劉秀梅,索朗拉姆，劉曉巖，王銀葉*

(1.鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450003；2.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，拉薩 850000；3.北京大學(xué)藥學(xué)院分子與細(xì)胞藥理學(xué)系，北京 100191)

巖木瓜為桑科榕屬植物巖木瓜FicustsiangiiMerr.ex Corner的樹(shù)皮,主要分布在我國(guó)云南、貴州、廣西、四川、湖南、湖北等地,在四川的部分地區(qū)巖木瓜被作為民間藥用,基于抗血栓作用被用于治療心血管系統(tǒng)疾病，但目前對(duì)巖木瓜化學(xué)成分或活性的報(bào)道較少。本課題組先前對(duì)巖木瓜樹(shù)皮揮發(fā)性成分及其生物活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其主要揮發(fā)性成分為脂肪酸類化合物,具有抗血栓活性[1]。本研究對(duì)4種不同方法得到的巖木瓜提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用、體外抗氧化活性及抑制血小板聚集的作用進(jìn)行了研究,以期為巖木瓜的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器 MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；DL-CJ-1N高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；XDS-1B雙相倒置顯微鏡(重慶光電儀器總公司)；HH.S1-Ni電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)；Bio-Rad 550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad公司)；TS-1型脫色搖床(江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Chrono-log490型雙通道血小板聚集儀(美國(guó)Chrono-log公司)；Anke TDL-40B 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 藥品和試劑 巖木瓜提取物由北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系提供，其中樣品A為煎煮法提取總提取物，樣品B為50%乙醇總提取物，樣品C為50%乙醇-水提取物，樣品D為50%乙醇提取后水提取部分。維生素E(VE)膠丸(北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。H2O2、二甲亞砜(DMSO)、枸櫞酸鈉、檸檬酸鈉(北京化工廠)。RPIM-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibcobrl公司)；小牛血清(PAA Laboratories GmpH公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、1×104U青霉素、10 mg/ml鏈霉素[邁晨(北京)科技有限公司]。噻唑藍(lán)(MTT)、二磷酸腺苷(ADP)、血小板活化因子(PAF)(美國(guó)Sigma 公司)；硫氰化鉀(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.3 動(dòng)物 SD雄性大鼠，體質(zhì)量160～180 g，5～6周齡，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2016-0010；雄性大耳白兔，體質(zhì)量2～3 kg，動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(京)2016-0041，均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。

1.4 內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 將雄性SD大鼠胸主動(dòng)脈置入細(xì)胞培養(yǎng)液中，用眼科剪刀縱向剪開(kāi)主動(dòng)脈段，用眼科直鑷輕輕刮動(dòng)內(nèi)膜，滴加培養(yǎng)液在內(nèi)膜上，吸取并加入預(yù)先鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，然后向培養(yǎng)瓶中加入3～5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)。將培養(yǎng)瓶置二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃，含5%CO2)中培養(yǎng)。每2～3 d換液一次，每次加入含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液3～5 ml，7～10 d后細(xì)胞融合，呈鋪路石樣鑲嵌式單層排列，此時(shí)可傳代[2]。

1.5 樣品對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 選取傳代5代的大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞以5×104/ml的密度接種于96孔板中，每孔200 μl,在37 ℃的5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)[2]。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄去上層培養(yǎng)液，然后用PBS洗兩遍。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、H2O2損傷組(H2O2終濃度為0.15 mmol/L)、陽(yáng)性對(duì)照組(VE終濃度1 g/L)、給藥組(4種不同方法得到的巖木瓜提取物A、B、C、D終濃度分別為0.5、0.25、0.125 g/L)。正常對(duì)照組以100 μl無(wú)血清1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，H2O2損傷組加90 μl無(wú)血清1640培養(yǎng)液；其余各組加入無(wú)血清1640培養(yǎng)液80 μl，再加入10 μl(終濃度0.5、0.25、0.125 g/L)的巖木瓜提取物A、B、C、D溶液，作用1 h后，除正常對(duì)照組外，其余各組每孔迅速加入預(yù)冷的H2O2溶液(終濃度為0.15 mmo/L)10 μl，輕輕搖勻，在37 ℃的5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。4 h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，用PBS輕輕洗兩遍，每孔加入含0.5 g/L MTT的無(wú)血清1640培養(yǎng)液100 μl，在37 ℃的5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h后，棄原培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μl，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度(A570 nm)，計(jì)算細(xì)胞存活率[3]。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組/A正常對(duì)照組)×100%。

1.6 體外抗氧化活性測(cè)定 將巖木瓜提取物與FeSO4·7H2O(終濃度1.875 mmol/L)混合，加入H2O2(終濃度0.5 mmol/L)，啟動(dòng)氧化反應(yīng)，反應(yīng)5 min后，加入硫氰化鉀(KSCN，終濃度3.75 mmo/L)，立即用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處的吸光度(A490 nm)[2]。Fe2+在H2O2作用下生成Fe3+，F(xiàn)e3+與KSCN反應(yīng)生成血紅色的Fe(SCN)3，可以在490 nm處測(cè)定吸光度。氧化產(chǎn)物的水平可以通過(guò)A490 nm表示。反應(yīng)體系中若有抗氧化物質(zhì)存在，生成的Fe(SCN)3會(huì)減少，相應(yīng)的A值會(huì)降低。

1.7 體外血小板聚集實(shí)驗(yàn) 取體質(zhì)量2～3 kg的雄性家兔，從家兔耳中動(dòng)脈取血，以1/10體積的3.8%檸檬酸鈉抗凝，以相對(duì)離心力150×g離心15 min。取出上層富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)，下層繼續(xù)以相對(duì)離心力1.0×103×g離心10 min,制備貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)。 用Born比濁法進(jìn)行血小板聚集實(shí)驗(yàn)[4]，用PRP調(diào)血小板聚集儀零點(diǎn)，用PPP調(diào)儀器100%，將樣品或溶媒與PRP溫育1 min,然后加入誘導(dǎo)劑ADP(終濃度8×10-5mol/L)、PAF(終濃度4×10-7mol/L)引起血小板聚集，紀(jì)錄最大聚集率B。樣品對(duì)血小板聚集的抑制率(I)=[B正常對(duì)照組-B實(shí)驗(yàn)組)/B正常對(duì)照組]×100%。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的測(cè)定結(jié)果 H2O2誘導(dǎo)受損的內(nèi)皮細(xì)胞在巖木瓜提取物作用4 h后的細(xì)胞存活率見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，終濃度0.15 mmo/L的H2O2作用4 h后，細(xì)胞存活率明顯降低，說(shuō)明細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。與H2O2損傷組相比，樣品A、D在終濃度為0.125、0.25和0.5 g/L時(shí)可以不同程度地提高細(xì)胞存活率，與H2O2損傷組相比有顯著性差異 (P<0.01)，且樣品A、D濃度依賴性地提高細(xì)胞存活率。而樣品B在0.25和0.5 g/L，樣品C僅在濃度為0.5 g/L時(shí)顯示出對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

**P<0.01,與正常對(duì)照組比較；△△P<0.01,與H2O2損傷組比較

2.2 體外抗氧化活性 終濃度為0.125、0.25和0.5 g/L的樣品A、B、C、D均能使Fe2+氧化為 Fe3+的量減少，具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，并且呈現(xiàn)出濃度依賴性。樣品A(終濃度0.25和0.5 g/L)、樣品B(終濃度0.5 g/L)、樣品C和樣品D(終濃度為0.125、0.25和0.5 g/L)與陽(yáng)性對(duì)照組相比，抗氧化活性有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表2。

組別樣品A樣品B 樣品C樣品D空白對(duì)照組0.846±0.039 0.125 g/L 給藥組0.528±0.059??0.63±0.037??0.48±0.011??△△0.48±0.028??△△0.25 g/L 給藥組0.433±0.006??△△0.57±0.041??0.38±0.033??△△0.34±0.013??△△0.5 g/L 給藥組0.323±0.009??△△0.53±0.035??△0.35±0.001??△△0.26±0.010??△△陽(yáng)性對(duì)照組0.631±0.023??

**P<0.01，與空白對(duì)照組比較；△P<0.05，△△P<0.01,與陽(yáng)性對(duì)照組比較

2.3 對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制活性 測(cè)得0.5、0.25、0.125 g/L樣品A對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率分別為33.3%、21.5%和14.3%，0.5 g/L樣品C的血小板聚集抑制率為3.5%，而0.5 g/L樣品B和樣品D的血小板聚集抑制率均為0%。表明樣品A對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有一定的抑制作用，樣品C對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集幾乎無(wú)抑制作用，樣品B和樣品D對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集無(wú)影響。

2.4 對(duì)PAF誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用 0.5 g/L的樣品B溶液對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率為17.4%，而0.5 g/L樣品A、C、D溶液對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率均為0%。表明樣品B在終濃度為0.5 g/L時(shí)對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集有較弱的抑制作用，終濃度為0.5 g/L的樣品A、C、D溶液對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集無(wú)影響。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，巖木瓜主要含有黃酮類、香豆素類、三萜類、木脂素類及脂肪酸等成分[5]。段松冷等[1]研究發(fā)現(xiàn)，巖木瓜中的脂肪酸類化合物有一定的抗血小板聚集作用。巖木瓜有一定的抗血栓活性，但其作用機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，觀察巖木瓜提取物是否具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于血管內(nèi)壁表面的單層細(xì)胞，可分泌細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)，具有維持血管滲透性、血管張力及調(diào)節(jié)血壓等功能[6]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[4]，因此對(duì)即將受損的內(nèi)皮細(xì)胞施加保護(hù)作用具有重要意義。內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的損傷非常敏感，H2O2被廣泛應(yīng)用于氧化損傷模型的制備[7]。H2O2擁有活性氧，能促進(jìn)自由基的生成，生物體內(nèi)H2O2如不及時(shí)消除，H2O2可透過(guò)細(xì)胞膜，誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷而死亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，巖木瓜提取物A、D(終濃度為0.125、0.25和0.5 g/L)，提取物B(終濃度為0.25和0.5 g/L)，提取物C(終濃度為0.5 g/L)均可明顯提高H2O2損傷內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，表明巖木瓜提取物對(duì)氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用。

病理狀態(tài)下，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致血管功能損傷，是心血管事件的危險(xiǎn)因素之一。機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基和過(guò)氧化物可被體內(nèi)的抗氧化劑，如超氧化物歧化酶、VE、VC和谷胱甘肽等清除。一些藥物，如他汀類藥物，可以通過(guò)抗氧化作用起到心血管保護(hù)作用[9]。為驗(yàn)證巖木瓜提取物是否具有直接的抗氧化活性，本研究采用了一種無(wú)細(xì)胞氧化反應(yīng)，經(jīng)典的抗氧化劑VE具有直接抗氧化活性，巖木瓜提取物亦表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化活性，提示巖木瓜可能通過(guò)抗氧化而發(fā)揮治療心血管疾病的作用。

血小板在維持人體正常生理穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)病理狀態(tài)下的血栓形成中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，血小板聚集并暴露于內(nèi)皮下的膠原中，迅速黏附，激活血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的促凝活性，最終形成血栓，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致缺血性心血管事件的發(fā)生[10]。抑制血小板聚集是臨床上防治心腦血管疾病的重要手段之一。在本研究中，巖木瓜提取物A對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有一定的抑制作用，提取物B對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集有較弱的抑制作用，提示巖木瓜提取物可能影響血小板聚集而發(fā)揮抗血栓作用。

本研究發(fā)現(xiàn)巖木瓜提取物可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有體外抗氧化活性，且有一定的抗血小板聚集作用，這些作用可能與其抗血栓的功效有關(guān)，從而為巖木瓜的心血管保護(hù)作用研究打下基礎(chǔ)。