郭華麗，李祖銘，余玲，丁杰，郭蓮軍

鈣離子是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要信使物質(zhì)之一，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高可使多種鈣依賴(lài)性降解酶活性增強(qiáng)；如蛋白酶激活可引起細(xì)胞骨架受損，核酸內(nèi)切酶激活可導(dǎo)致核酸分解。中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病如癡呆、卒中等，均與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)[1-4]。

蝙蝠葛蘇林堿（daurisoline，DS）從防己科植物蝙蝠葛蘇林的根莖中提取，屬雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿，對(duì)多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性心律失常具有拮抗作用[5,6]，并對(duì)谷氨酸引起的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用[7]。目前尚無(wú)關(guān)于DS影響神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣的研究。本研究采用原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，用緩激肽（bradykinin，BK）處理建立胞內(nèi)鈣失衡，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，觀察DS對(duì)胞內(nèi)鈣增加的作用，探究其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

SD乳鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為SCXK(鄂)2014-0007。DS純度＞98%，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系提供，用1 mmol/L鹽酸溶解，再用2 mol/L NaOH調(diào)pH至6.8，配成母液4℃保存。BK、Fur-2/AM、Triton X-100、EGTA、HEPES、DMSO購(gòu)于Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、牛血清白蛋白購(gòu)于Gibco公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)[8]取1～3 d齡的SD乳鼠8～10只，消毒后斷頭取全腦，分離大腦皮質(zhì)，人工腦脊液清洗后置于安剖瓶，加2 mL D-Hank’s液，剪成2×2×2 mm3塊狀物，放于刻度試管內(nèi)加入0.25%胰酶（1:1），37℃孵育15～20 min后，用吸管吹打混勻，加入少許完全培養(yǎng)基終止消化，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基至10 mL，1 000 rpm離心10 min 2次；去上清，加入完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×105/mL，分別種植于預(yù)先用0.1%多聚賴(lài)氨酸包被的96孔板或小蓋玻片上，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃，5%CO2）培養(yǎng)。培養(yǎng)至第5天，培養(yǎng)液中加阿糖胞苷（終濃度為5 μg/mL）抑制非神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。阿糖胞苷作用48 h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2天半量換液。培養(yǎng)至第10天時(shí)，將細(xì)胞分別用于細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)定和細(xì)胞活性檢測(cè)。

根據(jù)處理方式的不同，將細(xì)胞分為對(duì)照組，BK（1μmol/L）組，DS低（1×10-6mol/L DS+1μmol/L BK）、中（1×10-5mol/L DS+1 μmol/L BK）、高（1×10-4mol/L DS+1μmol/L BK）劑量組，各8個(gè)樣本。對(duì)照組不做任何處理；BK組給予1μmol/L的BK處理；DS低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的DS預(yù)孵育3 min，然后給予1μmol/L的BK處理。

1.2.2 神經(jīng)元[Ca2+] i測(cè)定 以Fura-2/AM為鈣指示劑，用細(xì)胞內(nèi)雙波長(zhǎng)熒光鈣成像系統(tǒng)（TILL，德國(guó)）進(jìn)行[Ca2+] i測(cè)定。細(xì)胞培養(yǎng)至第10天時(shí)，取出生長(zhǎng)于蓋玻片上的細(xì)胞，加入熒光探針Fura-2/AM（終濃度1 μmol/L），避光孵育45 min。孵育后的細(xì)胞洗滌3次，將貼有細(xì)胞的蓋玻片放入細(xì)胞浴槽中，通過(guò)TILL測(cè)量系統(tǒng)分別用340 nm和380 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的Fura-2，檢測(cè)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，R值（F340nm/F380nm）與[Ca2+] i正相關(guān)，以R值變化表示[Ca2+] i變化。采樣頻率為1 Hz。胞內(nèi)鈣的變化率計(jì)算：[Ca2+] i變化率/%=(胞內(nèi)鈣峰值－基礎(chǔ)值)/基礎(chǔ)值×100%；基礎(chǔ)值為給藥前的穩(wěn)定值，胞內(nèi)鈣峰值為藥物處理后的最大值。

DS低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的DS預(yù)孵育3 min后測(cè)量基礎(chǔ)值。基礎(chǔ)值測(cè)量完成50 s后，BK組及DS低、中、高劑量組均加入1μmol/L的BK。對(duì)照組不作處理。BK加入后立即觀察胞內(nèi)鈣變化，記錄峰值，計(jì)算[Ca2+] i變化率。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)與細(xì)胞活性檢測(cè) 將培養(yǎng)至第10天的細(xì)胞按以上分組處理，細(xì)胞加入BK后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。在培養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中加入MTT（200 μL/孔），37 ℃孵育4 h，去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，氣浴震蕩10 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在570 nm處的OD值。細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD570－空白對(duì)照組OD570)/(正常對(duì)照組OD570－空白對(duì)照組OD570)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DS對(duì)BK誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子濃度升高的影響

加入BK后，培養(yǎng)的細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，于15～20 s達(dá)峰值，隨后又逐漸回復(fù)至初始水平。DS預(yù)處理對(duì)BK引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高有明顯的抑制作用，且抑制作用呈濃度依賴(lài)性，見(jiàn)表1。

表1 DS對(duì)BK誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子濃度升高的影響（%,±s）

表1 DS對(duì)BK誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子濃度升高的影響（%,±s）

注：與BK組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組別對(duì)照組BK組DS低劑量組DS中劑量組DS高劑量組例數(shù)8 8 8 8 8細(xì)胞內(nèi)[Ca2+] i變化百分率----302.19±47.25 252.74±51.10①215.11±51.28①152.36±37.80②

2.2 DS對(duì)BK誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子升高所致神經(jīng)損傷的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BK可誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)細(xì)胞受損。BK處理12 h后，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，細(xì)胞膜不完整、胞體膨脹甚至破裂、細(xì)胞核固縮、折光性差；DS各劑量處理組細(xì)胞數(shù)量明顯增加，見(jiàn)圖1。MTT結(jié)果顯示，對(duì)照組神經(jīng)元存活率為100.00%，BK組為（50.61±5.48）%，明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；DS低、中、高劑量組的存活率分別為（67.53±8.41）%、（71.50±7.54）%和（89.08±3.23）%，均高于BK組（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 各組經(jīng)BK處理后的細(xì)胞形態(tài)

圖2 各組細(xì)胞存活率柱狀圖

3 討論

BK是CaMII特異性激動(dòng)劑，可與細(xì)胞膜上的B2受體結(jié)合，通過(guò)G蛋白介導(dǎo)激活磷脂酶C，經(jīng)肌醇磷脂代謝途徑，使IP3二酰甘油增加，促使內(nèi)鈣釋放和繼發(fā)性外鈣內(nèi)流，從而導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度升高[9,10]。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，可激活鈣依賴(lài)性的鈣調(diào)蛋白，改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。本研究用BK誘導(dǎo)建立胞內(nèi)鈣失衡的細(xì)胞模型，采用DS預(yù)處理拮抗BK誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度升高，探討DS對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)的拮抗作用及細(xì)胞保護(hù)作用。結(jié)果顯示，DS可濃度依賴(lài)性的抑制BK引起的胞內(nèi)鈣離子濃度升高，對(duì)BK引起的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。但本研究樣本量偏少，后續(xù)將增加樣本量，進(jìn)一步對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究。