葉盛旺，楊最素，李 維，唐云平，黃芳芳，張小軍，余方苗,,*，丁國芳,

（1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021）

生物活性肽是一類含有2～20 個氨基酸的特異性蛋白片段，具有多種潛在的生物學活性[1]。近年來研究發(fā)現，生物活性肽在抗腫瘤、抗氧化及免疫調節(jié)等方面表現出了重要的生理功能。如賈盈露等[2]通過蛋白酶水解的方法從雙齒圍沙蠶中制備了雙齒圍沙蠶多肽（Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe），活性研究表明，其對肺癌A549細胞的增殖具有明顯的抑制作用。趙卉雙[3]用堿性蛋白酶水解大黃魚魚卵水溶性蛋白，經過分離純化得到4 種抗氧化肽（NPCASR、QESEEY、NEVGA、AMCC），通過觀察其對H2O2誘導的HepG-2細胞氧化損傷的保護作用發(fā)現，4 種抗氧化肽的添加可有效的提高細胞存活率，且能明顯促進細胞內HO-1蛋白的表達。鄧志程等[4]以馬氏珠母貝為原料，模擬胃腸道消化的方式對其進行酶解，經多級分離純化后得到兩種寡肽（Ala-Arg/Pro-Met、Val-Arg），通過體外研究發(fā)現兩種寡肽對于脾淋巴細胞的增殖和巨噬細胞吞噬功能的提高都具有明顯的促進作用，表現出了免疫調節(jié)作用的潛在價值。故本研究以RAW264.7巨噬細胞相對增殖率為指標，從青蛤中制備具有免疫調節(jié)作用的生物活性肽。

青蛤是屬簾蛤科的一種雙殼軟體動物，是我國貝類水產養(yǎng)殖中最重要的雙殼貝類之一[5]。近年來的研究表明，青蛤多糖在抗氧化、抗腫瘤及保肝護肝等方面都具有良好的生物活性[6-8]，但關于青蛤多肽（Cyclina Sinensis peptides，CSP）的研究卻鮮見報道。本實驗在前期篩選出的最佳酶及最佳酶解條件的基礎上，以青蛤為原料，通過胃蛋白酶酶解和超濾的方法制備青蛤多肽，而后根據其對RAW264.7巨噬細胞生長與增殖、細胞形態(tài)、吞噬作用、一氧化氮（nitric oxide，NO）分泌和細胞因子分泌及細胞周期的影響，評價其免疫調節(jié)作用，以期為青蛤多肽的進一步研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蛤 舟山市老碶菜場；小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7 中科院上海細胞所。

胃蛋白酶 亞太恒信科技中心（北京）有限公司；DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；NO試劑盒、白介素（interleukin，IL）-1β試劑盒、IL-6試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）試劑盒 南京建成生物工程研究所；中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；細胞周期檢測試劑盒 上海貝博生物。其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1209C型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造公司；Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；SpectraMax M2多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；CKX4型倒置顯微鏡 日本Olympus公司；CF16RXⅡ型高速低溫離心機 日本日立公司；Easy Cyte6 HT-2L流式細胞儀 美國Millipore公司；ALPHA 1-4/LD plus型冷凍干燥機 德國Christ公司；BONA-GM-18型納濾膜分離實驗機 濟南博納生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7于DMEM高糖培養(yǎng)基（含體積分數10%胎牛血清和雙抗）中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細胞長至培養(yǎng)瓶80%以上時進行傳代，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2 CSP酶解液的制備

青蛤去殼取肉，洗凈，勻漿并用異丙醇脫脂6 h，于12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集沉淀洗凈備用；稱取適量的沉淀，根據前期篩選出的最佳酶種及最佳酶解條件，選用胃蛋白酶，在溫度42 ℃、pH 2.0、料液比1∶10、加酶量1 600 U/g條件下酶解8 h；酶解完成后于沸水中水浴15 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，仔細收集上清液即為CSP酶解液。

1.3.3 超濾酶解液的制備

選取孔徑為30、10、5 kDa和3 kDa的超濾膜對1.3.2節(jié)所得的CSP酶解液超濾，收集大于30 kDa、10～30 kDa、5～10 kDa、3～5 kDa、小于3 kDa 5 個分子質量段的超濾液分別命名為CSP-1、CSP-2、CSP-3、CSP-4、CSP-5，再將CSP-5組分經孔徑為150 Da的納濾膜進行脫鹽處理。冷凍干燥后，以100 μg/mL的質量濃度，采用MTT法檢測各組分對RAW264.7細胞生長與增殖的影響，同時設置空白對照組（完全培養(yǎng)液、細胞），篩選出與空白對照組相比，相對增殖率最高的組分進行免疫調節(jié)作用研究。參考陳榕芳等[9]的方法，按公式（1）計算RAW264.7細胞的相對增殖率。

1.3.4 CSP對RAW264.7巨噬細胞免疫調節(jié)作用的研究

1.3.4.1 MTT細胞增殖實驗

參照Deng Chao等[10]的方法，并稍作修改。細胞濃度約為1×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h后棄去培養(yǎng)液，加入質量濃度分別為1 000、500、250、100、50、25、12.5 μg/mL的CSP，同時設置空白對照組（完全培養(yǎng)液、細胞）和1 μg/mL的LPS陽性對照組；孵育36 h后吸去上清液，每孔加入200 μL 5 mg/mL MTT，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h；吸出上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長處測定OD值，按公式（1）計算相對增殖率，根據相對增殖率的大小確定后續(xù)實驗所選取的CSP質量濃度。每個實驗組設置5 個重復。

1.3.4.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

細胞濃度約為1×104個/mL，每孔2 mL接種于6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h后，吸出培養(yǎng)液，加入質量濃度分別為100、50、25 μg/mL的CSP，以LPS（1 μg/mL）為陽性對照組，同時設置空白對照組；孵育36 h后，用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4.3 中性紅吞噬實驗

參照Yu Jie等[11]的方法，并稍作修改。細胞濃度約為1×104個/mL，每孔200 μL接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h后，吸出培養(yǎng)液，分別加入質量濃度為100、50、25 μg/mL的CSP，同時設置LPS（1 μg/mL）陽性對照組和空白對照組；孵育36 h后，吸出上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次，每孔加入不含NaHCO3的培養(yǎng)液180 μL和中性紅染液20 μL，于培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育3 h；棄除上清液，再用PBS洗滌2 次，每孔加入200 μL裂解液，室溫搖床裂解10 min，用酶標儀在540 nm波長處測定OD值，按公式（2）計算吞噬指數。

1.3.4.4 CSP對RAW264.7細胞NO分泌量的影響

參照Lee等[12]的方法，并稍作修改。實驗分組及前期處理步驟同1.3.4.3節(jié)，各組分別加藥物培養(yǎng)36 h后，收集上清液，按試劑盒要求操作，測定各組份中NO的分泌量。

1.3.4.5 CSP對RAW264.7細胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量的影響

實驗分組及細胞前期處理步驟與1.3.4.3節(jié)相同，各組分別加入藥物培養(yǎng)36 h后，用無菌管收集培養(yǎng)上清液；2 000～3 000 r/min離心20 min，再次收集上清液，并按酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒要求操作，檢測各組上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞因子的含量。

1.3.4.6 CSP對RAW264.7細胞周期的影響

細胞濃度約為1×104個/mL，每瓶2 mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，12 h后吸出培養(yǎng)液，分別加入質量濃度為100、50、25 μg/mL的CSP，同時設置LPS（1 μg/mL）陽性對照組和空白對照組，繼續(xù)孵育36 h；棄去營養(yǎng)液，用PBS洗滌2 次，吹散細胞，1 000 r/min離心5 min收集；加入冷的體積分數75%乙醇溶液再次吹散細胞，放入-20 ℃固定1 h；離心除去乙醇，PBS洗滌2 次，300 μL冷的PBS重懸細胞；加入RNase A溶液20 μL，37 ℃水浴30 min，400 目篩網過濾；加入碘化丙啶染液400 μL，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測其結果。

1.4 數據統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 CSP超濾組分對RAW264.7細胞增殖的影響

圖1 CSP超濾組分對RAW264.7細胞增殖的影響Fig. 1 Effects of CSP ultrafiltration fractions on the proliferation of RAW264.7 cells

從圖1中可看出，CSP各超濾組分對RAW264.7細胞的增殖都有一定的促進作用；與空白對照組相比，CSP-1組分對RAW264.7細胞增殖的促進作用具有顯著性差異（P＜0.05）；CSP-3、CSP-4、CSP-5組分對RAW264.7細胞的促進作用具有極顯著性差異（P＜0.01），且CSP-5組分對RAW264.7細胞的相對增殖率最高，因此選擇CSP-5進一步研究。

2.2 CSP-5對RAW264.7巨噬細胞的免疫調節(jié)作用

2.2.1 MTT細胞增殖實驗結果

由圖2可知，LPS和CSP-5均能促進RAW264.7細胞的增殖，但當CSP-5質量濃度過高或過低時對細胞增殖的影響并無顯著性差異。當CSP-5質量濃度為25 μg/mL時，對RAW264.7細胞增殖影響顯著（P＜0.05）；當CSP-5質量濃度為100 μg/mL時，對RAW264.7細胞增殖的影響極顯著（P＜0.01），且相對增殖率最大為（97.56±5.26）%。隨著CSP-5質量濃度的繼續(xù)增加，相對增殖率開始驟降。當質量濃度升至250 μg/mL時，與空白對照組相比，CSP-5對RAW264.7細胞增殖的影響已無統(tǒng)計學意義，故選擇100、50、25 μg/mL CSP-5進行免疫調節(jié)機制的進一步研究。

圖2 CSP-5對RAW264.7細胞增殖能力的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of CSP-5 on the proliferation of RAW264.7 cells

2.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

圖3 倒置顯微鏡觀察RAW264.7細胞形態(tài)（×400）Fig. 3 Morphology of RAW264.7 cells observed by inverted microscope (× 400)

由圖3可看出，與空白組相比，經CSP-5和LPS處理后的細胞在形態(tài)和數目上都發(fā)生了明顯的變化?？瞻讓φ战M細胞數較少，細胞排列緊密且形態(tài)良好，無明顯突起及棱角；經CSP-5作用后，細胞個數明顯增加，且隨著CSP-5質量濃度的增加，分化及出現偽足的細胞數也明顯增加；100 μg/mL CSP-5組RAW264.7細胞的個數與LPS組相當，且部分細胞已開始分化，呈現不規(guī)則形狀。

2.2.3 中性紅吞噬實驗結果

由圖4可知，與空白對照組相比，LPS和CSP-5均能顯著性增強RAW264.7細胞的吞噬能力，且隨著質量濃度的增加，CSP-5對RAW264.7細胞吞噬能力的刺激作用也在不斷地增加；當質量濃度增至100 μg/mL時，吞噬指數達到2.17±0.04，表明CSP-5能有效激活RAW264.7細胞，從而增強機體的免疫力。

圖4 CSP-5對RAW264.7細胞吞噬能力的影響Fig. 4 Effect of different concentrations of CSP-5 on the phagocytosis of RAW264.7 cells

2.2.4 CSP-5對RAW264.7細胞NO分泌量的影響

表1 CSP-5對RAW264.7細胞NO分泌量的影響（n＝3）Table 1 Effect of different concentrations of CSP-5 on NO secretion in RAW264.7 cells (n= 3)

由表1可知，CSP-5對RAW264.7細胞NO分泌量的刺激作用呈劑量相關性，CSP-5質量濃度為25 μg/mL時，細胞NO的分泌量無明顯增加；CSP-5質量濃度為50 μg/mL時，細胞NO分泌量的增加具有顯著性差異（P＜0.05）；CSP-5質量濃度為100 μg/mL時，細胞NO分泌量的增加具有極顯著性差異（P＜0.01），但弱于LPS組。

2.2.5 CSP-5對RAW264.7細胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌量的影響

圖5 CSP-5對RAW264.7細胞IL-1β（A）、IL-6（B）、TNF-α（C）分泌量的影響Fig. 5 Effect of different concentrations of CSP-5 on the secretion of IL-1β (A), IL-6 (B) and TNF-α (C) in RAW264.7 cells

由圖5可看出，CSP-5對RAW264.7細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子分泌量的影響具有劑量相關性。經50、1 0 0 μ g/m L C S P-5處理后細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子I L-1 β、I L-6和T N F-α的分泌量與空白對照組相比都極顯著性增加（P＜0.01）；而當CSP-5質量濃度為100 μg/mL時，培養(yǎng)上清液中IL-1β的分泌量已高于LPS陽性對照組，且細胞因子IL-6的分泌量也與其相當。

2.2.6 CSP-5對RAW264.7細胞周期的影響

圖6 RAW264.7細胞周期的變化Fig. 6 Changes in cell cycle of RAW264.7 cells

圖7 CSP-5對RAW264.7細胞周期的影響Fig. 7 Effect of different concentrations of CSP-5 on cell cycle of RAW264.7 cells

由圖6、7可知，與空白對照組相比，經CSP-5刺激36 h后處于G0/G1期的細胞比例有所上升，處于S期及G2/M期的細胞在總細胞數中的占比有所下降，且占比變化趨勢呈劑量相關性。CSP-5低質量濃度時各期的比例與空白對照組相比無明顯變化，當CSP-5質量濃度達到100 μg/mL時各期的變化趨勢接近于LPS陽性對照組。

3 討 論

免疫系統(tǒng)是一種存在于所有脊椎動物中復雜的防御系統(tǒng)，由多種器官、組織、細胞及因子組成，涉及多種疾?。ㄈ缒[瘤的發(fā)生，細菌、病菌的感染）的病因學及病理生理學機制，分為先天免疫和適應性免疫[19-20]。先天免疫是機體識別“自我”和“非自我”，清除異物，保護機體健康的第一步[21]，其主要由巨噬細胞、粒細胞及多種單核細胞組成，且在抵御細菌或病毒感染以及組織炎癥時能不斷地自我進化[22]。免疫組成細胞中，巨噬細胞有著獨一無二的作用，具有多種生物學功能如吞噬、監(jiān)視及靶向生物體的破壞等，是激活先天免疫應答和誘導適應性免疫應答的重要橋梁[23-24]，因此巨噬細胞也常作為免疫調節(jié)模型來評價活性物質在免疫調節(jié)方面所具有的生物學作用。RAW264.7小鼠單核巨噬細胞系曾被用來描述各種活性物質在分子水平的免疫調節(jié)作用[25]；故本實驗以RAW264.7巨噬細胞為模型，研究青蛤多肽在體外的免疫調節(jié)活性。

免疫調節(jié)是指在免疫調節(jié)劑的參與下，免疫系統(tǒng)對自身免疫應答控制和調節(jié)的過程，其目的是保持機體的穩(wěn)定和內平衡。其中多肽因具有生物活性高、毒性低、易吸收等特點，近年來在免疫調節(jié)劑開發(fā)等方面受到了越來越多國內外研究者的重視。卜天等[26]采用MTT法，以小鼠腹腔巨噬細胞的活性為指標，篩選出溫度62.5 ℃、pH 9.5、加酶量0.08%、酶解時間8 h為胰蛋白酶水解蝦蛄的最佳酶解條件；中性紅吞噬實驗結果表明，在質量濃度為20、25 mg/mL的條件下，蝦蛄多肽對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的增強具有顯著的作用。紀麗娜[27]用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解金槍魚頭肉，經分離純化后作用于小鼠腹腔巨噬細胞，結果表明0.01 mg/mL的酶解液對于巨噬細胞活性和吞噬功能的增強均具有顯著的效果；Griess法和ELISA法檢測結果顯示，酶解液對于巨噬細胞NO、TNF-α、IL-6分泌的影響均無顯著性差異。Wu Wenjia等[28]采用酶解的方法，經分離純化后從麥胚球蛋白中制備出一種新型寡肽（Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala），當質量濃度為20、40、80 μg/mL時，此寡肽能通過TLR2和TLR4模式識別受體激活巨噬細胞RAW264.7，巨噬細胞被激活后，其吞噬能力顯著增強，且NO、IL-6、TNF-α和活性氧的分泌量也顯著增加。多肽生物活性的影響因素主要有氨基酸序列、肽鏈的長度及分子質量等，且多數研究結果表明，小分子肽較大分子肽具有更強的生物活性[29-30]，這可能與小分子肽在體內易吸收、不易被破壞等優(yōu)勢相關。本實驗中CSP-1為酶解液中分子質量大于30 kDa的所有物質，不是單一的組分，其對于RAW264.7細胞的增殖效果優(yōu)于CSP-2可能是由于各組分之間協(xié)同作用的結果，而CSP-2為分子質量在10～30 kDa的組分，成分相對單一，免疫活性物質的含量可能相對較少，所以作用效果不如CSP-1混合組分高。

LPS為革蘭氏陰性菌產生的病原體，具有激活巨噬細胞、誘導免疫應答的作用，在免疫調節(jié)評價實驗中常作為陽性對照出現[31]?；罨蟮木奘杉毎渫淌赡芰γ黠@增強，且能分泌大量生物活性物質如NO和多種細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等[32-33]；因此，巨噬細胞的吞噬功能、NO及相關細胞因子的分泌量可作為評價CSP是否具有激活巨噬細胞從而增強機體免疫力的實驗依據。巨噬細胞作為吞噬細胞，其活性衡量的一項重要依據就是吞噬能力的大小[34]，而中性紅吞噬實驗是檢測其吞噬能力常用的方法[35]；本實驗結果顯示，經CSP-5作用后RAW264.7細胞的吞噬作用與空白對照組相比明顯增強，且與LPS作用后的細胞變化趨勢保持一致。NO是精氨酸通過一氧化氮合酶合成的重要炎癥介質，也是巨噬細胞發(fā)揮吞噬功能的基本條件[36]；經LPS和CSP-5作用后巨噬細胞NO分泌量也明顯增加，與其吞噬增強的研究結果相吻合。為了進一步驗證CSP-5的免疫調節(jié)作用，本實驗還檢測了RAW264.7細胞細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量。細胞因子作為一種重要的信號傳導介質，在機體發(fā)生炎癥時，能誘導巨噬細胞向炎癥部位移動，且有助于機體適應性免疫的產生，預防炎癥的惡化及組織損傷；由圖4、5可知，經CSP-5作用后，RAW264.7細胞分泌細胞因子的能力得到了明顯的增強，作用效果呈劑量相關性，低劑量時促進作用不明顯，當質量濃度達到100 μg/mL時，促進作用接近于陽性對照組，這表明CSP-5具有增強炎性因子分泌的作用。同時，本實驗還進行了細胞周期相關研究，研究結果表明，隨著CSP-5質量濃度的增加，處于G0/G1期的細胞比例上升，S期比例有所下降，由此可得，經CSP-5作用后的巨噬細胞主要在G0/G1期發(fā)生增殖，而G0/G1期也是RNA及蛋白質的合成期；因相關蛋白的表達量增加，所以其吞噬、NO及細胞因子的分泌能力也的到了相應的增強。綜上所述，CSP-5具有激活巨噬細胞、增強機體免疫力的潛在作用。