠血清ALT、AST、GGT活力顯著上升（P＜0.05），CHE活力顯著下降（P＜0.05）；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組和甘利欣干預(yù)組大鼠血清ALT、AST、GGT活力均顯著下降（P＜0.05），CHE活力有一定程度上升，其中，納豆激酶干預(yù)組大鼠血清ALT、AST、GGT活力下降程度和CHE活力上升程度均低于甘利欣干預(yù)組。納豆激酶對(duì)照組與正常對(duì)照組相比各指標(biāo)無(wú)明顯變化。

2.4 納豆激酶對(duì)酒精性肝損傷大鼠脾指數(shù)的影響

由表2可知，與正常對(duì)照組相比，酒精模型組大鼠體質(zhì)量、脾質(zhì)量和脾指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組和甘利欣干預(yù)組大鼠體質(zhì)量、脾質(zhì)量和脾指數(shù)均有不同程度增高，其中脾指數(shù)顯著增高（P＜0.05），納豆激酶干預(yù)組各指標(biāo)增高程度均高于甘利欣干預(yù)組，納豆激酶對(duì)照組與正常對(duì)照組相比各指標(biāo)無(wú)明顯變化。

表2 納豆激酶對(duì)大鼠脾指數(shù)的影響（n＝12）Table 2 Changes in spleen index in rats from different groups (n= 12)

2.5 納豆激酶對(duì)酒精性肝損傷大鼠T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞比例（占淋巴細(xì)胞比例）的影響

圖3 納豆激酶對(duì)大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的影響Fig. 3 Effect of nattokinase on T lymphocyte subsets and NK cells in peripheral blood of rats

由圖3、表3可知，與正常對(duì)照組相比，酒精模型組大鼠外周血CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例、TCRαβ+CD161+NK細(xì)胞比例均顯著下降（P＜0.05）；與酒精模型組相比，納豆激酶干預(yù)組和甘利欣干預(yù)組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），TCRαβ+CD161+NK細(xì)胞比例有不同程度的上升趨勢(shì)。納豆激酶干預(yù)組各指標(biāo)升高程度均高于甘利欣干預(yù)組，納豆激酶對(duì)照組與正常對(duì)照組相比各指標(biāo)無(wú)明顯變化。

表3 大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞比例（n＝3）Table 3 Proportion of T lymphocyte subsets and NK cells in peripheral blood of rats (n= 3)

3 討 論

酒精在體內(nèi)代謝主要依賴于肝臟，長(zhǎng)期過(guò)度飲酒易導(dǎo)致肝損傷。多項(xiàng)研究表明，酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在免疫功能障礙，長(zhǎng)期飲酒會(huì)抑制機(jī)體的天然免疫細(xì)胞，降低淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的數(shù)量和活性，NK細(xì)胞脫顆粒的能力受損，明顯抑制其免疫功能，引起肝細(xì)胞的直接損傷，增強(qiáng)了長(zhǎng)期嗜酒者發(fā)展為肝炎、肝硬化或肝癌的敏感性[10-12]。納豆是日本傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，類似于中國(guó)的豆豉[13]。納豆激酶最早于1987年由日本學(xué)者等從納豆中發(fā)現(xiàn)[14]，又稱纖溶酶，其改善心血管疾病的功能已進(jìn)行大量研究[15]。郭力榕[8]研究發(fā)現(xiàn)，納豆具有解酒和改善酒精性肝損傷的作用。Xu Xin等[16]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，激活巨噬細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)免疫功能。Inooka等[17]研究表明，枯草芽孢桿菌能增強(qiáng)雞抗綿羊紅細(xì)胞抗體的產(chǎn)生，提高其免疫功能。根據(jù)以上研究，推測(cè)其作用機(jī)制與枯草芽孢桿菌分泌的代謝產(chǎn)物納豆激酶有關(guān)，但相關(guān)研究少見，因此，本研究選擇納豆激酶作為干預(yù)物，探討納豆激酶能否通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性改善酒精誘導(dǎo)的肝損傷。

本研究通過(guò)酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性肝損傷模型，通過(guò)肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，酒精暴露引起大鼠肝臟明顯的組織結(jié)構(gòu)損傷，納豆激酶干預(yù)對(duì)酒精引起的肝臟損傷有顯著改善作用。ALT、AST和GGT是肝細(xì)胞內(nèi)重要的酶，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，致使血清酶活性增加[18]。CHE活力是肝合成蛋白質(zhì)功能指標(biāo)，血液中含量降低表明肝臟功能異常[19]。本實(shí)驗(yàn)血清生化指標(biāo)結(jié)果表明，酒精暴露引起大鼠肝臟功能損傷，納豆激酶安全、無(wú)毒性，能減輕酒精引起的肝臟功能異常，其改善肝臟功能效果低于甘利欣（保肝藥）。

脾臟是機(jī)體最重要的外周免疫器官之一，是免疫細(xì)胞增殖和接受抗原刺激產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，擁有全身循環(huán)T淋巴細(xì)胞的25%，直接參與細(xì)胞免疫，并對(duì)外周血中T淋巴細(xì)胞亞群分布有重要調(diào)節(jié)作用，脾指數(shù)間接反應(yīng)機(jī)體的免疫水平[20]。本實(shí)驗(yàn)脾指數(shù)結(jié)果顯示，酒精攝入引起大鼠免疫功能降低，納豆激酶無(wú)免疫毒性，且能抑制酒精引起的免疫功能降低，其保護(hù)效果優(yōu)于甘利欣。

近年來(lái)的研究表明，T淋巴細(xì)胞的免疫狀態(tài)與酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[21]。T淋巴細(xì)胞亞群水平可評(píng)估機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，CD4+T淋巴細(xì)胞協(xié)助其他細(xì)胞參與免疫應(yīng)答；CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)免疫應(yīng)答有負(fù)性調(diào)節(jié)功能[22]，兩者相互協(xié)調(diào)，相互制約，共同維系機(jī)體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，任何一種細(xì)胞的數(shù)量和功能發(fā)生異常變化時(shí)，都可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂[23]。研究發(fā)現(xiàn)，酒精肝炎患者中通常有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，酒精戒斷和恢復(fù)過(guò)程中，淋巴細(xì)胞數(shù)量沒有顯著改變[24]。Naude等研究結(jié)果顯示，青少年酒精性肝損傷患者中，CD4+和 CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降，導(dǎo)致免疫功能下降，增加傳染病的易感性[25]。Laso等研究顯示，慢性乙醇攝入影響酒精性肝硬化患者的免疫系統(tǒng)，使 CD4+、CD8+等T淋巴細(xì)胞亞群水平降低，T淋巴細(xì)胞總量明顯下降[26]。NK細(xì)胞是機(jī)體中主要的天然免疫細(xì)胞之一，具有殺傷活性。NK細(xì)胞通過(guò)特異性受體與靶細(xì)胞表面特異性配體相結(jié)合，殺傷腫瘤細(xì)胞或受感染細(xì)胞[27]。具有抗病毒和抗腫瘤、抗纖維化的作用，通過(guò)巨噬細(xì)胞的極化調(diào)節(jié)肝臟炎癥和細(xì)胞修復(fù)之間的平衡，在調(diào)節(jié)組織纖維化和癌癥等慢性炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[28]。有研究顯示，NK細(xì)胞能抑制肝星狀細(xì)胞激活，誘導(dǎo)其凋亡[29]，對(duì)宿主具有保護(hù)作用，而酒精攝入會(huì)破壞這種保護(hù)作用[30]；Cui Kele等研究表明，在一個(gè)慢性加單狂歡飲酒小鼠模型中，NK細(xì)胞通過(guò)γ干擾素保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性[31]。本研究結(jié)果顯示，酒精暴露引起大鼠免疫功能失調(diào)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[32]一致；納豆激酶干預(yù)能明顯改善酒精引起的免疫功能失調(diào)，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞比例有關(guān)，其免疫調(diào)節(jié)作用優(yōu)于甘利欣。

綜上所述，長(zhǎng)期一定量酒精攝入會(huì)引起大鼠肝臟損傷和免疫功能失調(diào)，而補(bǔ)充納豆激酶在一定程度上可以保護(hù)酒精性肝損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞比例，提高機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。