張磊，劉春亮，王龍娟，錢丹華

作者單位：滁州市食品藥品檢驗中心化學(xué)室，安徽 滁州 239000

氨糖美辛腸溶片是由鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛兩種組分按3∶1比例的復(fù)方制成的，是一種消炎鎮(zhèn)痛藥。研究顯示，在非甾體抗炎藥（NSAIDs）制劑中加入適當(dāng)比例的氨基葡萄糖可以有效增強(qiáng)前者的鎮(zhèn)痛作用［1］，減少前者的用量，從而減少前者對病人造成的不適，如胃損傷［2-3］和肝損傷［4］等。氨糖美辛腸溶片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（二部）第六冊，其中鹽酸氨基葡萄糖含量測定采用Elson-Morgan比色法［5］，操作過程易受干擾。吲哚美辛的含量測定采用提取后滴定法，專屬性與重現(xiàn)性差。近年也有采用HPLC法測定氨糖美辛腸溶制劑中鹽酸氨基葡萄糖［6-7］和吲哚美辛［8-9］含量的報道，然而能夠同時高效準(zhǔn)確測定鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛含量的報道很少。本研究參考美國藥典最新版本（40版），采用NH2色譜柱，在雙波長條件下，同時測定鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛的含量。本方法操作簡便，耐用性良好，能夠排除系統(tǒng)干擾，靈敏度和重復(fù)性均優(yōu)于部頒標(biāo)準(zhǔn)，可用于氨糖美辛腸溶片中雙組分的質(zhì)量控制。

本研究起止時間為2017年9月至2018年2月。

1 儀器與試藥

1.1 儀器島津LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-M20A PDA檢測器（日本島津公司）；Hypersil NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱（大連依利特分析儀器有限公司）；XPE105電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）。

1.2 試藥鹽酸氨基葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號140649-200702）；吲哚美辛對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號100258-200904）；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氨糖美辛腸溶片（A公司，批號171003；B公司，批號20161201；C公司，批號20161201）。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Hypersil NH2（5 μm，4.6 mm×250mm）；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液（取3.5g磷酸氫二鉀和0.25 mL氫氧化銨，加水至1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5）（70∶30）；流速：1.0mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量為10μL，檢測波長為195nm和254nm雙波長測定。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對照品49.05 mg置25 mL量瓶中，加溶劑［乙腈-水（50∶50）］20 mL振搖使溶解并用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液①；精密稱取吲哚美辛對照品16.43 mg置于25 mL量瓶中，加溶劑20 mL振搖使溶解并用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液②。精密量取貯備液①5 mL置于10 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，作為鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液。精密量取貯備液②5 mL置于10 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，作為吲哚美辛對照品溶液。精密量取貯備液①和貯備液②各5 mL混勻，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取本品20片，精密稱定，研細(xì)，取約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖100 mg的細(xì)粉，置100 mL量瓶中，加溶劑適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備參照氨糖美辛腸溶片的處方組成，稱取除鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛外的其它輔料成分，按供試品溶液的制備方法制備。2.5 專屬性試驗將以上三種溶液，在“2.1”色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果顯示，該條件適用于同時測定鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛的含量，見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察精密量取“2.2”項配置的貯備液①和貯備液②，分別用溶劑稀釋，得到系列濃度為98.10、196.20、392.40、784.80、1 471.50、1 962.00 mg/L的鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液和32.86、65.72、131.44、262.88、492.90、657.20 mg/L的吲哚美辛對照品溶液，按照“2.1”色譜條件進(jìn)樣，在195 nm波長處記錄氨基葡萄糖色譜圖，在254nm波長處記錄吲哚美辛色譜圖，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，分別得到線性回歸方程。鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝601.38X+1 304.05，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 9，線性范圍為98.10～1 962.00 mg/L；吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝27 995.61X-274 829.70，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 8，線性范圍為32.86～657.20 mg/L。

圖1 雙波長法測定氨糖美辛腸溶片含量的色譜圖：A為鹽酸氨基葡萄糖對照品（195 nm）；B為吲哚美辛對照品（254 nm）；C為混合對照品（195 nm）；D為混合對照品（254 nm）；E為樣品（195 nm）；F為樣品（254 nm）；G為陰性對照溶液（195 nm）；H為陰性對照溶液（254 nm）

2.7 精密度試驗取混合對照品溶液，在“2.1”色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，分別計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果氨基葡萄糖峰面積的RSD為0.64%；吲哚美辛峰面積的RSD為0.06%。表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗取同一批號（171003）樣品，按“2.3”方法制備6份，在“2.1”色譜條件下測定，結(jié)果鹽酸氨基葡萄糖含量分別為標(biāo)示量的103.94%、103.88%、104.03%、102.92%、104.21%、103.92%，平均值為103.81%，RSD＝0.44%（n＝6）；吲哚美辛含量分別為標(biāo)示量的99.88%、98.68%、100.36%、100.00%、100.18%、99.86%，平均值為100.32%，RSD＝0.60%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h各進(jìn)樣一次，記錄峰面積，結(jié)果氨基葡萄糖和吲哚美辛峰面積的RSD分別為0.59%和0.52%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗按供試品溶液制備方法制備樣品溶液（含鹽酸氨基葡萄糖2 562.4 mg/L，吲哚美辛816.1 mg/L），精密量取2 mL，共18份，分別置10 mL量瓶中，精密加入“2.2”鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液和吲哚美辛對照品溶液3、5、7 mL各3份，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按“2.1”色譜條件測定。計算回收率，結(jié)果見表1。平均回收率（n＝9）分別為99.15%和99.28%，RSD分別為0.97%和0.66%。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表1 加樣回收率試驗（n＝9）

2.11 定量限取“2.2”項配置貯備液①，用溶劑稀釋30倍，在“2.1”色譜條件進(jìn)樣，信噪比為10，溶液濃度為65.40 mg/L，確定為鹽酸氨基葡萄糖對照品的定量限。取“2.2”項配置貯備液②，用溶劑稀釋20 000倍，在“2.1”色譜條件進(jìn)樣，信噪比為10，溶液濃度為0.033 mg/L，確定為吲哚美辛對照品的定量限。

2.12 含量測定取三批樣品分別依“2.3”方法制備，依“2.1”色譜條件測定，按外標(biāo)法，以峰面積計算含量，并與現(xiàn)行部頒標(biāo)準(zhǔn)測定的鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛含量進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

表2 氨糖美辛腸溶片含量測定結(jié)果（標(biāo)示量的百分含量）/%

2.13 含量均勻度測定取樣品10片，分別置100 mL量瓶中，加適量溶劑振搖使溶解，用溶劑定容至刻度。依前述方法測定每片中吲哚美辛的含量，計算A+2.2s值。結(jié)果三批吲哚美辛的A+2.2s值分別為6.0、11.8和18.5。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇在測定鹽酸氨基葡萄糖的方法中，美國藥典（32版）采用C8色譜柱［10］，美國藥典最新版（40版）采用NH2色譜柱［11］，中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)［12］采用C18色譜柱。在測定吲哚美辛的方法中，美國藥典最新版（40版）采用C18色譜柱，中國藥典2015年版二部采用C18色譜柱。按照上述條件進(jìn)行預(yù)實驗，采用C8色譜柱和C18色譜柱時，氨基葡萄糖峰的出峰時間都相對較早，其中C18色譜柱，與氯離子峰幾乎完全重合，也不能與吲哚美辛峰完全分離，改變流動相的比例，氨基葡萄糖峰的保留時間幾乎沒有變化?？紤]氨基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，使用NH2色譜柱一般能得到較好的分離，同時參考其他糖類物質(zhì)的含量測定方法［13-14］，最后決定采用NH2色譜柱進(jìn)行相關(guān)研究，結(jié)果表明NH2色譜柱較為適合于氨糖美辛腸溶片的含量測定。

3.2 波長的選擇由于氨基葡萄糖在紫外區(qū)吸收非常弱，甚至無吸收，見圖2。目前，美國藥典（40版）采用195 nm波長測定。中國藥典2015年版二部采用228 nm測定吲哚美辛的含量，在很多研究中，254 nm也被廣泛應(yīng)用于測定吲哚美辛的含量［15-16］。按照上述條件進(jìn)行預(yù)實驗，采用195 nm能較好地實現(xiàn)氨基葡萄糖峰的分離。在195 nm條件下，吲哚美辛峰易受氯離子峰干擾，故不宜采用195 nm同時測定雙組分的含量。在228 nm條件下，吲哚美辛峰也易被氯離子峰輕微干擾。結(jié)合吲哚美辛峰光譜圖，見圖3，本實驗選用254 nm。在此條件下，氯離子幾乎無吸收，不會對吲哚美辛峰造成干擾。因此，本研究最終采用195 nm作為氨基葡萄糖檢測波長，254 nm作為吲哚美辛檢測波長。

圖2 氨基葡萄糖峰光譜圖

圖3 吲哚美辛峰光譜圖

3.3 流動相的選擇本研究的重點考慮因素是氯離子峰和氨基葡萄糖峰的有效分離。美國藥典（32版）以磷酸鹽緩沖液（0.05%磷酸，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至3.0）-乙腈（40∶60）為流動相。在實際試驗中，由于該流動相水相比例較高，影響NH2色譜柱的使用壽命，重復(fù)進(jìn)樣后，理論板數(shù)迅速下降，拖尾因子迅速上升。因本研究采用NH2色譜柱，為延長色譜柱壽命，提高耐用性，在流動相中適當(dāng)提高乙腈比例，在親水作用色譜模式下，使用較高比例的乙腈來保留親水化合物，并加入磷酸氫二鉀以改善峰型，通過氫氧化銨調(diào)節(jié)pH值使氨基葡萄糖呈弱陰離子化合物，最終確定流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（取3.5 g磷酸氫二鉀和0.25 mL氫氧化銨，加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5）（70∶30）。采用該流動相，在195 nm條件下，氨基葡萄糖保留時間約為11.0 min，氯離子保留時間約為3.2 min，實現(xiàn)了氯離子與氨基葡萄糖的有效分離。在254 nm條件下，吲哚美辛保留時間約為2.6 min。該系統(tǒng)下，氨基葡萄糖與吲哚美辛理論板數(shù)保持穩(wěn)定，峰形良好。結(jié)果顯示，本次試驗選定的氨糖美辛腸溶片含量測定方法耐用性良好。

3.4 含量均勻度的控制中國藥典2015年版四部規(guī)定，單劑標(biāo)示量小于25 mg或主藥含量小于每個單劑體質(zhì)量25%的片劑應(yīng)檢查含量均勻度。氨糖美辛腸溶片每片含吲哚美辛25 mg，且小于每個單劑體質(zhì)量的25%，應(yīng)控制其含量均勻度。本研究考察了3個企業(yè)各1批氨糖美辛腸溶片的吲哚美辛含量均勻度。其中1個企業(yè)的一批樣品含量均勻度A+2.2s值大于15.0。由于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定氨糖美辛腸溶片的含量均勻度要求，生產(chǎn)企業(yè)在混料的過程中的可能會存在一定問題。因此在標(biāo)準(zhǔn)中增加含量均勻度檢查項，對于產(chǎn)品質(zhì)量控制，全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量優(yōu)劣是有必要的。3.5 小結(jié)本實驗采用雙波長HPLC檢測法，建立了同時測定氨糖美辛腸溶片中鹽酸氨基葡萄糖和吲哚美辛含量及含量均勻度的方法。與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)相比，具有專屬性強(qiáng)，操作簡便快速等優(yōu)勢，且本方法穩(wěn)定性高、線性范圍寬、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為氨糖美辛腸溶片質(zhì)量控制的方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了有價值的參考。