陳鳳英，楊林，黎祥妨

（商洛學(xué)院化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院/陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西商洛726000）

血清蛋白與藥物小分子之間的相互作用，是生物化學(xué)領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容之一。血清白蛋白是生物體血漿中含量最豐富的運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)，能夠與類別廣泛的內(nèi)源和外源性物質(zhì)結(jié)合，將藥物分子輸送到人體各個(gè)部位。小分子藥物被生物體吸收后，與血漿蛋白可逆性結(jié)合后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，并且小分子藥物與血漿蛋白的可逆性結(jié)合能夠影響其在生物體內(nèi)的分布、生物活性和毒性。因此，從光譜學(xué)角度研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的過程和機(jī)理，對(duì)于深入研究小分子藥物在生物體內(nèi)的運(yùn)輸、分布以及在人體的代謝過程具有十分重要的意義[1-3]。丹參酮ⅡA是中藥丹參中的活性成分之一，難溶于水，口服吸收效果較差。丹參酮ⅡA-磺酸鈉是由丹參酮ⅡA經(jīng)過磺化而成的鹽[4]，具有縮小心肌梗死面積、改善胃黏膜血液供應(yīng)、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)降低血液粘度、抑制血小板集聚及抗血栓形成等作用，臨床上主要用于心絞痛、冠心病、急性腦出血等病癥的治療[5]。目前，對(duì)丹參酮ⅡA-磺酸鈉的研究主要集中在藥效、藥理以及含量測定等方面[6-8]，與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理方面的研究未見報(bào)道。本文在模擬生理?xiàng)l件下，采用紫外光譜和熒光光譜兩種方法研究了丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的相互作用機(jī)理，計(jì)算了不同溫度下二者的結(jié)合常數(shù)以及反應(yīng)過程的ΔG、ΔH、ΔS等熱力學(xué)參數(shù)，推測了二者之間結(jié)合力的類型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

丹參酮ⅡA-磺酸鈉和牛血清蛋白為生化試劑，三（羥甲基）胺基甲烷、濃鹽酸和氯化鈉均為分析純，使用前未做任何處理。

pH精密酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司），熒光光譜儀（日本日立高新技術(shù)公司），紫外可見光譜儀（上海恒勤儀器有限公司），超聲波振蕩儀（重慶市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫外光譜法

在編號(hào)為1～10的10 mL的容量瓶中加入2×10-5mol·L-1的牛血清蛋白溶液1.0 mL，然后再依次加入體積分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL的丹參酮ⅡA-磺酸鈉溶液，用pH=7.40的0.1 mol·L－1的Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL，搖勻，分別在285.8、298、310 K溫度下充分反應(yīng)30 min。以Tris-HCl溶液為參比溶液，測量各溶液的紫外可見吸收光譜。

1.2.2 熒光光譜法

測試溶液的配制方法同1.2.1，固定熒光激發(fā)波長為280 nm，波長300～500 nm掃描的熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜法

285.8 、298、310 K時(shí)丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白作用的紫外可見光譜見圖1。由圖1可以看出，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的吸收峰峰形基本不變，隨著丹參酮ⅡA-磺酸鈉濃度的增加同一波長處的吸光度在不斷增大。

圖1 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的紫外吸收光譜

由圖2可得，在285.8 K時(shí)，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白作用的線性方程為y=5.9093×10-6x－1.677，R=0.9924；在298 K時(shí)，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白作用的線性方程為y=4.5709×10-6x－0.7981，R=0.9971；在310 K時(shí)，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白作用的線性方程為y=3.6550×10-6x+0.6271，R=0.9942，通過計(jì)算，在285.8、298、310 K時(shí)的結(jié)合常數(shù)分別為2.18×105、1.75×105、1.35×105L·mol-1，表明牛血清蛋白與丹參酮ⅡA-磺酸鈉的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而降低。

圖2 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與BSA結(jié)合的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)

2.2 熒光光譜法

2.2.1 丹參酮ⅡA-磺酸鈉對(duì)牛血清蛋白的熒光猝滅

牛血清蛋白的內(nèi)源熒光來自分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等殘基，熒光體在某些物質(zhì)的作用下會(huì)發(fā)生熒光猝滅，許多藥物或有機(jī)小分子化合物都是熒光猝滅劑。在285.8、298、310 K時(shí)牛血清蛋白與丹參酮ⅡA-磺酸鈉的熒光光譜的變化情況見圖3，隨著丹參酮ⅡA-磺酸鈉濃度的增加，牛血清蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，但它的峰位及峰形基本不變，表明丹參酮ⅡA-磺酸鈉對(duì)牛血清蛋白的熒光有猝滅作用。

2.2.2 熒光猝滅的類型

熒光分子與其它分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅，可分為：動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是由于猝滅劑與熒光物質(zhì)相互作用而生成了一定構(gòu)型化合物，導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象，靜態(tài)猝滅過程符合Lineweaver-Bruk雙倒數(shù)方程[9]：

式中:KLB為猝滅劑與小分子藥物的結(jié)合常數(shù)，F(xiàn)0為無丹參酮ⅡA-磺酸鈉時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入一定濃度的丹參酮ⅡA-磺酸鈉后的熒光強(qiáng)度，[Q]為小分子藥物的濃度。在298 K和310 K時(shí)丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白相互作用的Lineweaver-Bruk雙倒數(shù)曲線如圖4所示。根據(jù)圖4可以得到，在285.8、298、310 K時(shí)，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的結(jié)合常數(shù)分別為1.71×105、1.69×105、1.22×105L·mol-1，結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而減小，說明丹參酮ⅡA-磺酸鈉對(duì)牛血清蛋白的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖3 丹參酮ⅡA-磺酸鈉對(duì)牛血清蛋白的熒光猝滅光譜

2.2.3 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白結(jié)合作用力

藥物小分子與白蛋白大分子之間的作用力主要表現(xiàn)為：氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水作用力等。研究表明，若反應(yīng)的焓變△H>0，熵變△S>0時(shí)，分子之間的相互作用力為疏水作用力；若反應(yīng)的焓變△H<0，熵變△S>0時(shí)，分子之間的作用力為靜電引力；若△H<0，△S<0，分子之間的相互作用力為氫鍵和范德華力[10]。丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)見表1。由表1可見，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白相互作用的△H<0，△S>0，因此，丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白之間的作用力主要為靜電引力。

表1 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

圖4 丹參酮ⅡA-磺酸鈉對(duì)BSA熒光猝滅的Lineweaver-Bruk

2.2.4 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

靜態(tài)猝滅過程的藥物小分子和血清蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，可根據(jù)lg[(F0-F)/F]=lg K+n lg[Q]求算。其中，F(xiàn)0為未加入藥物小分子時(shí)牛血清蛋白的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑藥物小分子濃度為[Q]時(shí)的熒光強(qiáng)度。

圖5是298 K和310 K時(shí)lg[(F0-F)/F]～l g[Q]曲線，通過線性擬合得到丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為0.93、0.94和0.98，說明丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

圖5 丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的結(jié)合常數(shù)

3 結(jié)論

采用紫外光譜和熒光光譜兩種方法研究了丹參酮ⅡA-磺酸鈉與牛血清蛋白的相互作用，當(dāng)反應(yīng)溫度為285.8、298、310 K時(shí)，紫外光譜法研究得到二者的結(jié)合常數(shù)分別為2.18×105、1.75×105、1.35×105L·mol-1，結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而降低。在反應(yīng)溫度為285.8、298、310 K時(shí)，熒光光譜法研究得到二者的結(jié)合常數(shù)分別為1.71×105、1.69×105、1.22×105L·mol-1，與紫外光譜法得到結(jié)果一致。丹參酮ⅡA-磺酸鈉對(duì)牛血清蛋白的熒光猝滅方式屬于靜態(tài)猝滅，二者的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1，主要通過靜電引力作用結(jié)合。