王茹月，葉雨

0 引言

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要因素之一，臨床治療手段通常包括手術(shù)、放療、化療、生物治療或聯(lián)合治療等，但效果卻差強人意。近年來中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的抗癌作用成為海內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注熱點，人們嘗試采用天然產(chǎn)物對抗癌細(xì)胞，取得了不錯的效果。

芒柄花黃素（7-羥基-4’-甲氧基異黃酮，F(xiàn)N）是一種異黃酮類植物雌激素，亦稱刺芒柄花素、芒柄花素，是豆科植物紅三葉草的主要活性成分，也是當(dāng)歸、黃芪、葛根、雞血藤等常用中草藥的活性成分之一，化學(xué)分子式為C16H12O4，可以通過浸提、超聲波、微波、超臨界、亞臨界水、加壓法等藥物提取純化方法從天然植物中得到，也可以通過人工方法進(jìn)行合成和改構(gòu)。FN在水中溶解性差，易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑和稀堿溶液。

諸多研究表明，芒柄花黃素對乳腺、前列腺、膀胱、肺、子宮內(nèi)膜、卵巢等多種惡性腫瘤顯示出良好的抑制作用，因此這種天然產(chǎn)物在癌癥防治領(lǐng)域具有重要研究價值。本文就芒柄花黃素應(yīng)用于抗癌藥物開發(fā)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 抗癌藥理作用及其機制

芒柄花黃素具有抗多種惡性腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的潛能，其抗癌作用可以通過多種藥理作用實現(xiàn)。

1.1 抗氧化作用

氧自由基（ORF）是機體代謝的副產(chǎn)物，有很強的氧化作用，其中·OH化學(xué)性質(zhì)最活潑。人體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基如果不能得到及時清除，會對組織和細(xì)胞造成不可逆性損傷，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。許多植物提取成分被報道具有抗氧化活性，如多酚、生物堿和黃酮類化合物等。

本課題組在前期研究[1]中發(fā)現(xiàn)，芒柄花黃素對體外反應(yīng)體系的超氧陰離子自由基和羥自由基·OH具有明顯的抑制及清除作用。Mu等[2]實驗表明，在小鼠體內(nèi)模型中芒柄花黃素能有效增強抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）的活性，同樣可以減少氧自由基生成。因此，芒柄花黃素可能通過清除有害的氧自由基、增加機體抗氧化能力在體內(nèi)外發(fā)揮抗癌作用。此外，Zhang等[3]從分子結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)角度揭示了芒柄花黃素發(fā)揮抗氧化作用的活性部位為結(jié)構(gòu)式中的B環(huán)，見圖1，主要機制為氫原子轉(zhuǎn)移（hydrogen atom transfer, HAT）。

圖1 芒柄花黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure1 Chemical structure of formononetin

1.2 抑制腫瘤新生血管生成

惡性腫瘤的生長、遷移均伴有新生血管形成的過程。抑制腫瘤血管生成從而抑制癌細(xì)胞的增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是抗癌藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點。

芒柄花黃素具有抗血管生成潛能，這種作用可能與抑制成纖維細(xì)胞生長因子2 （FGF2）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的活性有關(guān)。FGF2可誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，因此抑制FGF2活性也可以間接抑制VEGF。Wu等[4]的實驗結(jié)果表明，在乳腺癌裸鼠模型中芒柄花黃素作為成纖維細(xì)胞生長因子受體2（FGFR2）抑制劑，能夠阻斷FGFR2介導(dǎo)的PI3K-Akt信號通路，降低腫瘤細(xì)胞活性。Auyeung等[5]實驗中，芒柄花黃素通過抑制VEGF和基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs阻滯癌細(xì)胞腫瘤血管生成的作用也得到了驗證。作為一種抗癌效應(yīng)良好的天然產(chǎn)物，芒柄花黃素或許可以用于腫瘤血管阻斷療法中的中西醫(yī)結(jié)合藥劑的研發(fā)。

1.3 調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達(dá)，作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

植物雌激素可以在人體多個代謝途徑中發(fā)揮作用。已有研究表明，芒柄花黃素可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，如調(diào)控抑癌基因P21、p27，抑制細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵蛋白Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E和PCNA[6-9]，激活凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族和Caspase家族[7,9-14]，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶[4,11]（基質(zhì)金屬蛋白酶是一類鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)中阻礙細(xì)胞遷移的多種成分，為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供條件）和核糖體S6蛋白激酶[15]，直接或間接抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的遷徙和轉(zhuǎn)移。

此外，一些經(jīng)典癌癥相關(guān)信號通路均被證明是芒柄花黃素的作用靶點，研究較多的包括PI3K/Akt信號通路[6,8,15-17]、MAPK信號通路[10,15,18-20]、IGF-1/IGF-1R信號通路[8,12]和JAK-STAT信號通路[21]。有研究表明芒柄花黃素可以通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α/CXCR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響癌細(xì)胞的增殖和遷移[22]。此外，芒柄花黃素還可上調(diào)膀胱癌T739細(xì)胞中“抑瘤因子”GSK-3β、Axin蛋白的表達(dá)，降低“促瘤因子”β-catenin 蛋白的表達(dá)，因此還可能與Wnt-βcatenin信號通路相關(guān)[23]。隨著越來越多的癌癥相關(guān)基因、蛋白和通路不斷被發(fā)現(xiàn)，探究芒柄花黃素的抗癌機制可以進(jìn)一步明確這種天然植物藥對機體代謝的影響，為其在制藥領(lǐng)域的開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1.4 調(diào)節(jié)人體免疫功能、改善機體內(nèi)環(huán)境

芒柄花黃素具有對機體損傷的保護(hù)作用、降低血清LDL膽固醇、改善骨密度、調(diào)節(jié)激素分泌等預(yù)防保健功效，對人體內(nèi)環(huán)境和穩(wěn)態(tài)起到良性調(diào)節(jié)，這可能是它發(fā)揮抗癌作用的重要機制之一。例如，芒柄花黃素能有效抑制雌激素依賴性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中FOXA1和GATA-3蛋白的表達(dá)而使雌激素受體水平下降，改善體內(nèi)的內(nèi)分泌微環(huán)境，從而改善患者預(yù)后[24]。此外，芒柄花黃素的抗炎作用可以幫助機體清除代謝廢物，使機體處于良好的適于正常細(xì)胞代謝的環(huán)境，增強機體對癌細(xì)胞的免疫力。

2 衍生產(chǎn)物和混合藥劑的抗癌作用

由于難溶于水的理化性質(zhì)和受到機體代謝作用影響，芒柄花黃素在血液和靶組織中的濃度不高，療效受限。在Singh等[25]的實驗中，F(xiàn)N單體在大鼠體內(nèi)的生物利用度僅約3%。目前，許多科研人員致力于研究芒柄花黃素改構(gòu)、改善劑型或藥物間的相互作用，取得了諸多成果。

2.1 芒柄花黃素改構(gòu)

基于兩個或多個具有藥效亞基的生物活性分子，通過化學(xué)方法合成溶解性更大、更利于人體吸收的芒柄花黃素衍生物以增強其抗癌效果，是很有前景的研究方向。

氮芥是臨床常用的抗腫瘤藥物，環(huán)磷酰胺等氮芥類化合物發(fā)揮作用的藥效亞基為其烷基化部分（氮芥基）。Ren等[26]發(fā)現(xiàn)在芒柄花黃素3’位引入氮芥（圖2A）可以增強它的細(xì)胞毒作用，部分衍生物具有比左旋苯丙氨酸氮芥（米爾法蘭）更強的抗腫瘤活性。同時，7位引入環(huán)烷基的FN化合物較引入支鏈烷烴、直鏈烷烴、苯環(huán)類以及烯烴類基團的抗腫瘤活性更強，且抑制作用與環(huán)的大小成正比。這說明在芒柄花黃素7位羥基引入體積較大的環(huán)烷烴具有更大的價值，或可為基于芒柄花黃素支架開發(fā)更有效、更具選擇性的抗腫瘤改構(gòu)藥物提供重要線索。

二硫代氨基甲酸鹽被報道具有多種藥用價值，如抗癌、抑制碳酸酐酶活性等，是連接不同抗增殖分子結(jié)構(gòu)的理想支架。Fu等[27]設(shè)計合成的14種芒柄花黃素二硫代氨基甲酸酯衍生物（圖2B）均對前列腺癌PC-3細(xì)胞的生長和遷移表現(xiàn)出良好的抑制作用。這兩種分子結(jié)構(gòu)具有潛在的協(xié)同效應(yīng)，由它們合成的活性最強的化合物抗前列腺癌PC3細(xì)胞的效果比芒柄花黃素單體高約28倍。

前藥是一種有效改善原藥藥代動力學(xué)的手段。由于磷酸基團極性較大，引入氨基磷酸酯的前藥修飾技術(shù)可以增加藥物的水溶性。Li等[28]在大豆苷元7位引入氨基磷酸酯合成的芒柄花黃素結(jié)構(gòu)類似物（圖2C）可以引起G2/M期細(xì)胞周期阻滯，顯著誘導(dǎo)肝癌HepG-2細(xì)胞的早期凋亡。而直接由芒柄花黃素合成這一化合物的實驗?zāi)壳拔匆妶蟮?，可以此結(jié)果作為參考，納入FN改構(gòu)的研究。

李芳耀[29]在芒柄花黃素7位羥基上連接NO供體片段合成了兩個衍生物（7-( 4-硝基氧基) 丁氧基-4'-甲氧基異黃酮和7-( 6-硝基氧基)己氧基-4'-甲氧基異黃酮，圖2D），或許可以在體內(nèi)釋放NO，利用NO的抗腫瘤效應(yīng)增強抗癌活性。該實驗的結(jié)果仍有待進(jìn)一步驗證。

此外，研究人員還合成了一些未知抗癌活性的水溶性芒柄花黃素衍生物，如芒柄花黃素-3’-磺酸鈉[30]，F(xiàn)rasinyuk等[31]還合成了一系列芒柄花黃素氨基酸衍生物，在FN改構(gòu)藥物開發(fā)方面均具有繼續(xù)研究價值。

2.2 改善劑型

芒柄花黃素屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中的BCSⅡ類，具有低溶解性和高滲透性的特點。通過先進(jìn)制藥包封工藝制備利于人體攝取的劑型，增加芒柄花黃素在胃腸道中的溶解度和吸收利用度，是值得探討的問題。提高BCSⅡ類藥物的體內(nèi)溶出和吸收的常用方法包括制備包合物、固體分散體和藥物前體，微粉化、改變晶型、自乳化以及納米技術(shù)等。目前文獻(xiàn)報道的FN改良制劑包括納米乳、環(huán)糊精和脂質(zhì)體，在這一領(lǐng)域仍具有廣闊的探索前景。

TPGS（D-α-tocopherol polyethylene glycol1000succinate，聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯）是由親水性基團（聚乙二醇）和親脂性基團（維生素E琥珀酸酯）組成的載體，當(dāng)它形成膠束時可以顯著改善藥物的胃腸道吸收和利用。Cheng等[32]制備了芒柄花黃素TPGS膠束，經(jīng)測試其穩(wěn)定性良好，抗肺癌的藥用效能明顯提高。與游離FN相比，膠束作用后細(xì)胞攝藥量增加（P＜0.01），細(xì)胞毒性增強（藥物的半抑制濃度IC50由58.19μmol/L降低至35.95 μmol/L）。并且，F(xiàn)N-TPGS膠束在小鼠體內(nèi)能更迅速地聚集于腫瘤位點，顯著提升腫瘤抑制率（由34.03%提高到67.39%）。

環(huán)糊精包合是一種常用的改善藥劑溶解度的方法。藥物分子被包含或嵌入環(huán)糊精的桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，形成超微粒分散物，穩(wěn)定性增加且更易于人體吸收。李德強等[33]和郭波紅等[34]制備的芒柄花黃素-β-環(huán)糊精包合物，比FN單體水溶性更好，具有一定的緩釋作用，若用于臨床可以減少患者用藥頻率，降低FN的不良反應(yīng)。最近，Liu等[35]和Guo等[36-37]利用羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）分別修飾羧基化單壁碳納米管（SWCNTs）和多壁碳納米管（MWCNTs），以及制備PLGA納米粒作為藥物載體，得到的芒柄花黃素制劑均具有很好的緩釋性能及靶向效應(yīng)，并且增加了FN單體的抗腫瘤活性。

圖2 芒柄花黃素衍生物Figure2 Derivatives of formononetin

此外，廖燦城等[38]發(fā)現(xiàn)，直接制備FN脂質(zhì)體包封率低，而且芒柄花黃素容易從藥劑中泄漏。因此他們首先對芒柄花黃素進(jìn)行環(huán)糊精包合以改善其成藥性，之后制備出的芒柄花黃素-膽固醇（FMN-CHOL）前藥較普通脂質(zhì)體包封率顯著增高（由（5.38±1.46）%優(yōu)化到（81.63±0.79）%）且緩釋效果更好。由上述研究可知芒柄花黃素脂質(zhì)體制劑的生物利用度明顯增高，可以推測它具有優(yōu)于游離芒柄花黃素的藥效，但其對癌細(xì)胞的抑制效果仍有待進(jìn)一步驗證。

2.3 藥劑聯(lián)合使用的效應(yīng)研究

在癌癥化療階段加用芒柄花黃素，能夠增強某些藥物的療效。如可以在體外條件下幾乎完全阻斷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的侵襲，增強VEGFR2抑制劑舒尼替尼對癌細(xì)胞生長遷移的抑制作用[4]。FN可以降低多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）的發(fā)生，顯著增強抗腫瘤藥表柔比星對宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[39]和替莫唑胺對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的化療療效[40]。在臨床上，應(yīng)用化療藥物會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），增強其惡性程度，與腫瘤耐藥性的發(fā)生密切相關(guān)。Liu等[41]研究表明，F(xiàn)N或許能逆轉(zhuǎn)這種作用，增加阿霉素的抗癌效果。此外，芒柄花黃素還可以減輕化療不良反應(yīng)，用于預(yù)防順鉑導(dǎo)致的腎臟毒性[42-43]。

3 耐受劑量和毒副作用

綜合諸多抗癌研究的結(jié)果可知，在一定濃度范圍內(nèi)，芒柄花黃素對惡性腫瘤的抑制作用呈劑量-時間依賴性。但在某些實驗中較低濃度芒柄花黃素對癌細(xì)胞抑制作用不明顯，甚至促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[44-45]。起效劑量尚難以確定，也無相關(guān)研究驗證芒柄花黃素對機體產(chǎn)生不良反應(yīng)的劑量，因此更多的大規(guī)模體內(nèi)外實驗有待繼續(xù)進(jìn)行。

Zhang等[9]實驗結(jié)果表明，芒柄花黃素作為抗前列腺癌藥物使用對正常人前列腺上皮細(xì)胞并不具有可檢測的毒性。同樣，在動物模型中，在芒柄花黃素治療的小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎和腦等器官均未觀察到明顯損傷，藥物處理組與對照組小鼠體重不具有顯著性差異[4]。在目前的研究中并沒有相關(guān)數(shù)據(jù)顯示芒柄花黃素對正常組織細(xì)胞產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，表明其在生物體內(nèi)治療耐受性良好，可以作為一種理想的抗癌藥物。

4 總結(jié)與展望

芒柄花黃素來源廣泛，獲取便捷、廉價，具有很好的開發(fā)利用前景。諸多研究已表明，F(xiàn)N具有抗多種癌細(xì)胞的作用，若制成生物利用度好的藥劑形式可以顯著改善患者的生存和預(yù)后。但是目前芒柄花黃素抗癌的藥理作用主要是通過體外細(xì)胞實驗進(jìn)行研究，缺乏臨床數(shù)據(jù)的支持。因此在未來進(jìn)一步的動物體內(nèi)實驗和大規(guī)模藥物研究應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，以期早日將芒柄花黃素制劑應(yīng)用于臨床預(yù)防治療方案。此外，利用芒柄花黃素類化合物與其他抗癌藥物合用發(fā)揮協(xié)同作用或者研發(fā)出活性更強的衍生物，也是很有意義的研究方向。