米國霞，李曉娜，傅振幸，楊全余，李生花*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810016，中國；2.加州大學(xué)圣地亞哥分校醫(yī)學(xué)院，加利福尼亞 拉荷亞 92037，美國；3.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001，中國)

隨著對自噬研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)自噬在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中起著雙重作用。某種程度的自噬激活對變性蛋白和老化細(xì)胞器的降解有好處，并且提供合成蛋白所需的物質(zhì)；但是過度激活的自噬又導(dǎo)致神經(jīng)元自消化和凋亡，進(jìn)一步加重缺氧細(xì)胞的損傷[1]。

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是自噬體膜標(biāo)志性蛋白，自噬形成時(shí)，胞質(zhì)型 LC3Ⅰ會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3-Ⅱ，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可反映自噬水平的高低[2]。細(xì)胞自噬受體蛋白p62作為泛素化底物和LC3轉(zhuǎn)化之間的銜接蛋白，其蛋白表達(dá)水平的高低與自噬活性成反比，是檢測自噬活性的一個(gè)輔助指標(biāo)[3]。

缺氧可抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)亞基降解、可調(diào)控蛋白激酶Cε(protein kinase c epsilon，PKCε)水平[4]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)被認(rèn)為是海馬中主要的長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation，LTP)調(diào)節(jié)劑，在神經(jīng)元的分化、生存和突觸的形成中起重要作用[5]，低氧情況下可受PKCε調(diào)控[4]。

激活或抑制自噬活動(dòng)有望成為人類治療疾病的新方法，包括神經(jīng)性疾病。目前尚缺乏一個(gè)可調(diào)節(jié)自噬的藥物[6]。藏藥四味黃芪散具有腦神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制不明。本研究將探討藏藥四味黃芪散是否通過對海馬神經(jīng)元自噬活動(dòng)的調(diào)控發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

低壓低氧氧艙購自中航風(fēng)雷公司；電泳儀、電泳槽、ECL發(fā)光液購自Bio-Rad公司；RIPA、PMSF、4%多聚甲醛(815B0215)、2.5%電鏡固定液(P1126)均購自索萊寶公司；轉(zhuǎn)膜液、電泳液購自碧云天公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏公司；BCA蛋白定量試劑盒、Marker購自Thermo公司；ELISA試劑盒(E-EL-R0513c)購自武漢伊萊瑞特生物公司；PVDF膜購自Mil-lipore公司；LC3(BST17924827)、P62(BST17464385)、PKCε(BST17775249)、BDNF(BST17304113)均購自博士德生物公司；β-actin(20536-1-AP)購自武漢三鷹公司；LC3(ab48394)、HRP(ab6721)、Cy2(ab6940)、含DAPI的封固劑(ab104139)均購自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將SPF級健康♂Sprague Dawley大鼠[SCXK(陜)2017-003，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。72只，12周齡，體質(zhì)量(180±15)g]隨機(jī)分為常氧對照組(normoxic control group，NC，n=24)、低氧損傷組(hypoxic control group，HC，n=24)、低氧藥物組(hypoxic drug group，HD，n=24)。NC、HC、HD按取材時(shí)間不同分為3、7、15、30 d組，每組各6只。

1.3 模擬低壓低氧條件

模擬海拔5 000 m環(huán)境，艙內(nèi)O2濃度為14.76%，溫度(22±2)℃，濕度50%～60%。不間斷運(yùn)行30天。

1.4 藥物水劑制備及給藥方法

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清HIF-1α水平

將大鼠用10%的烏來糖(7mL·kg-1)行腹腔注射麻醉后，從腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h離心(3000r/min，15min)，取上清液分裝并保存在-80 ℃冰箱。解凍血清至室溫，平衡試劑盒溫度至室溫。將稀釋成500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、0.00 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋2倍的待測血清加入96孔板中，做復(fù)孔，覆膜，孵育(37℃，90min)；倒去孔內(nèi)液體，加入100 μL生物素化抗體工作液，孵育(37℃，60min)；洗滌液洗3次，加入100 μL酶結(jié)合物工作液，孵育(37℃，30min)；洗滌液洗5次，加入90 μL底物溶液，孵育(37℃，15min)；加入50 μL終止液體后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量OD值。

1.5.2 用透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元中自噬體

1.5.3 用免疫熒光法檢測自噬蛋白LC3水平

1.5.4 用尼氏染色觀察海馬CA3區(qū)的神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)量和排列情況

將4%多聚甲醛固定的海馬組織切成25 μm薄片；貼于載玻片上，自然晾干；切片依次浸過氯仿和體積分?jǐn)?shù)為0.95、0.80、0.75的乙醇，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的焦油紫中染色(37℃，10min)，用超純水洗滌(3次)，依次過體積分?jǐn)?shù)為0.75、0.80、0.95的乙醇，在氯仿中分色數(shù)分鐘，再用無水乙醇Ⅰ、Ⅱ依次脫水10 min，于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中依次透明15 min后用中性樹膠固封。用普通顯微鏡觀察并采集圖片。

1.5.5 用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)檢測LC3、P62、PKCε和BDNF的蛋白表達(dá)水平

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組血清HIF-1α水平比較

圖1顯示，與常氧對照組比較，3、7 d低氧損傷組HIF-1α水平顯著升高；與低氧損傷組比較，3、7 d低氧藥物組HIF-1α水平顯著降低。15、30 d 的HIF-1α水平差異在三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

NC：normoxic control group，HC：hypoxic control group，HD：hypoxic drug group；*：HC vs NC，P<0.05；#：HD vs HC，P<0.05

2.2 大鼠海馬神經(jīng)元自噬體鑒定

圖2顯示，透射電鏡下自噬小體呈現(xiàn)雙層膜包被的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，多位于細(xì)胞核、線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近。自噬小體其內(nèi)包含了線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基體及不明物質(zhì)等。自噬前體多呈新月狀(圖NC7d)或杯狀(圖HD15d)，具有游離的雙層膜結(jié)構(gòu)或多層膜結(jié)構(gòu)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一端與線粒體接觸、延長、閉合包裹住線粒體形成自噬小體(圖HC3d、HD3d、HC7d、HD7d 、HD30d)。自噬小體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，其間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，其表現(xiàn)為單層膜(圖NC3d、HC30d)。同時(shí)顯示，HC7d、HD15d的自噬體表達(dá)相對對應(yīng)組為多。

2.3 海馬神經(jīng)元自噬蛋白LC3免疫熒光標(biāo)記

用Cy2與DAPI對各組大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)，Cy2標(biāo)記LC3蛋白，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。圖3顯示，共聚焦顯微鏡下自噬體的數(shù)量以點(diǎn)狀聚集的方式呈現(xiàn)。根據(jù)文獻(xiàn)[7]表述，點(diǎn)狀聚集的密集程度可以判斷細(xì)胞自噬的情況，采用計(jì)算機(jī)軟件zen采集點(diǎn)狀聚集信號進(jìn)行分析，以 “細(xì)胞群中平均每個(gè)細(xì)胞所含的點(diǎn)狀聚集數(shù)目或者點(diǎn)狀聚集的總面積”作為細(xì)胞免疫熒光的定量比較指標(biāo)。圖4顯示了大鼠海馬神經(jīng)元LC3的平均熒光強(qiáng)度，低氧損傷組LC3的表達(dá)在3 d和7 d時(shí)高于常氧對照組和低氧藥物組，在15 d時(shí)低于低氧藥物組，在30 d時(shí)高于常氧對照組，與低氧藥物組無差異。

2.4 海馬神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

圖5顯示，p62表達(dá)(A)：3、7 d低氧損傷組低于常氧對照組和低氧藥物組；15 d低氧損傷組高于常氧對照組和低氧藥物組；30 d三組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LC3Ⅱ/Ⅰ比值(B)，3、7 d低氧損傷組高于常氧對照組和低氧藥物組；15 d低氧損傷組低于常氧對照組和低氧藥物組；30 d三組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Transmission electron microscope，Scale bar=200 nm，NC：normoxic control group，HC：hypoxic control group，HD：hypoxic drug group，M：mitochondria，N：nuclei，ER：endoplasmic reticulum，Go：golgi，Red arrow：autophagosome

Transmission electron microscope，630×，NC：normoxic control group，HC：hypoxic control group，HD：hypoxic drug group，Green：LC3 protein expression，Blue：nucleus

*：HC vs NC，P<0.05；#：HD vs HC，P<0.05

*：HC vs NC，P<0.05；#：HD vs HC，P<0.05

2.5 大鼠海馬神經(jīng)元CA3區(qū)尼氏染色鑒定

圖6顯示，與常氧對照組比較，低氧損傷組隨著時(shí)間的延長，神經(jīng)元損傷程度加重，3、7 d組海馬神經(jīng)元排列不齊，數(shù)目較少，結(jié)構(gòu)發(fā)生腫脹；15、30 d組海馬神經(jīng)元大部分溶解，結(jié)構(gòu)不清，尼氏小體數(shù)量幾乎沒有，部分呈現(xiàn)空泡。與低氧損傷組比較，低氧藥物組的海馬神經(jīng)元形態(tài)較完整，尼氏小體數(shù)量多，排列整齊且密集。

Nissl staining，200×，NC：normoxic control group，HC：hypoxic control group，HD：hypoxic drug group

2.6 海馬神經(jīng)元相關(guān)蛋白表達(dá)

圖7C、D顯示，3、7 d，低氧損傷組PKCε、BDNF蛋白表達(dá)水平均低于常氧對照組和低氧藥物組；15、30 d，低氧損傷組PKCε蛋白表達(dá)水平高于常氧對照組和低氧藥物組，而低氧損傷組BDNF蛋白表達(dá)水平高于常氧對照組，低氧藥物組高于低氧損傷組。

*：HC vs NC，P<0.05；#：HD vs HC，P<0.05

2.7 相關(guān)性分析

圖8顯示，低氧損傷組大鼠海馬神經(jīng)元PKCε與BDNF的蛋白表達(dá)變化呈正相關(guān)(E，r=0.976，P<0.01，n=6)；3、7 d低氧損傷組，低氧藥物組PKCε和BDNF與LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)(F，r=-0.981，P<0.05；G，r=-0.899，P<0.05，n=6)。

E：Correlation analysis of BDNF and PKCε(r=0.976，P<0.01，n=6)in hypoxic control group；F：Correlation analysis of LC3Ⅱ/Ⅰ and PKCε(r=-0.981，P<0.05，n=6)，G：Correlation analysis of LC3Ⅱ/Ⅰ and BDNF(r=-0.899，P<0.05，n=6)in hypoxic control and drug group in the third and seventh days

Figure8CorrelationanalysisamongBDNFandPKCε，LC3Ⅱ/ⅠandPKCε，LC3Ⅱ/ⅠandBDNFindifferentgroup

3 討論

缺氧誘導(dǎo)的自噬作用與缺氧的程度密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)2 h時(shí)，在體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中自噬活動(dòng)的增強(qiáng)可起到一定的保護(hù)作用，而OGD 6 h時(shí)，自噬活動(dòng)的增強(qiáng)反而加重神經(jīng)元損傷[8]。有研究者觀察到，在饑餓條件下自噬體約在10 min內(nèi)出現(xiàn)，約1 h達(dá)高峰，半衰期約0.5 h，自噬體向自噬溶酶體轉(zhuǎn)變需7～8 min[9]。這與本研究中的結(jié)果相似。我們通過western blot檢測發(fā)現(xiàn)在低壓低氧第3天和第7天時(shí)，低氧損傷組大鼠海馬神經(jīng)元的自噬水平高于常氧對照組和低氧藥物組，這個(gè)結(jié)果與免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。這表明急性低壓低氧可促進(jìn)海馬神經(jīng)元自噬體的形成和自噬蛋白的過表達(dá)，而藏藥四味黃芪散能夠降低低壓低氧誘導(dǎo)的自噬水平。

PKCε、BDNF參與對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在低壓低氧第3天和第7天時(shí)，低氧損傷組中PKCε、BDNF表達(dá)較低，而藥物組表達(dá)較高，尼氏染色結(jié)果也顯示藏藥四味黃芪散干預(yù)后的神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，尼氏小體較多，說明藏藥四味黃芪散可促進(jìn) PKCε、BDNF高表達(dá)并對海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用。在第15天和第30天時(shí)，PKCε表達(dá)在低氧損傷組反而較低氧藥物組表達(dá)高，這可能是低氧下的PKCε發(fā)揮了缺氧預(yù)處理的保護(hù)作用，而低氧藥物組BDNF的表達(dá)高于低氧損傷組，而且通過尼氏染色觀察，低氧損傷組神經(jīng)元內(nèi)的尼氏體消失，細(xì)胞核溶解，而低氧藥物組的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，因此說明藏藥四味黃芪散不僅對急性低壓低氧期所致腦神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，而且對慢性低壓低氧期也具有保護(hù)作用。在低氧損傷組中，PKCε、BDNF變化趨勢保持很高的關(guān)聯(lián)性，其相關(guān)系數(shù)為r= 0.976(P<0.01)。有研究表明在腦缺血預(yù)處理(ischemic-preconditioning，IPC)中PKCε發(fā)揮作用，可調(diào)節(jié)BDNF水平[4]，使機(jī)體通過短期缺氧應(yīng)激反應(yīng)對隨后長時(shí)間的缺血損傷產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用[10]。在全腦缺血/缺氧期間，PKCε通過BDNF/TrkB路徑增加記憶蛋白活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞興奮性毒性導(dǎo)致的損傷，達(dá)到了保護(hù)神經(jīng)的作用[11]。這和我們的研究結(jié)果一致。

對PKCε與自噬作用的研究存在不同觀點(diǎn)。早期Toton Ewa等人[12]發(fā)現(xiàn)抗癌藥物沙波廷能夠顯著降低PKCε過表達(dá)細(xì)胞中的自噬的形成，表明PKCε具有促進(jìn)Zapotin抑制自噬活動(dòng)的作用。但另有觀點(diǎn)[13]認(rèn)為，用siRNA技術(shù)沉默PKCε的基因，可誘導(dǎo)自噬表達(dá)下降，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl 2的表達(dá)增加。Chen Ai 等人[14]也發(fā)現(xiàn)PKCε的下游信號BDNF可通過激活自噬水平發(fā)揮缺氧對神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。而本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在急性低壓低氧期，PKCε、BDNF與LC3蛋白水平變化呈負(fù)相關(guān)，可能自噬蛋白與PKCε、BDNF蛋白具有相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，但這還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，在急性低壓低氧期，藏藥四味黃芪散調(diào)節(jié)自噬水平對低壓低氧所致海馬神經(jīng)元的損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)PKCε、BDNF蛋白水平，下調(diào)自噬水平而發(fā)揮了保護(hù)作用；而在慢性低壓低氧期沒有看到明顯的自噬調(diào)節(jié)作用，可能是通過其他路徑發(fā)揮保護(hù)作用，或許與慢性低氧期藥物濃度水平下降有關(guān)。

(致謝：感謝青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心、青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心在本課題研究中所提供的幫助和支持)