范華農，龔義鳳

作者單位：1浠水縣中醫(yī)院婦產科，湖北 黃岡 438200；2繁昌縣中醫(yī)院婦產科，安徽 蕪湖 242400

子宮肌瘤又稱子宮平滑肌瘤，由平滑肌及結締組織組成，是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤，育齡期婦女平均發(fā)病率約為77%，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢［1-2］。其常引起月經(jīng)過多、不孕、流產等疾病，也是女性子宮切除的常見原因，嚴重影響病人身心健康。據(jù)相關文獻報道，雌、孕激素是子宮肌瘤形成發(fā)展的重要因素，且與雌、孕激素受體（ER、PR）有很重要的聯(lián)系，還與子宮平滑肌細胞蛋白激酶C（PKC）關系密切。PKC是調節(jié)平滑肌細胞收縮、受體結合、細胞增殖分化的信號傳遞通道的重要物質，其降低有促進體外培養(yǎng)的子宮平滑肌瘤細胞生長抑制的作用，桂枝茯苓膠囊由桂枝、茯苓、牡丹皮等中藥組成，具有活血化瘀，緩消癥塊之效。臨床應用于子宮肌瘤療效顯著［3］。筆者通過觀察PR和PKC對造模大鼠子宮肌瘤的表達影響，進一步探析桂枝茯苓膠囊對子宮肌瘤的作用機制。

本研究起止時間為2016年1月至2017年1月。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物及試劑桂枝茯苓流浸膏：桂枝茯苓膠囊（成分相同）（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產，濃度0.31 g/mL，批號20160507）用量按成人與大鼠等效用量換算而成。米非司酮片：每片25 mg（北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號43181709）配制成濃度為0.27 mg/mL的溶液備用（溶于丙二醇中）。黃體酮注射液：20 mg/mL（浙江仙琚藥業(yè)，批號021603）。苯甲酸雌二醇注射液：2 mg/mL（天津金耀氨基酸藥業(yè)，批號021865）。PR單克隆抗體（德國Biometro公司）。儀器：Leica熒光倒置顯微鏡（上海洛豐精密檢測儀器有限公司）；Thermo-CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司）；SP試劑盒（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 動物分組SPF級Wistar雌性大鼠體質量范圍180～220 g，共81只，采用隨機數(shù)字表法分為正常組14只，造模組67只。本研究符合一般實驗動物倫理學原則。

1.3 造模方法正常組：14只，肌注0.9%生理鹽水0.05 mL（3次/周）；造模組：67只，肌注苯甲酸雌二醇0.06 mL（含藥量0.12 mg，3次/周），同時肌注黃體酮0.05 mL（含藥量1 mg，1次/周）；共16周。造模過程中正常組1只丟失，造模組2只丟失及6只意外死亡，造模結束時正常組共13只，造模組共59只。

1.4 給藥方法造模組59只模型大鼠分為三組：模型組17只，桂枝茯苓組21只，米非司酮組21只。每只模型組大鼠每天灌服0.9%生理鹽水2 mL，其他兩組每只大鼠每天分別灌服桂枝茯苓流浸膏或米非司酮溶液2 mL，共灌服12周（用量按成人與大鼠等效用量換算而成）。灌胃時間較長，結束時大鼠死亡11只，剩余正常組13只，模型組16只，桂枝茯苓組17只，米非司酮組15只。

1.5 觀測指標大鼠在灌胃第12周時，取大鼠子宮組織放入甲醛溶液中固定，觀察大鼠子宮各項指標并用SP法檢測各組子宮平滑肌組織的PR，免疫組化法計算各組PKC的活性。

1.6 免疫組化方法（1）孕激素受體染色流程：標本切片脫蠟水化→甲醇處理切片→水洗、PBS洗→加血清孵→PR單抗放置過夜→PBS洗→加入SP復合物孵育→PBS洗→鏈霉卵白素孵→PBS洗→DAB-孵育→PBS洗，水洗→Harris蘇木素復染→水洗→分化，藍化，脫水封片。

（2）PKC提?。喝〈笫笞訉m平滑肌細胞→緩沖液孵15 min→粉碎細胞→離心→上清液為細胞質PKC提取物→沉淀→離心→胞膜PKC提取物（上清液）。

1.7 結果判定（1）切片中不同高倍視野細胞計數(shù)共1 000個，得出陽性率，細胞核中棕黃色顆粒為孕激素受體陽性染色，其中無陽性細胞以（－）表示；陽性染色細胞＜25%（+）；25%＜陽性染色細胞＜50%（++），陽性染色細胞＞50%（+++）。

（2）將PKC加入到含有組蛋白、γ-32 P-ATP和磷脂酰絲胺酸的緩沖液中，溫浴30 min，30℃，用γ-閃爍計數(shù)儀檢測放射性，計算PKC的活性（PKC活性單位：fmol·mg-1min-1）。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析+HSD-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠質量、子宮質量及子宮系數(shù)差異比較本實驗研究參照相關文獻資料［3-4］改進后建立子宮肌瘤模型。監(jiān)測模型大鼠質量、子宮質量、子宮系數(shù)（即子宮質量/大鼠質量），其結果均明顯大于正常組大鼠（P＜0.05）；而用藥組大鼠質量、子宮質量、子宮系數(shù)低于模型組（P＜0.05）；桂枝茯苓組大鼠質量、子宮質量、子宮系數(shù)與米非司酮組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠質量、子宮質量和子宮系數(shù)/±s

表1 各組大鼠質量、子宮質量和子宮系數(shù)/±s

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常組模型組桂枝茯苓組米非司酮組F值P值鼠數(shù)13 16 17 15鼠質量/g 185.2±19.8 348.3±50.3a 335.2±46.5ab 325.7±30.2ab 50.39 0.000子宮質量/mg 1.43±0.56 4.67±1.31a 3.55±0.73ab 3.50±0.82ab 30.74 0.000子宮系數(shù)/%0.77±0.12 1.34±0.11a 1.06±0.51b 1.07±0.48b 5.736 0.002

2.2 各組大鼠子宮平滑肌組織中PR陽性率及平滑肌細胞PKC的表達差異比較模型組大鼠子宮平滑肌組織細胞核中PR的陽性率、細胞膜PKC的活性均極顯著高于正常組（P＜0.05），細胞質PKC的活性低于正常組（P＜0.05）。

用藥后，PR陽性表達率，桂枝茯苓組與模型組比較下降極其顯著（P＜0.05），米非司酮組與模型組比較下降顯著（P＜0.05），桂枝茯苓組下降更明顯接近正常組水平（P＞0.05）。

PKC細胞膜的活性表達，桂枝茯苓組與模型組比較下降極其顯著（P＜0.05），米非司酮組細胞膜的活性下降不明顯與模型組相比較多差異無統(tǒng)計學意義，桂枝茯苓組更接近正常組。

PKC細胞質的活性表達，桂枝茯苓組與模型組比較升高明顯（P＜0.05），桂枝茯苓組PKC細胞質的活性升高多接近正常組表達；米非司酮組與模型組比較升高不明顯。見表2。

表2 各組大鼠子宮平滑肌PR陽性率及平滑肌細胞PKC活性表達/± s

表2 各組大鼠子宮平滑肌PR陽性率及平滑肌細胞PKC活性表達/± s

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常組模型組桂枝茯苓組米非司酮組F值P值鼠數(shù)13 16 17 15細胞膜/fmol·mg-1·min-1 19.31±3.84 37.24±7.12a 21.62±5.23b 36.54±6.79a 37.27 0.000細胞質/fmol·mg-1·min-1 15.43±4.59 11.68±4.68a 16.50±2.80b 13.23±3.45b 4.90 0.004 PR陽性率（給藥后第12周）/%28.34±2.4 75.25±4.1a 32.25±2.8b 40.22±3.5b 656.10 0.000

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤是激素依賴性良性腫瘤，雌、孕激素在子宮肌瘤的生長中起協(xié)同作用，此外還與子宮平滑肌PKC活性密切相關［4-5］。相關研究表明［6-7］，子宮肌瘤內ER和PR的含量高于子宮正常肌組織，使用促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-α）治療后的子宮肌瘤中ER和PR的表達均明顯下降，說明肌瘤的生長與雌、孕激素受體有很重要聯(lián)系。Kawaguchi等［8］發(fā)現(xiàn)雌、孕激素均導致細胞有絲分裂率增加，與單用雌激素或無激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的相比，在雌、孕激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞肌絲和致密體顯著增多，增生最活躍。Matsuo等［9］發(fā)現(xiàn)凋亡抑制基因產物Bcl-2蛋白和增生抗原Ki-67在肌瘤組織中明顯增多，表明孕激素是通過增強細胞內轉錄活化作用，實現(xiàn)提高有絲分裂率，達到抑制細胞凋亡的目的以促進肌瘤生長。本研究與相關文獻報道研究結果一致，模型組子宮肌瘤平滑肌組織的細胞核中PR陽性表達率顯著高于正常組。表明局部高PR濃度和高孕激素狀態(tài)可能是子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制。桂枝茯苓組與模型組相比，局部PR陽性表達率明顯下降，由于孕激素具有促進肌瘤生長并通過與PR結合發(fā)揮生物學效應來降低PR含量的作用，進一步證實了桂枝茯苓膠囊抗增生、抗肌瘤機制。

實體腫瘤微環(huán)境中缺氧是其基本特征之一，細胞在缺氧狀態(tài)下誘導血管生成、缺氧代謝等密切相關的基因表達是為適應缺氧環(huán)境［10-12］，缺氧刺激子宮平滑肌細胞可以引起其細胞膜和細胞質PKC活性的明顯改變。細胞質中的PKC活性下降，顯示缺氧可激活細胞質中的PKC信號傳導通路使細胞質中PKC活化。PKC是一種重要的信息傳導蛋白，介導生物信號從細胞膜向細胞核的傳遞，構成細胞內重要的信號轉導系統(tǒng)，對細胞分化、增殖和凋亡起重要調節(jié)作用［13-15］。本研究中細胞PKC是調節(jié)子宮平滑肌細胞收縮、受體結合、細胞增殖分化的信號傳遞通道的重要物質；主要以非活性形式存在于細胞質，當細胞質PKC激活時，會發(fā)生質膜轉位［16］，桂枝茯苓膠囊與米非司酮組比較更能顯著改善細胞PKC活性，促進平滑肌細胞PKC從病理性異常狀態(tài)恢復到接近正常水平，而且改善了子宮平滑肌細胞的缺氧狀態(tài)，切斷子宮平滑肌細胞增殖分化信號傳遞通道，從而達到抑制肌瘤的目的。

本研究提示桂枝茯苓膠囊顯著下調子宮肌瘤模型大鼠平滑肌細胞PR、PKC陽性表達，改善子宮平滑肌細胞的缺氧狀態(tài)，抑制血管生成，切斷子宮平滑肌細胞增殖分化信號傳遞通道，是桂枝茯苓膠囊縮瘤、消瘤臨床療效顯著的作用機制之一。