羅 燾，李雙雙，郭曉萌，韓冬梅*，吳振先,3,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方園藝產(chǎn)品保鮮教育部工程研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3.廣東省荔枝工程技術(shù)中心，廣東 廣州 510642）

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是原產(chǎn)于我國亞熱帶地區(qū)的名貴水果，其風(fēng)味濃郁、色澤紅艷，深受消費(fèi)者喜愛。我國荔枝的栽培面積和總產(chǎn)量均居世界第一，然而由于荔枝特殊的果實(shí)結(jié)構(gòu)和旺盛的生理活動，采后容易發(fā)生褐變和腐爛，加之國外檢疫標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)苛，其出口量很少[1]，僅占世界荔枝貿(mào)易量的1/5。單質(zhì)硫燃燒產(chǎn)生具有強(qiáng)還原性的SO2，以合適的濃度熏蒸果蔬干、罐頭等食品及葡萄、荔枝等園藝產(chǎn)品，不需冷藏即可抑制微生物的生長，防褐防腐，保持產(chǎn)品的色澤、營養(yǎng)和新鮮度，從而達(dá)到長期貯藏的目的[2]。熏硫使荔枝果皮中多酚氧化酶的活性受到抑制，從而延緩荔枝的褐變，延長保鮮期，可滿足遠(yuǎn)洋運(yùn)輸?shù)哪康腫3]。在龍眼和葡萄等其他水果上也有類似發(fā)現(xiàn)[4-6]：SO2通過降低‘石硤’龍眼果皮細(xì)胞質(zhì)的pH值、抑制多酚氧化酶活性、保持游離酚和總酚含量、保護(hù)還原型抗壞血酸等作用抑制龍眼果實(shí)貯藏期間的褐變[5]；熏硫不僅可抑制葡萄果皮多酚氧化酶的活性，同時(shí)還抑制丙二醛含量的上升[6]。由于其具有用量少、價(jià)格低廉、使用簡便、易揮發(fā)等優(yōu)點(diǎn)，熏硫處理成為荔枝果實(shí)出口遠(yuǎn)銷最常用的保鮮方法[7]。然而，熏硫后荔枝果實(shí)易出現(xiàn)外觀品質(zhì)下降和硫殘超標(biāo)的問題。荔枝硫殘的主要形式亞硫酸鹽（SO23-）對細(xì)胞具有毒害作用，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)二硫鍵的斷裂或水解[8]，含量超標(biāo)會危害人體健康，國際貿(mào)易中對荔枝的硫殘有嚴(yán)格限制；因此，荔枝熏硫后通常會進(jìn)行適度的脫硫處理，恢復(fù)著色和降低硫殘，同時(shí)基本保留熏硫的殺菌保鮮效果。目前對熏硫荔枝果實(shí)中亞硫酸鹽含量動態(tài)變化的研究較多，但對熏硫和脫硫后荔枝果實(shí)自身降解亞硫酸鹽過程的研究仍鮮見報(bào)道。

荔枝果皮是熏硫直接作用的部位，SO2氣體首先會進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)外體與水結(jié)合形成，之后由果皮向果肉中擴(kuò)散。影響熏硫荔枝果實(shí)中亞硫酸鹽殘留量的因素有很多，主要包含內(nèi)外兩大因素，外因是熏硫的濃度和時(shí)間，內(nèi)因則是果實(shí)本身對SO2的吸收和代謝能力的強(qiáng)弱。SO2作為一種空氣污染物，植物對SO2的響應(yīng)和解毒機(jī)制已在擬南芥和楊樹等多種模式植物中進(jìn)行了較深入的研究[9]，SO2代謝相關(guān)的氧化還原途徑中的關(guān)鍵酶已經(jīng)研究得較為透徹。植物面對SO2脅迫時(shí)，通常有3 種應(yīng)對機(jī)制[10]：1）通過調(diào)整氣孔開合度控制進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)SO2的量，降低毒害；2）經(jīng)氧化路徑，由過氧化物酶體系中的亞硫酸鹽氧化酶（sulfite oxidase，SO）將SO32-氧化成，可能進(jìn)一步貯存在液泡中，作為有機(jī)硫合成的底物儲存起來，也可能進(jìn)入質(zhì)體中當(dāng)硫缺乏時(shí)重新被利用[11]，或者被腺苷-5’-磷酰硫酸還原酶（adenosine 5’-phosphosulfatezoline reductase，APR）重新還原成后再進(jìn)入還原途徑[10-11]；3）直接被運(yùn)輸至質(zhì)體中，被亞硫酸鹽還原酶（sulfite reductase，SiR）還原成S2-并經(jīng)過乙酰絲氨酸裂解酶（O-acetylserine (thiol) lyase，OAS-TL）復(fù)合體轉(zhuǎn)化含硫化合物[10-11]。當(dāng)植物暴露在SO2或H2S的環(huán)境中，SO活性升高，同時(shí)其APR活性受到抑制，以清除多余的；Baillie等[10]研究發(fā)現(xiàn)氧化途徑SO活性的增加是火山巖附近的植物應(yīng)對高濃度SO2和H2S的主要方式；Brychkova等[13]研究發(fā)現(xiàn)注射入擬南芥和番茄葉片中的亞硫酸鹽在3 h后即分別有80%和91%被氧化成硫酸鹽。另外，SO23-還可能經(jīng)還原途徑轉(zhuǎn)化成硫醇或含硫化合物以降低毒害[14-16]。然而前人這些報(bào)道主要以植物葉片或根系為研究對象[8-20]，有關(guān)經(jīng)高濃度SO2處理后果實(shí)對殘留SO2的代謝機(jī)制以及脫硫處理對硫殘代謝影響的研究仍鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過分析脫硫?qū)ρ颉谌~’荔枝采后品質(zhì)、亞硫酸鹽殘留量和果肉中亞硫酸鹽降解相關(guān)酶的活力和基因表達(dá)的影響，解析荔枝果肉中亞硫酸鹽的降解機(jī)理，為荔枝采后熏硫保鮮及硫殘留控制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料為采自廣東茂名市‘黑葉’荔枝（Litchi chinensis Sonn. cv. Heiye）果實(shí)，采摘后4 h內(nèi)運(yùn)回廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。散去田間熱后，挑選無病蟲害及機(jī)械傷、大小、成熟度（八成熟）一致的果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Milli-Q A10制備去離子水 美國Millipore公司；施保克（Prochloraz） 江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司；脫硫劑（純度99%） 泰安嘉納利環(huán)保科技有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 美國Sigma-Aldrich公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA提取試劑盒（Quick RNA Isolation Kit）北京華越洋生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)） 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；LightCycler?480 SYBR Green I Master 上海羅氏制藥有限公司；其他試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司（上海）生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-300全自動測色色差計(jì) 日本Minolta公司；MA150水分測定儀 德國Satorious公司；DDS-307電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；GC-17A氣相色譜儀 日本島津公司；UV-1800PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)公司；LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 果實(shí)處理及取樣

取15 kg果實(shí)用500 mg/kg 的施?？私? min，設(shè)為對照（CK）。取30 kg果實(shí)均勻鋪開在熏蒸室（3 m3）的烘架上，將20 g硫磺（即6.67 g/m3）倒入錫箔紙盒中，置于熏蒸室中點(diǎn)燃，熏蒸25 min。果實(shí)取出放置15 min冷卻，平均分為兩組：一組為熏硫處理組；另一組為脫硫處理組，果實(shí)用30 g/L脫硫劑浸泡4 min。每個(gè)處理組重復(fù)3 次。所有樣品均用聚乙烯袋（厚0.025 mm）分裝，每袋30 個(gè)果（400～450 g），于（4±1）℃冷庫貯藏。對處理前（before fumigation，BF，即鮮樣）、處理后（after fumigation，AF，即貯藏0 d）及貯藏8、16、24、32、40 d和48 d果實(shí)進(jìn)行取樣。每個(gè)處理從1 袋果實(shí)中取20 個(gè)果，果皮和果肉分離后，立即分別用液氮冷凍，研磨成細(xì)塊后，保存于-80 ℃冰箱，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣重復(fù)3 次。

1.3.2 果實(shí)果面色差測定

每個(gè)處理隨機(jī)取10 個(gè)果實(shí)，用CR-300全自動色差計(jì)測定果皮L*值（亮度）、色度值a*（紅-綠度）。每個(gè)處理組重復(fù)3 次。

1.3.3 褐變指數(shù)的評定

果皮褐變指數(shù)參照吳振先[21]的方法，根據(jù)外果皮褐變面積分6 個(gè)等級：0級，果皮無明顯褐斑；1級，龜裂片尖端有零星褐點(diǎn)，褐變面積≤25%；2級，褐斑面積＜0.5 cm2，25%＜褐變總面積≤33%；3級，0.5 cm2≤褐斑面積＜1 cm2，33%＜褐變總面積≤50%；4級，褐斑面積≥1 cm2，50%＜褐變總面積≤75%，局部有紅色；5級，75%＜褐變總面積≤100%，長霉或外滲流汁，無商品價(jià)值。每個(gè)處理隨機(jī)選取20 個(gè)果實(shí)進(jìn)行觀察分級，重復(fù)3 次。計(jì)算方法見式（1）。

1.3.4 腐爛率測定

觀察每袋果實(shí)長霉流汁的情況，統(tǒng)計(jì)腐爛果實(shí)的數(shù)量，每個(gè)處理重復(fù)3 次。計(jì)算方法如式（2）所示。

1.3.5 果皮細(xì)胞膜透性測定

參照陳建勛等[22]的方法，略有改動。剝?nèi)?0 個(gè)荔枝的果皮，用打孔器（直徑0.5 mm）打取30 個(gè)果皮小圓片（每果3 片），用蒸餾水清洗3 次，取出其中10 個(gè)轉(zhuǎn)入50 mL試管中，加入25 mL蒸餾水，30 min后用電導(dǎo)率儀測定浸泡液的電導(dǎo)率（D1）。將試管蓋好放入沸水中水浴15 min?？焖倮鋮s至室溫后，測定此時(shí)的電導(dǎo)率（D2）。以蒸餾水作空白，測定的電導(dǎo)率計(jì)為D0，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，相對電導(dǎo)率計(jì)算見式（3）。

1.3.6 果皮水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

每個(gè)處理隨機(jī)挑選3 個(gè)果實(shí)，剝?nèi)」?，擦干?nèi)果皮汁液，稱取1 g果皮放入水分測定儀中測定果皮水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 呼吸強(qiáng)度測定

參照季作梁等[23]的方法，略作改動。隨機(jī)挑選20 個(gè)果實(shí)放入密封罐中，在貯藏溫度下密封2 h后用一次性注射器抽氣1 mL，用氣相色譜儀測定。氣相色譜儀的工作條件為：Molecular sieve 5A和Poraoak Q同心雙層色譜柱，柱溫為50 ℃，載氣為氦氣，熱導(dǎo)檢測器工作溫度設(shè)定為150 ℃。每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次。呼吸強(qiáng)度以每小時(shí)每千克鮮質(zhì)量果實(shí)釋放的CO2質(zhì)量表示。

1.3.8 亞硫酸鹽殘留量測定

亞硫酸鹽殘留量測定參考GB 5009.34—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二氧化硫的測定》，并稍作改動。稱取5 g果肉或1 g果皮，液氮凍透后，用磨樣機(jī)粉碎，依次加入2 mL 50 g/L ZnSO4溶液、5 mL 30 g/100 mL硼砂溶液，進(jìn)一步在研缽中研磨。研磨后的溶液過濾并移入100 mL容量瓶中，少量蒸餾水涮洗研缽，過濾至容量瓶中。加入4 mL 0.5 mol/L NaOH，搖勻，反應(yīng)5 min；加入4 mL酸溶液（V（H2SO4）∶V（蒸餾水）＝1∶71），搖勻，反應(yīng)1～2 min后加入20 mL四氯汞鈉吸收劑（1 000 mL水中加入13.6 g HgCl2和0.6 g NaCl，磁力攪拌過夜，過濾后制成），搖勻，以蒸餾水定容至100 mL，經(jīng)濾紙過濾得到澄清樣品溶液。取2.0 mL樣品溶液，加入5.0 mL四氯汞鈉吸收劑、1.0 mL體積分?jǐn)?shù)0.2%甲醛溶液和1.0 mL鹽酸副品紅顯色劑（0.1 g鹽酸副品紅溶解于200 mL水，加100 mL濃鹽酸，以水定容至500 mL），混勻后靜置20 min，溶液形成紫紅色絡(luò)合物。紫外-可見分光光度計(jì)測定溶液在550 nm波長處的吸光度（A550nm），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。果皮和果肉中亞硫酸鹽含量的計(jì)算分別見公式（4）、（5），結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.9 SO、APR、SiR、SAT、OAS-TL活力測定

SO活力參考Xia Zongliang等[19]的方法進(jìn)行測定，以每分鐘催化2 μmol K3Fe(CN)6還原所需酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）；APR活力參照Scheerer等[20]的方法，采用K3Fe(CN)6還原法進(jìn)行測定，以每分鐘催化1 μmol K3Fe(CN)6還原所需酶量為1 個(gè)酶活力單位；SiR活力參照Ostrowski等[14]的方法進(jìn)行測定，以每分鐘催化1 μmol NADPH氧化所需酶量為1 個(gè)酶活力單位；SAT活力參照Randewig等[15]的方法進(jìn)行測定，以每分鐘催化1 μmol DTNB反應(yīng)為1 個(gè)酶活力單位；OAS-TL活力參照Chronis等[16]的方法進(jìn)行測定，以每分鐘催化生成1 μmol Cys為1 個(gè)酶活力單位。結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.10 荔枝果肉中SO、APR、SiR、SAT和OAS-TL的基因表達(dá)量分析

樣品加入液氮研磨成粉末，嚴(yán)格參照快速RNA提取試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。RNA濃度及純度檢測合格后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（含去基因組操作）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA第一鏈置于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｒ岳笾ctin蛋白編碼基因作為內(nèi)參基因。SO、APR、SiR、SAT和OAS-TL基因序列由NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索，經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)荔枝基因組數(shù)據(jù)檢索驗(yàn)證后獲得，設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列見表1。使用SYBR Green I Master熒光染料和LightCycler?480（384 孔模塊）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析基因表達(dá)量。采用Schmittgen等[24]的2-ΔΔCt方法計(jì)算相對表達(dá)量。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Origin 8.5軟件作圖，Adobe Photoshop CS3軟件進(jìn)行圖片編輯。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，采用單因素多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對‘黑葉’荔枝采后品質(zhì)的影響

由圖1A可知，‘黑葉’荔枝果實(shí)經(jīng)熏硫后，果皮褪去紅色變成黃綠色，經(jīng)脫硫處理后，果面紅色有所恢復(fù)，貯藏16 d后，脫硫處理組整個(gè)果面恢復(fù)紅色，較對照組果實(shí)的外觀更鮮艷，而熏硫果實(shí)直至貯藏32 d才開始輕微復(fù)色。整個(gè)貯藏期間，各組果皮亮度L*值從大到小依次為：熏硫處理組＞脫硫處理組＞對照組（圖1B）。熏硫處理使荔枝果面的a*值大幅降低，貯藏16 d才開始逐步回升，32 d后高于對照組；脫硫處理可提高熏硫荔枝果面a*值，仍顯著低于對照組，但脫硫果實(shí)在貯藏的0～16 d，其a*值迅速升高（圖1C）。各處理組在貯藏過程中L*和a*值的變化表明，與對照相比，熏硫和脫硫處理能更好地維持果面亮度，但是熏硫后果實(shí)恢復(fù)紅色的速度和程度低于脫硫果實(shí)。這些結(jié)果與果皮褐變和腐爛率的變化相符。

由圖1D可知，貯藏期間對照組果皮褐變指數(shù)呈現(xiàn)快速上升趨勢，第16天褐變指數(shù)即超過3，出現(xiàn)明顯褐變，而熏硫和脫硫荔枝的褐變指數(shù)上升緩慢，至貯藏48 d仍未超過3。由圖1E可知，對照組果實(shí)在貯藏24 d后開始腐爛，之后腐爛率快速上升，至貯藏48 d達(dá)到66.67%，兩個(gè)處理組果實(shí)的腐爛率上升緩慢，至貯藏第48天，仍不到10%。值得注意的是，熏硫和脫硫荔枝的褐變指數(shù)和腐爛率在各個(gè)時(shí)期均無顯著差異。總體上脫硫處理與熏硫處理效果相當(dāng)，相比對照，可延長荔枝果實(shí)兩周以上的貨架期（數(shù)據(jù)未列出）。整個(gè)貯藏過程中，對照組和處理組荔枝的可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈持續(xù)下降趨勢，但在3 組果實(shí)間無顯著差異（數(shù)據(jù)未列出）；因此，熏硫和脫硫處理對果肉可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著影響。以上結(jié)果表明，脫硫可加快熏硫荔枝果實(shí)復(fù)色，且延緩荔枝果皮褐變、減少腐爛的效果與熏硫處理無顯著差異。

圖1 不同處理對‘黑葉’荔枝4 ℃貯藏期間品質(zhì)的影響Fig. 1 Effects of different treatments on the quality of ‘Heiye' litchi stored at 4 ℃

2.2 不同處理對‘黑葉’荔枝果實(shí)采后生理指標(biāo)的影響

圖2 不同處理對‘黑葉’荔枝4 ℃貯藏期間果皮水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、呼吸強(qiáng)度（B）和相對電導(dǎo)率（C）的影響Fig. 2 Effects of different treatments on water content in pericarp (A),respiration rate (B) and relative conductivity (C) of ‘Heiye' litchi stored at 4 ℃

貯藏期間，熏硫、脫硫和對照組‘黑葉’荔枝果皮水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，各處理組水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)從小到大排列依次為：脫硫處理組＜熏硫處理組＜對照組（圖2A）。貯藏的0～8 d，各組果實(shí)的呼吸強(qiáng)度均急劇下降。貯藏期間，熏硫和脫硫果實(shí)的呼吸強(qiáng)度整體低于對照組果實(shí)，而脫硫果實(shí)與熏硫果實(shí)無顯著差異（圖2B）。熏硫和脫硫荔枝的果皮相對電導(dǎo)率較對照組提高；對照組荔枝果皮相對電導(dǎo)率隨貯藏時(shí)期不斷上升，由15.26%（鮮樣）升至貯藏第48天的54.12%；兩處理組果實(shí)在貯藏的0～8 d呈下降趨勢，之后緩慢上升；除貯藏第48天，相同貯藏時(shí)間的脫硫果實(shí)均總體高于熏硫果實(shí)（圖2C）。因此，相比熏硫，脫硫更大幅度地降低了荔枝果皮水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并提高了果皮相對電導(dǎo)率，而抑制呼吸作用的效果則與熏硫相近。

2.3 脫硫?qū)ρ颉谌~’荔枝果皮和果肉亞硫酸鹽含量的影響

圖3 不同處理對‘黑葉’荔枝4 ℃貯藏期間果皮（A）和果肉（B）亞硫酸鹽殘留量的影響Fig. 3 Effects of different treatments on residual sulfite in pericarp (A)and pulp (B) of ‘Heiye' litchi stored at 4 ℃

亞硫酸鹽含量是影響熏硫荔枝果實(shí)質(zhì)量安全的一項(xiàng)重要指標(biāo)。熏硫后，‘黑葉’荔枝果皮中亞硫酸鹽含量高達(dá)486.5 mg/kg，經(jīng)脫硫處理后，降至248.1 mg/kg。貯藏期間，兩個(gè)處理組果皮中亞硫酸鹽含量呈逐步下降的趨勢，且脫硫荔枝果皮亞硫酸鹽含量顯著低于熏硫荔枝果皮（圖3A）。熏硫荔枝果肉中亞硫酸鹽含量由貯藏第0天的13.1 mg/kg升至第16天的29.2 mg/kg，之后開始下降，貯藏第48天為11.8 mg/kg（圖3B），低于NY 1440—2007《熱帶水果中二氧化硫殘留限量》中規(guī)定的荔枝鮮果二氧化硫殘留限量（≤30 mg/kg），略高于美國食品與藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）要求的果肉亞硫酸鹽殘留限量（≤10 mg/kg）[25]。脫硫荔枝果肉中亞硫酸鹽含量在貯藏0 d時(shí)為10.7 mg/kg，貯藏8 d即降至2.8 mg/kg，貯藏16 d降至接近對照組的水平，且遠(yuǎn)低于NY 1440—2007標(biāo)準(zhǔn)和FDA規(guī)定的殘留限量。

2.4 不同處理對‘黑葉’荔枝果肉中亞硫酸鹽代謝相關(guān)酶活力的影響

圖4 不同處理對‘黑葉’荔枝4 ℃貯藏期間果肉中亞硫酸鹽代謝相關(guān)酶活力的影響Fig. 4 Effects of different treatments on the activity of enzymes related to sulfite metabolism in pulp of ‘Heiye' litchi stored at 4 ℃

由圖4A～E可知，與對照組相比，熏硫后，‘黑葉’荔枝果肉中SO、APR、SiR、SAT和OAS-TL的活力分別提高了約2.4、0.6、1.0、17.0 倍和0.2 倍；脫硫后荔枝果肉中SO和APR活力與熏硫荔枝果肉無顯著差異，SiR和OAS-TL活力相比熏硫荔枝果肉略有下降，SAT活力則顯著降低（P＜0.05）。整個(gè)貯藏過程中，脫硫與熏硫荔枝果肉中SO活力無顯著差異，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組荔枝果肉中SO活力均較對照組提高2 倍（圖4A）。由圖4B可知，對照組荔枝果肉中APR活力變化不大，熏硫處理和脫硫處理后短時(shí)期內(nèi)荔枝果肉中APR活力較對照組顯著提高，之后快速下降，貯藏第16天顯著低于對照組，隨后上升，貯藏32 d后與對照組無顯著差異。由圖4C可知，熏硫處理后，SiR活力曲折上升，至貯藏24 d達(dá)到峰值后迅速下降，貯藏40 d之后與對照組無顯著差異；貯藏0～24 d，脫硫處理組果肉中SiR活力低于熏硫處理組，貯藏32 d達(dá)到最高值后下降；各組在貯藏末期SiR活力無顯著差異（P＞0.05）。

由圖4D可知，整個(gè)貯藏期間對照組荔枝果肉中SAT活力穩(wěn)定保持在較低水平，熏硫后荔枝果肉的SAT活力較對照組顯著提高，貯藏第8天，其SAT活力較對照組提高26.7 倍，8 d后緩慢下降，貯藏第48天，熏硫荔枝果肉SAT活力上調(diào)的倍數(shù)最低，仍比對照組高8.6 倍；而脫硫果肉的SAT活力在貯藏0 d較對照組僅提高11.1 倍，之后快速下降，貯藏8～32 d期間，其SAT活力上下波動，但相同時(shí)期脫硫處理組仍高于對照組，貯藏32 d后則與對照組無顯著差異。由圖4E可知，貯藏的0～24 d，熏硫和脫硫荔枝果肉中OAS-TL活力均高于同期對照組，期間熏硫荔枝果肉中OAS-TL活力整體呈下降趨勢，而脫硫荔枝果肉中OAS-TL活力呈逐漸上升趨勢，貯藏32 d后處理組與對照組差異不大。因此，受熏硫處理誘導(dǎo)，SO和SAT活力上調(diào)幅度最大，SiR和OAS-TL活力上調(diào)幅度較小，APR活力總體呈下調(diào)狀態(tài)，而脫硫降低了SAT活力的上調(diào)幅度但并未影響SO活力的上調(diào)幅度。

2.5 不同處理對‘黑葉’荔枝果肉中亞硫酸鹽代謝相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

圖5 不同處理對‘黑葉’荔枝4 ℃貯藏期間果肉中亞硫酸鹽代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 5 Effects of different treatments on the expression of genes related to sulfite metabolism in pulp of ‘Heiye' litchi stored at 4 ℃

由圖5A～E可知，貯藏期間對照組荔枝果肉中SO、APR、SiR、SAT和OAS-TL的相對表達(dá)量總體上均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。由圖5A可知，貯藏0～40 d，熏硫‘黑葉’荔枝果肉中SO相對表達(dá)量持續(xù)上升，第40天達(dá)到最大值后下降；而脫硫‘黑葉’荔枝果肉中SO相對表達(dá)量在貯藏0～32 d持續(xù)上升并顯著高于熏硫果肉，第40天則顯著低于熏硫果肉；貯藏0～8 d，熏硫和脫硫‘黑葉’荔枝果肉中SO相對表達(dá)量顯著低于對照組，貯藏16～40 d則高于對照組。由圖5B可知，整個(gè)貯藏期間，熏硫荔枝果肉的APR相對表達(dá)量總體低于對照組和脫硫果肉，而脫硫果肉中APR相對表達(dá)量在貯藏16～40 d顯著高于對照組。由圖5C可知，貯藏期間對照組和處理組荔枝果肉中SiR的相對表達(dá)量波動變化，貯藏0～8 d，各組SiR相對表達(dá)量從大到小依次為：對照組＞脫硫處理組＞熏硫處理組，貯藏16～32 d時(shí)為：脫硫處理組＞熏硫處理組＞對照組。由圖5D可知，貯藏0～8 d，各組SAT的相對表達(dá)量從大到小依次為：對照組＞脫硫處理組＞熏硫處理組，而貯藏16～32 d時(shí)為：脫硫處理組＞熏硫處理組＞對照組。由圖5E可知，除貯藏第24天，熏硫‘黑葉’荔枝果肉中OAS-TL的相對表達(dá)量顯著低于對照組果肉，而脫硫荔枝果肉中OAS-TL的相對表達(dá)量隨貯藏時(shí)間延長逐漸上升，貯藏16 d后，高于對照組和熏硫果肉。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，整個(gè)貯藏期間熏硫和脫硫‘黑葉’荔枝果肉中SO活力均較對照組提高2 倍以上，并維持在較穩(wěn)定水平，推測‘黑葉’荔枝果實(shí)能快速響應(yīng)SO2脅迫產(chǎn)生的信號，由果皮傳遞至果肉，并主要通過提高SO活力來達(dá)到快速清除果肉中SO23-的目的。這與Baillie等[10]報(bào)道的火山巖附近的植物通過增加氧化途徑的SO活力來應(yīng)對高濃度SO2的結(jié)果相符。脫硫雖然降低了SO23-濃度，但并沒有降低果肉組織中SO活力和表達(dá)水平，表明SO酶促氧化SO23-生成SO24-是熏硫荔枝解除SO23-毒害最直接和穩(wěn)定的方式，與前人的研究觀點(diǎn)[26]相符。另一方面，荔枝果肉中還原途徑的APR活力在熏硫及脫硫處理后呈現(xiàn)短時(shí)間（BF至AF）的上升，之后時(shí)期出現(xiàn)大幅下降；APR相對表達(dá)量在熏硫后較對照組下調(diào)，而脫硫后較對照組上調(diào)表達(dá)，表明由SO氧化途徑生成的SO24-主要保留在液泡中，作為有機(jī)硫合成的底物儲存起來，而并不進(jìn)入質(zhì)體中被APR重新還原成SO32-后再進(jìn)入還原途徑。熏硫荔枝果肉中還原途徑的SiR、SAT和OAS-TL活力顯著上調(diào)，表明SO23-運(yùn)入質(zhì)體后需持續(xù)還原成S2-并經(jīng)過SAT/OAS-TL復(fù)合體合成半胱氨酸和谷胱甘肽等物質(zhì)以解除其細(xì)胞毒性，同時(shí)半胱氨酸和谷胱甘肽等物質(zhì)可中和SO氧化SO2-3時(shí)產(chǎn)生大量的H2O2等自由基，以避免熏硫荔枝果實(shí)的生理失調(diào)。值得注意的是，整個(gè)貯藏期間熏硫荔枝果肉中SAT活力較對照組顯著提高，在貯藏8 d時(shí)最高，較對照組提高26.7 倍，而脫硫果肉中SAT活力僅在貯藏0 d較對照組提高11.1 倍，之后迅速下降，貯藏32 d后則與對照組無顯著差異，表明脫硫大幅降低SO32-濃度后會減弱SAT活力的誘導(dǎo)上調(diào)，因此推測還原途徑可能主要是在SO32-濃度過高且超出SO氧化降解能力時(shí)，作為氧化途徑的補(bǔ)充來協(xié)助降解SO2-3。

熏硫和脫硫荔枝果肉中SO基因的相對表達(dá)量在貯藏16 d后才開始顯著高于對照組，滯后于SO活力的上調(diào)，推測這可能有助于維持穩(wěn)定的SO蛋白豐度。與SO不同，熏硫和脫硫荔枝果肉中SAT基因的表達(dá)則和SAT活力的上調(diào)完全不相符。前人研究推測SO除了受轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控之外，可能還受到翻譯后修飾水平的調(diào)控[27]，與此類似，SAT也可能存在轉(zhuǎn)錄和翻譯之外其他水平的調(diào)控。值得注意的是，硫酸鹽、亞硫酸鹽、半胱氨酸、SO2和以羰基相連的含硫化合物均可作為底物通過硫代謝合成植物內(nèi)源H2S[28]。H2S作為繼NO和CO之后確認(rèn)的第3種氣體信號分子，可能參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育[28]、增強(qiáng)植物生物與非生物逆境的抗性[28-29]、調(diào)節(jié)脫落酸依賴的氣孔關(guān)閉和乙烯誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉[30-32]、延緩植物衰老、顯著延緩鮮切花和果實(shí)采后品質(zhì)劣變[33-34]。熏硫?qū)笾麑?shí)的保鮮效果是否是由于殘留的亞硫酸鹽參與合成荔枝果實(shí)內(nèi)源H2S，從而影響荔枝果實(shí)采后衰老進(jìn)展，目前仍未知，需要進(jìn)一步的深入研究和驗(yàn)證。

熏硫處理是出口荔枝常用的防腐保鮮方法，但是實(shí)際生產(chǎn)中易因熏硫使用過量導(dǎo)致硫殘問題，影響熏硫荔枝進(jìn)入歐美市場。熏硫后，荔枝果實(shí)中的硫殘降解是一個(gè)緩慢的過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荔枝果肉可能主要通過提高氧化途徑SO和還原途徑SAT的酶活力而非基因表達(dá)量來降低細(xì)胞內(nèi)亞硫酸鹽殘留。SO酶促氧化SO32-生成SO42-的反應(yīng)可能在荔枝果肉亞硫酸鹽降解過程中起主導(dǎo)作用，當(dāng)SO32-濃度超出SO降解能力時(shí)，SAT起主導(dǎo)作用的還原途徑作為補(bǔ)充促進(jìn)亞硫酸鹽的降解。本實(shí)驗(yàn)采用的熏硫（6.67 g/m3）結(jié)合脫硫劑（30 g/L）的處理方法可加快熏硫‘黑葉’荔枝果實(shí)的復(fù)色，并獲得與熏硫處理相當(dāng)?shù)姆栏ｕr效果，相比對照，可延長2 周以上的保鮮期。同時(shí)，該處理大幅降低了熏硫果皮和果肉的亞硫酸鹽殘留，保障了食用安全，比單獨(dú)熏硫處理具有明顯的技術(shù)性進(jìn)步。