王旭明, 趙夏夏, 陳景陽, 許江環(huán), 周柏霖, 王盼盼, 莫 素, 莫俊杰, 謝 平, 周鴻凱

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鹽脅迫下海水稻抗逆生理響應(yīng)分析*

王旭明, 趙夏夏, 陳景陽, 許江環(huán), 周柏霖, 王盼盼, 莫 素, 莫俊杰, 謝 平**, 周鴻凱**

(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院 湛江 524088)

以海水稻品種‘FL478’ ‘JX99’ ‘Pokkali’和鹽敏感品種‘IR29’為材料, 設(shè)置6個土壤含鹽量(0 g·kg-1、1 g·kg-1、2 g·kg-1、3 g·kg-1、4 g·kg-1、5 g·kg-1), 在防雨大棚下進(jìn)行盆栽試驗, 孕穗期測定水稻葉片的丙二醛含量、細(xì)胞膜透性、可溶性糖含量、脯氨酸含量, 以及Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)、鳥氨酸-δ-氨基轉(zhuǎn)移酶(δ-OAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性, 旨在探討鹽脅迫下海水稻滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗逆酶與海水稻耐鹽性的關(guān)系, 為海水稻耐鹽基因的發(fā)掘和耐鹽品種的選育提供理論依據(jù)。結(jié)果表明: 1)鹽脅迫抑制了海水稻葉綠素的合成與積累, 表現(xiàn)為水稻葉片的葉綠素含量隨鹽脅迫梯度的增加而減少, 但其葉綠素含量顯著高于鹽敏感水稻品種。2)海水稻和鹽敏感水稻的可溶性糖對鹽脅迫的響應(yīng)差異顯著, 其中土壤含鹽量0~3 g·kg-1脅迫下, 鹽敏感水稻葉片的可溶性糖含量的增加顯著高于海水稻, 但是在土壤含鹽量4~5 g·kg-1下, 海水稻葉片的可溶性糖積累量顯著高于鹽敏感水稻品種。3)隨鹽脅迫加劇海水稻和鹽敏感水稻葉片的丙二醛積累, 造成細(xì)胞膜透性逐漸增大, 但是海水稻品種丙二醛的積累量顯著低于鹽敏感對照, 這表明海水稻葉片細(xì)胞膜損傷較小。4)鹽脅迫下, 4個水稻葉片的脯氨酸含量和P5CS、δ-OAT、SOD活性隨鹽脅迫濃度增加均表現(xiàn)出先升高后降的趨勢, 海水稻和鹽敏感水稻分別在3 g·kg-1、2 g·kg-1鹽濃度達(dá)到峰值, 而海水稻植株的游離脯氨酸積累量、P5CS、δ-OAT和SOD活性顯著高于鹽敏感水稻。5)鹽脅迫下海水稻可溶性糖、脯氨酸和P5CS之間呈極顯著正的簡單相關(guān)和偏相關(guān)性。因此, 海水稻的抗鹽性為生理性耐鹽: 在鹽脅迫下, 植株脯氨酸合成酶P5CS和δ-OAT均被激活, 脯氨酸合成的兩個途徑(谷氨酸→脯氨酸和鳥氨酸→脯氨酸)同時增強(qiáng), 促使植株游離脯氨酸的快速積累。同時, 由于植株游離脯氨酸快速積累, 也助于植株SOD活性的激活, 有效降低活性氧的積累, 并通過合成可溶性糖與脯氨酸協(xié)同緩解滲透脅迫, 而表現(xiàn)為較強(qiáng)的耐鹽性。

海水稻; 鹽脅迫; 抗逆生理; 滲透調(diào)節(jié); 抗逆酶活性

土壤鹽漬化是全世界農(nóng)業(yè)面臨的嚴(yán)重問題[1], 土壤耕作層鹽分的積累主要來自于含有微量氯化鈉的灌溉水和海水[2]。我國鹽堿地面積大、分布廣、類型豐富, 主要分布在東北、西北、華北及濱海地區(qū)[3], 鹽荒地約0.2億hm2, 其中鹽堿耕地達(dá)670萬hm2, 約占全國耕地面積的1/4[4-5]。在耕地鹽漬化加劇與水資源稀缺的雙重壓力下, 選育耐鹽堿的農(nóng)作物品種以開發(fā)利用鹽堿地及沿海灘涂來保障糧食安全和嚴(yán)守耕地紅線成為需迫切化解的農(nóng)業(yè)難題。而耐鹽堿水稻(俗稱海水稻, sea rice)作為沿海灘涂和鹽堿地開發(fā)利用的先鋒作物, 成為鹽堿地修復(fù)與利用的有效措施, 為解決糧食安全問題提供了新途徑[6]。

探究鹽脅迫下耐鹽水稻的生理生化代謝活動與耐受機(jī)制, 是耐鹽堿水稻選育的基礎(chǔ), 近兩年海水稻的耐鹽堿機(jī)制成為了研究熱點, 目前有關(guān)海水稻的耐鹽生理和耐鹽種質(zhì)選育已取得階段性成果。1939年首次在斯里蘭卡繁殖了強(qiáng)耐鹽水稻品種‘Pokkali’[7], 并獲得大面積推廣種植。EI-Shabrawi等[8]和Kabir等[9]研究發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫下耐鹽品種‘Pokkali’通過保持較高的甲基二乙醛解毒系統(tǒng)關(guān)鍵酶(乙二醛酶Ⅰ和Ⅱ)活性, 降低抗壞血酸鹽/脫氫抗壞血酸的比率, 提高抗氧化酶活性增加其耐鹽性。耐鹽水稻品種‘FL478’受鹽脅迫早期通過抑制有機(jī)酸(OA)代謝以抑制其生長來適應(yīng)鹽脅迫, 生長后期自身積累大量的可溶性糖和氨基酸等小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)緩解滲透脅迫, 提高自身的抗逆性[10-11]。Prusty等[12]對在高鹽度(240 mmol?L-1NaCl)下22個野生稻品種以及海水稻‘Pokkali’ ‘Nona Bokra’和‘FL478’, 并以鹽敏感品種‘IR29’為對照進(jìn)行耐鹽評價, 發(fā)現(xiàn)野生耐受植株和海水稻較感鹽品種根系Na+濃度較低, 葉片組織耐鹽性高, 芽中丙二醛含量低, 幼葉葉綠素積累量較高。Domingo等[13]通過伽瑪射線誘導(dǎo)120 mmol?L-1NaCl濃度下的鹽敏感水稻種子, 并成功獲得3份耐鹽突變體, 發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下編碼茉莉酸-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因下調(diào), 產(chǎn)生的茉莉酮酸參與耐鹽反應(yīng), 提高抗性。海水稻新品種‘海稻86’是栽培稻的野生近源種, 通過體內(nèi)積累較多的脯氨酸與可溶性糖降低滲透壓, 維持滲透平衡, 中度鹽脅迫下膜脂過氧化物質(zhì)丙二醛、活性氧積累較少, 因此具有較高的強(qiáng)耐鹽堿特性[14-15]。雖然對耐鹽水稻耐鹽生理特性的研究已有較多報導(dǎo), 但是強(qiáng)耐鹽堿水稻種質(zhì)資源的缺乏是限制水稻耐鹽生理調(diào)控機(jī)制研究和耐鹽種質(zhì)創(chuàng)新的瓶頸[15], 海水稻的選育為水稻抗鹽生理生化特性的深入研究和揭示其耐鹽機(jī)制提供了機(jī)遇。

本研究選取海水稻品種‘Pokkali’ ‘FL478’ ‘JX99’和鹽敏感水稻品種‘IR29’為材料, 設(shè)置6個鹽脅迫梯度, 采用盆栽試驗, 測定孕穗期8個生理生化指標(biāo), 探索滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、相關(guān)性酶與水稻耐鹽性的關(guān)系, 以揭示海水稻的脯氨酸合成與調(diào)節(jié)的響應(yīng)機(jī)制, 為耐鹽基因的發(fā)掘和耐鹽品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為‘IR29’ ‘JX99’ ‘FL478’和‘Pokkali’。其中, ‘FL478’是矮桿且感光性鈍感型、耐鹽堿性海水稻; ‘JX99’是矮桿且感光性鈍感型、強(qiáng)耐鹽堿性海水稻; ‘Pokkali’是強(qiáng)耐鹽堿性海水稻; ‘IR29’是鹽敏感型水稻品種, 作為對照材料。4份水稻材料均由廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

本試驗在廣東海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所(110°29′E, 21°15′N)試驗區(qū)進(jìn)行。選取廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗田耕作層(0~20 cm)水稻土作為盆栽基土, 土壤有機(jī)質(zhì)含量32.86 g·kg-1, 全磷0.46 g·kg-1, 速效磷65.00 mg·kg-1, 全鉀22.41 g·kg-1, 速效鉀117.21 mg·kg-1, 水溶性總鹽0.85 g·kg-1, 堿解氮177.45 mg·kg-1, pH 6.47。土樣風(fēng)干碾碎后過1號篩(篩孔尺寸: 2.00 mm; 標(biāo)準(zhǔn)目數(shù): 10目), 充分混勻, 添加不同質(zhì)量的NaCl混合均勻后裝桶(內(nèi)徑30 cm, 高35 cm, 無滲漏), 每桶裝15 kg。

1.2 水稻幼苗的培養(yǎng)

2016年7月12日, 人工精選各水稻品種的飽滿籽粒, 先用蒸餾水浸泡5 min后, 去除不實籽粒。用3%的H2O2浸泡20 min, 用去離子水沖洗干凈并均勻平鋪于無菌培養(yǎng)皿中, 放置30 ℃種子培養(yǎng)箱下催芽48 h, 期間換水6次并保持培養(yǎng)皿濕潤, 待種子露白后種植于廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻試驗田中進(jìn)行幼苗培育。

1.3 鹽脅迫處理

2016年7月27日, 取過篩后的風(fēng)干土, 按照土壤含鹽量(土壤含鹽量=NaCl添加量/土壤量)計算, 添加不同量的NaCl(AR分析純), 依次形成5個NaCl處理梯度, 分別為1 g·kg-1、2 g·kg-1、3 g·kg-1、4 g·kg-1和5 g·kg-1, 以不添加NaCl為對照。每桶施4 g水稻專用復(fù)合肥(含氮18%、磷12%、鉀16%, ‘洋豐正好’牌水稻專用肥, 2016年5月產(chǎn))作為基肥, 隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計, 6個處理, 每個處理組合12桶, 共72桶。

秧苗移栽前多次攪拌桶內(nèi)土壤, 將土壤和鹽充分?jǐn)嚢杈鶆颉?016年8月6日, 待水稻長至3葉1心, 選取長勢均勻的秧苗, 移栽到試驗桶中, 每桶6棵。將試驗桶放在廣東海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所防雨大棚內(nèi), 每天通過稱重加水, 每桶插入相同刻度的標(biāo)尺保持2 cm水層。生長期間每天早、晚觀察水稻的生長狀況, 并拍照記錄, 使用土壤含鹽量測試儀(臺灣衡欣Az8371型)每天監(jiān)測桶內(nèi)耕作層土壤含鹽量、電導(dǎo)率, 以保證整個生育期水稻耕作層(0~20 cm)土壤平均含鹽量及電導(dǎo)率相對穩(wěn)定(表1)。

表1 盆栽試驗中不同處理的水稻耕作層(0~20 cm)土壤含鹽量

處理CK、T1、T2、T3、T4和T5分別在土壤中添加0 g·kg-1、1 g·kg-1、2 g·kg-1、3 g·kg-1、4 g·kg-1和5 g·kg-1的NaCl。In treatments CK, T1, T2, T3, T4, and T5, 0 g·kg-1, 1 g·kg-1, 2 g·kg-1, 3 g·kg-1, 4 g·kg-1and 5 g·kg-1NaCl are added to base soil, respectively.

1.4 材料處理及各項生理生化指標(biāo)的測定

2016年9月22日(水稻孕穗期)采樣, 每桶選取3株長勢一致的整株, 根系清洗干凈, 并拍照記錄。

葉綠素含量測定采用浸提法[16]。脯氨酸含量采用磺基水楊酸法進(jìn)行測定[17]?？扇苄蕴呛康臏y定參照蒽酮比色法[18]進(jìn)行測定。葉片細(xì)胞膜透性的測定按照李合生[19]的方法, 使用電導(dǎo)率儀(DDS-307型電導(dǎo)率儀, 雷磁-上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司生產(chǎn))測定葉片電導(dǎo)率。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸顯色法[20]進(jìn)行測定。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(delta-1-pyrroline- 5-carboxylate synthase, P5CS)活性測定參照Hayzer等[21]與韓曉玲[22]的鹽酸羥胺比色法測定, 酶活力單位: U·g-1·min-1, 一個酶活單位(1U)定義為每分鐘生成1 μmol γ-谷氨酰胺(濕樣)所需要的酶量。鳥氨酸-δ-氨基轉(zhuǎn)移酶(ornithine-δ-aminotransferase, δ-OAT)活性的測定按照Hu等[23]與Kim等[24]的方法測定, 一個酶活性單位(1 U)定義為1 h生成1 mmol Δ1-吡咯啉-5-羧酸(濕樣)所需要的酶量, 單位為U·g-1·h-1。超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用總SOD活性檢測試劑盒(產(chǎn)品貨號: A001-1羥胺法, 南京建成生物工程研究所2016年8月生產(chǎn))測定, 操作按照總SOD活性檢測說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析[25]和相關(guān)性分析[26-27]。作圖通過Microsoft Excel 2010軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對海水稻葉綠素含量與可溶性糖含量的影響

隨著土壤含鹽量的增加, 4個水稻品種葉綠素含量呈明顯下降趨勢(圖1)。不同品種對不同鹽濃度的響應(yīng)也不同。同一鹽脅迫下, 3個海水稻品種間的葉綠素含量差異不顯著, 而在0~4 g·kg-1土壤含鹽量下‘FL478’和‘Pokkali’的葉綠素含量顯著高于鹽敏感品種‘IR29’。在0 g·kg-1、2 g·kg-1、5 g·kg-1土壤含鹽量下, 海水稻品種‘JX99’與‘FL478’的葉綠素含量差異顯著, 而海水稻品種‘Pokkali’的葉綠素含量差異不顯著。說明鹽脅迫對海水稻品種葉綠素的合成與積累影響較小, 而對鹽敏感品種‘IR29’的影響較大。

隨土壤含鹽量的增加, 4個水稻品種可溶性糖含量變化有差異: 鹽敏感品種‘IR29’、海水稻品種‘Pokkali’和‘JX99’的可溶性糖含量逐漸升高, ‘FL478’的可溶性糖含量卻呈先升后降的趨勢。0~3 g·kg-1鹽脅迫下, 鹽敏感水稻‘IR29’葉綠素含量差異顯著高于海水稻品種。海水稻品種‘JX99’、‘FL478’和‘Pokkali’的可溶性糖積累量分別在3~5 g·kg-1土壤含鹽量間差異顯著。土壤含鹽量為4~5 g·kg-1時, 海水稻品種‘JX99’和‘Pokkali’的可溶性糖含量顯著高于鹽敏感品種‘IR29’。說明鹽脅迫促進(jìn)海水稻植株可溶性糖的合成與積累, 隨著土壤含鹽量的增加, 海水稻在抵抗鹽脅迫傷害時積累較多的可溶性糖以緩解鹽脅迫傷害, 表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽能力。

圖1 鹽脅迫對海水稻葉綠素、可溶性糖含量的影響

‘FL478’ ‘JX99’和‘Pokkali’為耐鹽水稻品種; ‘IR29’是鹽敏感型水稻品種, 作為對照。處理CK、T1、T2、T3、T4和T5分別在土壤中添加0 g·kg-1、1 g·kg-1、2 g·kg-1、3 g·kg-1、4 g·kg-1和5 g·kg-1的NaCl。不同大寫字母表示同一水稻品種不同鹽濃度之間差異顯著(Duncan法,<0.05); 不同小寫字母表示同一鹽濃度不同水稻品種間差異顯著(Duncan法,<0.05)?！瓼L478’ ‘JX99’ and ‘Pokkali’ are sea-rice cultivars, ‘IR29’ is salt-sensitive rice cultivar. In treatments CK, T1, T2, T3, T4, and T5, 0 g·kg-1, 1 g·kg-1, 2 g·kg-1, 3 g·kg-1, 4 g·kg-1and 5 g·kg-1NaCl are added to base soil, respectively. Different capital letters indicate significant differences among different salt contents for the same rice cultivar (Duncan method,< 0.05). Different lowercase letters indicate significant differences among rice cultivars at the same salt content (Duncan method,< 0.05).

2.2 鹽脅迫對海水稻脯氨酸含量、脯氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的影響

脯氨酸是植物細(xì)胞質(zhì)中小分子游離氨基酸, 作為優(yōu)質(zhì)的滲透調(diào)節(jié)劑, 可緩解鹽脅迫逆境、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性, 可作為耐鹽篩選的指標(biāo)[28-29]。不同鹽處理下的海水稻葉片脯氨酸含量均明顯高于對照(圖2)。同一鹽處理下, 海水稻品種‘Pokkali’和‘JX99’與鹽敏感水稻品種‘IR29’間的脯氨酸積累量呈顯著差異。4個水稻品種在不同鹽處理間水稻葉片脯氨酸積累量存在顯著差異, 且均高于CK處理。土壤含鹽量在2 g·kg-1下‘IR29’的游離脯氨酸積累量達(dá)到峰值, 而海水稻在3 g·kg-1達(dá)到峰值, 而土壤含鹽量為3~5 g·kg-1時, ‘Pokkali’和‘JX99’游離脯氨酸含量仍保持較高水平。說明鹽脅迫促進(jìn)水稻脯氨酸的積累, 海水稻‘Pokkali’和‘JX99’合成較多的游離脯氨酸, 增強(qiáng)了海水稻的耐鹽性。

逆境脅迫下, 植物脯氨酸的合成與積累有2條途徑: 谷氨酸途徑中P5CS是關(guān)鍵酶, 鳥氨酸途徑中δ-OAT是調(diào)節(jié)脯氨酸合成的主要調(diào)控酶[30-31]。4個水稻品種的P5CS、δ-OAT活性在鹽脅迫處理后呈先升高后降低的趨勢, 其中P5CS活性和δ-OAT活性變化與脯氨酸含量的變化趨勢具有同步一致性(圖2)。Duncan方差分析發(fā)現(xiàn)土壤含鹽量為3 g·kg-1時, 海水稻的P5CS活性增幅較大, 其δ-OAT活性在2 g·kg-1鹽濃度下增幅較大, 而鹽敏感水稻‘IR29’的P5CS、δ-OAT活性呈相反的結(jié)果。水稻品種在不同土壤鹽濃度間的P5CS活性差異顯著。土壤含鹽量在0~1 g·kg-1下4個水稻品種間P5CS活性差異不明顯, 而3~4 g·kg-1土壤鹽濃度下海水稻與鹽敏感品種‘IR29’間差異顯著。在2 g·kg-1土壤鹽濃度下海水稻品種的δ-OAT活性達(dá)到峰值, 均顯著高于鹽敏感品種‘IR29’, 而鹽敏感水稻的δ-OAT活性在3 g·kg-1土壤鹽濃度下達(dá)到峰值, 保持較高水平。在1~4 g·kg-1土壤鹽濃度下海水稻品種間的δ-OAT活性差異顯著, 3~5 g·kg-1的鹽濃度下鹽敏感品種‘IR29’與‘FL478’間的δ-OAT活性差異不顯著, 而顯著高于‘Pokkali’和‘JX99’。說明水稻遭受鹽脅迫時, 其P5CS、δ-OAT酶協(xié)同促進(jìn)脯氨酸合成與積累, 而3~5 g·kg-1鹽脅迫海水稻P5CS活性代謝活躍高于對照, 以生成較多的游離脯氨酸緩解鹽脅迫傷害, 抗鹽能力較強(qiáng), 表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性, 與上述研究結(jié)果一致。

圖2 鹽脅迫對海水稻脯氨酸含量、脯氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的影響

‘FL478’ ‘JX99’和‘Pokkali’為耐鹽水稻品種; ‘IR29’是鹽敏感型水稻品種, 作為對照。處理CK、T1、T2、T3、T4和T5分別在土壤中添加0 g·kg-1、1 g·kg-1、2 g·kg-1、3 g·kg-1、4 g·kg-1和5 g·kg-1的NaCl。不同大寫字母表示同一水稻品種不同鹽濃度之間差異顯著(Duncan法,<0.05); 不同小寫字母表示同一鹽濃度不同水稻品種間差異顯著(Duncan法,<0.05)?！瓼L478’ ‘JX99’ and ‘Pokkali’ are sea-rice cultivars, ‘IR29’ is salt-sensitive rice cultivar. In treatments CK, T1, T2, T3, T4, and T5, 0 g·kg-1, 1 g·kg-1, 2 g·kg-1, 3 g·kg-1, 4 g·kg-1and 5 g·kg-1NaCl are added to base soil, respectively. Different capital letters indicate significant differences among different salt contents for the same rice cultivar (Duncan method,< 0.05). Different lowercase letters indicate significant differences among rice cultivars at the same salt content (Duncan method,< 0.05).

2.3 鹽脅迫對海水稻丙二醛含量、膜透性的影響

植物在逆境下遭受傷害, 往往發(fā)生膜脂過氧化作用, 丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物, 其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度[32]。隨著鹽脅迫程度加劇, 4個水稻品種的葉片MDA含量逐漸升高, 且變化趨勢一致, 均在5 g·kg-1鹽濃度下達(dá)到最大值(圖3)。鹽濃度0~1 g·kg-1下, 4個水稻品種間MDA的積累量無顯著差異, 而2~5 g·kg-1鹽濃度下3個海水稻品種的MDA積累量顯著低于鹽敏感水稻‘IR29’。同一個水稻品種的MDA積累量在鹽濃度為0~1 g·kg-1間差異不顯著, 而在3~5 g·kg-1脅迫下差異顯著。結(jié)果表明鹽脅迫加劇迫使MDA積累量增加, 海水稻品種較鹽敏感品種IR29積累較少的MDA, 細(xì)胞膜脂過氧化傷害較小, 表現(xiàn)出強(qiáng)耐鹽性。

水稻細(xì)胞膜是最先感知逆境脅迫的細(xì)胞器, 逆境因子最先破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能, 導(dǎo)致電解質(zhì)外滲, 細(xì)胞內(nèi)電導(dǎo)率增加, 直接反映水稻細(xì)胞膜受損程度[33-34]。隨土壤含鹽量的增加, 4個水稻品種葉片電導(dǎo)率逐漸增大, 在5 g·kg-1濃度下水稻葉片的電導(dǎo)率達(dá)到最大值(圖3)。同一鹽脅迫下, 海水稻品種間差異不顯著, 而與鹽敏感品種間顯著差異, 其中鹽敏感品種‘IR29’的電導(dǎo)率增幅明顯, 顯著高于海水稻品種。同一水稻品種在0~2 g·kg-1鹽濃度間的電導(dǎo)率無顯著差異, 而3~5 g·kg-1間的水稻葉片電導(dǎo)率達(dá)顯著差異。整個鹽脅迫下, 葉片電導(dǎo)率的大小排列為: ‘IR29’>‘FL478’>‘JX99’>‘Pokkali’。說明鹽脅迫破壞了細(xì)胞膜的完整性, 土壤含鹽量越高, 細(xì)胞膜受損越大, 其中鹽敏感品種細(xì)胞膜受損嚴(yán)重, 而海水稻的細(xì)胞膜受損程度較小, 表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鹽性。

圖3 鹽脅迫對海水稻丙二醛含量、膜透性的影響

‘FL478’ ‘JX99’和‘Pokkali’為耐鹽水稻品種; ‘IR29’是鹽敏感型水稻品種, 作為對照。處理CK、T1、T2、T3、T4和T5分別在土壤中添加0 g·kg-1、1 g·kg-1、2 g·kg-1、3 g·kg-1、4 g·kg-1和5 g·kg-1的NaCl。不同大寫字母表示同一水稻品種不同鹽濃度之間差異顯著(Duncan法,<0.05); 不同小寫字母表示同一鹽濃度不同水稻品種間差異顯著(Duncan法,<0.05)。‘FL478’ ‘JX99’ and ‘Pokkali’ are sea-rice cultivars, ‘IR29’ is salt-sensitive rice cultivar. In treatments CK, T1, T2, T3, T4, and T5, 0 g·kg-1, 1 g·kg-1, 2 g·kg-1, 3 g·kg-1, 4 g·kg-1and 5 g·kg-1NaCl are added to base soil, respectively. Different capital letters indicate significant differences among different salt contents for the same rice cultivar (Duncan method,< 0.05). Different lowercase letters indicate significant differences among rice cultivars at the same salt content (Duncan method,< 0.05).

2.4 鹽脅迫對海水稻抗氧化酶活性的影響

鹽漬環(huán)境下, 超氧化物歧化酶(SOD)作為抗氧化系統(tǒng)主要酶, 能清除植物體內(nèi)活性氧, 減輕對植物的毒害作用[35]。隨著土壤含鹽量的增加, 4個水稻種質(zhì)的SOD活性均呈先升高后降低的趨勢, 而鹽脅迫下4個水稻品種的SOD活性均顯著高于非鹽脅迫對照(圖4)。在2 g·kg-1鹽濃度鹽敏感品種‘IR29’的SOD活性達(dá)到峰值, 而海水稻品種均在3 g·kg-1達(dá)最大值, 海水稻‘JX99’和‘Pokkali’的SOD活性均顯著低于鹽敏感品種‘IR29’。說明鹽脅迫促進(jìn)水稻SOD活性增加, 其中鹽敏感品種‘IR29’的SOD活性較高, 而3~5 g·kg-1鹽濃度, 水稻SOD活性逐漸受到抑制。

2.5 鹽脅迫下海水稻生理生化指標(biāo)的相關(guān)性

本研究中, 鹽脅迫下海水稻各生理指標(biāo)不是獨立起作用的, 而是各指標(biāo)間存在相關(guān)性(表2)。通過簡單和偏相關(guān)綜合分析發(fā)現(xiàn), 脯氨酸與可溶性糖含量、P5CS活性之間達(dá)到極顯著正相關(guān)(<0.01), 簡單相關(guān)系數(shù)分別是0.547和0.815, 而偏相關(guān)系數(shù)分別為0.626、0.888。說明鹽脅迫下, 海水稻各生理指標(biāo)對脯氨酸的合成影響較大, 為消除各變量間的綜合影響, 偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)可溶性糖、P5CS活性均與脯氨酸含量凈相關(guān)關(guān)系較緊密, 起正效應(yīng)。MDA含量與細(xì)胞膜透性、可溶性糖含量呈正的簡單相關(guān)和偏相關(guān)性, 均達(dá)極顯著水平, 但是MDA含量與葉綠素含量、δ-OAT活性之間達(dá)到極顯著水平的負(fù)簡單相關(guān)和偏相關(guān)性, MDA含量與SOD活性間的正簡單相關(guān)無顯著性, 兩個指標(biāo)間卻達(dá)到極顯著的正偏相關(guān)性, 說明受鹽脅迫海水稻體內(nèi)MDA的積累與細(xì)胞膜透性關(guān)系緊密, 起正效應(yīng), 而δ-OAT活性、葉綠素含量與MDA含量之間相關(guān)關(guān)系和直接關(guān)系較密切, 卻起負(fù)效應(yīng), 表明鹽脅迫促進(jìn)海水稻體內(nèi)MDA的積累加劇了細(xì)胞膜透性增大, 降低了葉綠素含量, 而δ-OAT活性的增加卻直接參與MDA的清除。SOD與P5CS、δ-OAT活性呈正簡單相關(guān)性, 且達(dá)極顯著水平, 與偏相關(guān)分析結(jié)果一致, 表明鹽脅迫下海水稻抗逆酶SOD與P5CS、δ-OAT活性之間具有正向協(xié)同作用, 且關(guān)系密切。P5CS與δ-OAT活性呈簡單負(fù)相關(guān)性, 且達(dá)到極顯著水平, 而偏相關(guān)性卻不顯著, 說明鹽脅迫下P5CS與δ-OAT通過與其他指標(biāo)相互作用, 提高其活性, 來增加海水稻的抗逆性。

圖4 鹽脅迫對海水稻超氧化物歧化酶活性的影響

‘FL478’ ‘JX99’和‘Pokkali’為耐鹽水稻品種; ‘IR29’是鹽敏感型水稻品種, 作為對照。處理CK、T1、T2、T3、T4和T5分別在土壤中添加0 g·kg-1、1 g·kg-1、2 g·kg-1、3 g·kg-1、4 g·kg-1和5 g·kg-1的NaCl。不同大寫字母表示同一水稻品種不同鹽濃度之間差異顯著(Duncan法,<0.05); 不同小寫字母表示同一鹽濃度不同水稻品種間差異顯著(Duncan法,<0.05)?！瓼L478’ ‘JX99’ and ‘Pokkali’ are sea-rice cultivars, ‘IR29’ is salt-sensitive rice cultivar. In treatments CK, T1, T2, T3, T4, and T5, 0 g·kg-1, 1 g·kg-1, 2 g·kg-1, 3 g·kg-1, 4 g·kg-1and 5 g·kg-1NaCl are added to base soil, respectively. Different capital letters indicate significant differences among different salt contents for the same rice cultivar (Duncan method,< 0.05). Different lowercase letters indicate significant differences among rice cultivars at the same salt content (Duncan method,< 0.05).

表2 鹽脅迫下海水稻抗逆生理指標(biāo)間的相關(guān)性系數(shù)矩陣

Chl: 葉綠素含量; Pro: 脯氨酸含量; SS: 可溶性糖含量; MDA: 丙二醛含量; CMP: 細(xì)胞膜透性; P5CS: Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶活; δ-OAT: 鳥氨酸-δ-氨基轉(zhuǎn)移酶活; SOD: 超氧化物歧化酶活性。**和*分別表示在0.01和0.05水平(雙側(cè)檢驗)上顯著相關(guān)。左下區(qū)域為簡單相關(guān)性分析, 右上區(qū)域為偏相關(guān)性分析。Chl: chlorophyll content; Pro: proline content; SS: soluble sugar content; MDA: malondialdehyde content; CMP: cell membrane permeability; P5CS: delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase activity; δ-OAT: ornithine-δ-aminotransferase activity; SOD: superoxide dismutase activity. ** and * indicate significant correlations at< 0.01 and< 0.05 (Two-sided test), respectively. The lower left area is a simple correlation analysis. The upper right area is a partial correlation analysis.

3 討論

水稻是沿海灘涂和鹽堿地開發(fā)利用的首選糧食作物, 但是水稻對土壤中的鹽分尤其是NaCl特別敏感[36-37]。水稻的耐鹽性是復(fù)雜的生理生化過程, 涉及諸多性狀基因、蛋白和多種耐鹽機(jī)制的協(xié)調(diào)作用[38], 水稻不同耐鹽性品種也存在耐鹽性差異[39]。通過分析鹽脅迫下海水稻抗鹽生理反應(yīng), 以了解海水稻具體的耐鹽性反應(yīng)機(jī)制, 對解析耐鹽生理生化機(jī)制和挖掘耐海水稻種質(zhì)資源具有重要意義。

3.1 鹽脅迫下海水稻的葉綠素合成與降解效應(yīng)

葉綠素含量是體現(xiàn)葉片衰老程度的指標(biāo)之一, 鹽脅迫促使葉片細(xì)胞Na+的積累, 提高葉綠素酶活性, 加速葉綠素的降解[40-41]。本研究結(jié)果表明, 土壤含鹽量的增加，加速水稻葉綠素的降解, 同時葉綠素合成受阻, 但海水稻品種間對鹽脅迫的響應(yīng)基本相同, 葉綠素含量差異不顯著, 但均顯著高于鹽敏感品種‘IR29’, 說明海水稻抗鹽能力強(qiáng), 表現(xiàn)出葉片衰老減緩, 具有較強(qiáng)的葉綠素合成及抗降解能力。

3.2 鹽脅迫下海水稻的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成與積累效應(yīng)

水稻在逆境下脯氨酸、可溶性糖作為有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及營養(yǎng)物質(zhì), 對生物膜及其蛋白質(zhì)起到保護(hù)作用[42-43], Ghoulam等[44]和Li等[45]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下水稻體內(nèi)積累大量的游離脯氨酸和可溶性糖。本研究結(jié)果表明, 鹽脅迫下水稻葉片的脯氨酸和可溶性糖逐漸積累, 其中海水稻葉片的脯氨酸的積累量顯著高于鹽敏感對照, 而在土壤含鹽量0~3 g·kg-1脅迫下, 鹽敏感葉片的可溶性糖含量顯著高于海水稻, 土壤含鹽量4~5 g·kg-1時, 海水稻葉片的可溶性糖積累量顯著高于對照。說明鹽脅迫促進(jìn)海水稻植株可溶性糖和脯氨酸的合成與積累, 作為有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)共同調(diào)節(jié)滲透脅迫, 其中海水稻合成的可溶性糖一部分作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)緩解滲透脅迫, 另外一部分用于植株生長所需的營養(yǎng)原料, 同時也反映出海水稻具有較強(qiáng)的抗鹽能力。

在滲透脅迫條件下, 植物體內(nèi)P5CS、δ-OAT活性增加促進(jìn)脯氨酸的合成與積累直接參與滲透調(diào)節(jié)[31,46]。鹽脅迫下海水稻植株的脯氨酸合成關(guān)鍵酶P5CS、δ-OAT及植物體內(nèi)抗氧化酶SOD的活性與脯氨酸含量的變化趨勢同步: 隨著鹽脅迫增加均呈先升后降趨勢, 這3個酶的活性均在3 g·kg-1鹽脅迫下達(dá)到峰值, 其中3~5 g·kg-1鹽脅迫海水稻P5CS活性明顯高于鹽敏感品種‘IR29’, 而此濃度脅迫下的海水稻δ-OAT活性卻低于鹽敏感對照。說明水稻遭受鹽脅迫時, 0~3 g·kg-1的鹽濃度脅迫激發(fā)P5CS、δ-OAT酶協(xié)同促進(jìn)脯氨酸合成與積累, 而在3~5 g·kg-1的土壤含鹽量脅迫下P5CS主要參與海水稻脯氨酸的合成。土壤含鹽量超過3 g·kg-1, 隨土壤鹽濃度的增加抗逆相關(guān)的酶P5CS、δ-OAT、SOD活性降低, 但海水稻的脯氨酸含量仍保持較高水平, 說明海水稻具有較強(qiáng)的脯氨酸合成與積累能力、抗?jié)B透脅迫能力和清除氧化作用能力, 海水稻吸收適量Na+, 可激發(fā)脯氨酸合成與積累的相關(guān)酶的活性而促進(jìn)脯氨酸的合成與積累, 然而土壤含鹽量超過3 g·kg-1, 海水稻葉片積累過多Na+導(dǎo)致海水稻體內(nèi)離子不平衡, 引發(fā)生理生化代謝的紊亂, 致使植物細(xì)胞中葉綠體和線粒體電子傳遞的泄漏, 引起活性氧的大量積累, 對細(xì)胞內(nèi)的酶類和膜系統(tǒng)造成傷害[47-48], 從而降低了植株脯氨酸的合成與積累。

3.3 鹽脅迫下海水稻的氧化作用產(chǎn)物MDA積累與質(zhì)膜透性效應(yīng)

MDA作為耐鹽的生理指標(biāo)之一, 是細(xì)胞內(nèi)的不飽和脂肪酸氧化形成的產(chǎn)物, 大量積累會造成膜脂過氧化, 細(xì)胞膜透性增大[49]。細(xì)胞膜透性直接反映了植物葉片細(xì)胞膜的完整性及其受到傷害的程度, 在正常的生長條件下, 植物的質(zhì)膜透性均較小[50]。本試驗發(fā)現(xiàn), 4個水稻品種受鹽脅迫傷害時, 鹽害特征差異明顯, 鹽脅迫下鹽敏感水稻品種‘IR29’體內(nèi)積累大量的膜脂過氧化產(chǎn)物MDA, 造成細(xì)胞膜大量的電解質(zhì)外滲, 細(xì)胞膜的完整性破壞嚴(yán)重。海水稻品種體內(nèi)MDA積累量較少, 其細(xì)胞膜脂過氧化傷害較小。說明鹽脅迫下海水稻品種抗氧化能力較強(qiáng), 其體內(nèi)MDA積累量較少, 細(xì)胞抗氧化能力較強(qiáng), 受鹽害較小, 表現(xiàn)出強(qiáng)耐鹽性。

3.4 耐鹽海水稻的生理生化指標(biāo)相關(guān)性

通過對鹽脅迫下海水稻抗逆指標(biāo)間的互作關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫下可溶性糖、P5CS活性與脯氨酸含量簡單相關(guān)和偏相關(guān)有極顯著的正相關(guān), 偏相關(guān)系數(shù)大于簡單相關(guān)性系數(shù), 說明鹽脅迫使海水稻植株可溶性糖、P5CS直接參與脯氨酸的合成, 其中海水稻的可溶性糖可為脯氨酸的合成提供碳骨架原料和能量來源, 這與前人的研究結(jié)果一致[51-52]。MDA與細(xì)胞膜透性之間簡單相關(guān)和偏相關(guān)系數(shù)達(dá)極顯著正相關(guān), 而與葉綠素含量呈顯著負(fù)相關(guān), 與SOD活性的直接關(guān)系達(dá)到正的極顯著水平, 說明鹽脅迫促進(jìn)海水稻體內(nèi)MDA的大量積累, 迫使細(xì)胞膜透性增大, 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞加劇, 葉綠素合成降低, 而受鹽脅迫下的海水稻抗氧化酶SOD參與了MDA的清除, 降低膜脂過氧化傷害。鹽脅迫促進(jìn)海水稻SOD與P5CS、δ-OAT活性增加, 3個抗逆酶之間均達(dá)到極顯著正相關(guān)和偏相關(guān), 表明鹽脅迫下海水稻抗逆酶SOD與P5CS、δ-OAT活性之間具有正向協(xié)同作用, 提高其活性, 共同直接參與海水稻抗逆生理反應(yīng), 以增加海水稻的抗逆性。

4 結(jié)論

鹽脅迫對海水稻的鹽害程度較小, 隨土壤含鹽量增加, 海水稻MDA積累量較少, 對其細(xì)胞膜脂過氧化傷害較小，細(xì)胞膜的完整性較好, 表現(xiàn)出強(qiáng)耐鹽性。海水稻為抵抗鹽脅迫在體內(nèi)大量積累可溶性糖, 其中一部分用于自身生長所需和為脯氨酸合成提供碳骨架原料和能量來源, 另外一部分與脯氨酸一起共同作為滲透調(diào)節(jié)物, 參與緩解滲透脅迫, 降低滲透壓, 使海水稻細(xì)胞膜受鹽害程度減少, 提高海水稻耐鹽能力。土壤含鹽量3 g·kg-1是海水稻正常生長的耐鹽閾值, 該鹽脅迫下海水稻抗逆相關(guān)酶P5CS、δ-OAT和SOD正向協(xié)同作用, 活性達(dá)到最大值, 共同調(diào)節(jié)脯氨酸的合成與積累, 土壤含鹽量4~5 g·kg-1水平, 海水稻葉片積累過多Na+導(dǎo)致海水稻體內(nèi)MDA大量積累, 細(xì)胞膜透性增大, 而P5CS直接參與脯氨酸合成。因此海水稻作為特有遺傳材料將為水稻耐鹽堿性的提高和耐鹽水稻種質(zhì)資源創(chuàng)新提供寶貴理論依據(jù)和耐鹽堿基因資源。

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Physiological adversity resistance of sea rice to salinity stress*

WANG Xuming, ZHAO Xiaxia, CHEN Jingyang, XU Jianghuan, ZHOU Bolin, WANG Panpan, MO Su, MO Junjie, XIE Ping**, ZHOU Hongkai**

(College of Agriculture, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

The sea rice varieties ‘FL478’ ‘JX99’ ‘Pokkali’ and salt-sensitive variety ‘IR29’ were used to determine malondialdehyde content, cell membrane permeability, soluble sugar and proline in rice leaf. We also investigated the activities of Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid synthetase (P5CS), ornithine-δ-aminotransferase (δ-OAT) and superoxide dismutase (SOD) under 0 g·kg-1, 1 g·kg-1, 2 g·kg-1, 3 g·kg-1, 4 g·kg-1and 5 g·kg-1of soil salt treatments at booting stage of potted rice under rainproof greenhouse conditions. This aim of the study was to investigate the relationship between osmotic regulators, stress resistance enzymes and salt tolerance of sea rice under salinity stress. The study also provided theoretical basis for the exploration of salt tolerance genes and breeding sea rice varieties with salt tolerance. The results were as follows: 1) salinity stress inhibited the synthesis and accumulation of chlorophyll in rice. Then chlorophyll content in rice leaf decreased with increasing salt stress concentration, and was significantly higher than that of salt-sensitive rice. 2) The response of soluble sugars of sea rice and salt-sensitive rice to salinity stress had significantly differences. The rise in soluble sugars of sea rice was less than that of salt-sensitive rice under 0-3 g·kg-1soil salt content, but the content of soluble sugars of sea rice was significantly higher than that of salt-sensitive rice under 4-5 g·kg-1soil salt content. 3) Malondialdehyde contents of sea rice and salt-sensitive varieties increased with increasing salt stress, resulting in increased cell membrane permeability. However, malondialdehyde content of sea rice was significantly lower than that of salt-sensitive rice. This implied that leaf membrane damage of sea rice was significantly less than that of salt-sensitive rice. 4) Proline content and P5CS, δ-OAT and SOD activities of rice leaf increased initially and then decreased with increasing salt stress. Proline content and P5CS, δ-OAT and SOD activities of sea rice and salt-sensitive rice were maximum under 3 g·kg-1and 2 g·kg-1salt content, respectively. However, proline content and P5CS, δ-OAT and SOD activities of sea rice were significantly higher than those of salt-sensitive rice. 5) Simple and partial correlations of soluble sugar, proline and P5CS were significantly positive under salinity stress. Salt tolerance characteristics of sea rice were considered as physiological salt tolerance. Proline synthetase P5CS and δ-OAT of sea rice were both activated by salinity stress. The activity of two pathways of proline synthesis (ornithine synthase and glutamate synthase pathways) were simultaneously increased, which promoted rapid and high accumulation of free proline in sea rice. Rapid accumulation of free proline also activated SOD activity, which effectively destroyed the accumulation of intracellular reactive oxygen species. Soluble sugar and proline synergistically alleviated osmotic stress and sea rice showed a strong salt tolerance.

Sea rice; Salt stress; Anti-stress physiology; Osmotic regulation; Resistance enzyme activity

ZHOU Hongkai, E-mail: 897961801@qq.com; XIE Ping, E-mail: xiep168@163.com

Jul. 10, 2018;

Jan. 10, 2019

S511.01

A

2096-6237(2019)05-0747-10

10.13930/j.cnki.cjea.180656

王旭明, 趙夏夏, 陳景陽, 許江環(huán), 周柏霖, 王盼盼, 莫素, 莫俊杰, 謝平, 周鴻凱. 鹽脅迫下海水稻抗逆生理響應(yīng)分析[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(中英文), 2019, 27(5): 747-756

WANG X M, ZHAO X X, CHEN J Y, XU J H, ZHOU B L, WANG P P, MO S, MO J J, XIE P, ZHOU H K. Physiological adversity resistance of sea rice to salinity stress[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2019, 27(5): 747-756

* 國家自然科學(xué)基金項目(41073059)、廣東省高等教育高校創(chuàng)新強(qiáng)校工程項目(GDOU2017052604, 2017KZDXM044)、廣東省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新及推廣項目(2018LM2173)和湛江市科技計劃項目(2015A03015)資助

周鴻凱, 主要從事作物學(xué)研究, E-mail: 897961801@qq.com; 謝平, 主要從事農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境方面的研究, E-mail: xiep168@163.com

王旭明, 主要從事作物抗逆生理研究, E-mail: m18793630087@163.com

2018-07-10

2019-01-10

* This research was supported by the National Natural Science Foundation of China (41073059), the Higher Education Colleges and Universities Innovation Strong School Project of Guangdong (GDOU2017052604, 2017KZDXM044), the Provincial Agricultural Science and Technology Innovation and Promotion Project of Guangdong Province (2018LM2173) and the Science and Technology Project of Zhanjiang City (2015A03015).