（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家林業(yè)和草原局中南速生材繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530002）

江南油杉（Keteleeria fortuneivar.cyclolepis）屬松科（Pinaceae）油杉屬，為我國(guó)特有常綠喬木，是山地造林、用材林和園林綠化的理想樹(shù)種?，F(xiàn)塊狀分布或散生于江西、湖南、廣東、廣西、貴州、云南、福建、浙江等地，常在海拔1 km 以下的丘陵和低山的陽(yáng)坡地帶生長(zhǎng)良好[1]。每年1—2月江南油杉在多年生枝條上形成花芽，3月初花粉發(fā)育成熟并開(kāi)始散粉，花粉具2個(gè)氣囊，風(fēng)媒傳粉[2]。

花粉活力對(duì)植物果實(shí)的授粉和受精、種子產(chǎn)量和質(zhì)量有直接影響，主要受植物自身遺傳特性與外界因素的影響，尤其易受溫度影響[3-5]。研究花粉的離體萌發(fā)特性，確定最佳培養(yǎng)基組分，可以揭示花粉的生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育及花粉管的生長(zhǎng)過(guò)程，對(duì)于植物雜交育種也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[6-8]。近年來(lái)的野外觀察發(fā)現(xiàn)，江南油杉在傳粉時(shí)極易受雨季影響，致使大量球果授粉不足，進(jìn)而導(dǎo)致種子敗育率高、質(zhì)量較低。本研究通過(guò)花粉離體萌發(fā)對(duì)江南油杉的花粉萌發(fā)特性進(jìn)行研究，對(duì)其花粉活力進(jìn)行快速檢測(cè)，并了解其花粉管生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，旨在找出適合江南油杉花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基配方，為解決球果授粉不足問(wèn)題及開(kāi)展種質(zhì)資源保存與人工授粉提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為裸子植物孢粉學(xué)研究積累有用的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需的江南油杉花粉采自廣西南丹縣里湖鄉(xiāng)麻風(fēng)寨（107°28'E，25°07'N）保存良好的天然林。于2018年3月初，采集發(fā)育正常尚未散粉的江南油杉雄球花，帶回實(shí)驗(yàn)室后用鑷子剝下小孢子葉球，放入鋪有硫酸紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)散粉24 h，后收集花粉，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉的離體萌發(fā)

采用液體培養(yǎng)法對(duì)江南油杉花粉進(jìn)行離體萌發(fā)試驗(yàn)，通過(guò)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別對(duì)培養(yǎng)基蔗糖濃度、硼酸（H3BO3）濃度、氯化鈣（CaCl2）濃度、pH 值以及培養(yǎng)溫度進(jìn)行研究。其中，蔗糖濃度試驗(yàn)的培養(yǎng)基為150 mg/L H3BO3+ 150 mg/L CaCl2+ pH 6.5，并分別添加0、50、100、150、200、250、300、350和400 g/L 蔗糖，共9個(gè)處理。H3BO3濃度試驗(yàn)的培養(yǎng)基為最適蔗糖濃度+150 mg/L CaCl2+ pH 6.5，并分別 添 加0、50、100、150、200、250和300 mg/L H3BO3，共7個(gè)處理。CaCl2濃度試驗(yàn)的培養(yǎng)基為最適蔗糖濃度+最適H3BO3濃度+ pH 6.5，并分別添加0、50、100、150、200、250和300 mg/L CaCl2，共7個(gè)處理。pH 值試驗(yàn)的培養(yǎng)基為最適蔗糖濃度+最適H3BO3濃度+最適CaCl2濃度，pH 值分別設(shè)置為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，共5個(gè)處理。培養(yǎng)基試驗(yàn)均在25℃條件下100 r/min 振蕩光照培養(yǎng)。以篩選獲得的最佳組分配制培養(yǎng)基，分別設(shè)置15、20、25、30和35℃培養(yǎng)溫度，共5個(gè)處理，100 r/min 振蕩光照培養(yǎng)。所有試驗(yàn)總計(jì)33個(gè)處理，每處理稱取5 mg 江南油杉花粉置于1 mL 培養(yǎng)基中，重復(fù)3次。

1.2.2 花粉萌發(fā)率與花粉管長(zhǎng)度觀測(cè)

江南油杉花粉在吸水24 h 后才能逐漸萌發(fā)，因此，各處理分別培養(yǎng)48、72和96 h后從培養(yǎng)基取樣，在OlympusCX-41 型光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)記錄，每處理的每個(gè)重復(fù)隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)算花粉萌發(fā)率，花粉管長(zhǎng)度大于花粉粒體寬視為萌發(fā)?；ǚ勖劝l(fā)率=(萌發(fā)花粉數(shù)/花粉粒總數(shù)）× 100%。隨機(jī)選取萌發(fā)的花粉測(cè)量花粉管長(zhǎng)度，每處理的每個(gè)重復(fù)隨機(jī)測(cè)量30個(gè)花粉管長(zhǎng)度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016對(duì)花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度進(jìn)行常規(guī)統(tǒng)計(jì)和制圖。采用SPSS 19.0對(duì)各試驗(yàn)處理間花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度進(jìn)行方差分析和多重比較（鄧肯氏新復(fù)極差法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響

不同蔗糖濃度處理，江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度存在極顯著差異（P＜0.01）。在無(wú)蔗糖的培養(yǎng)基（0 g/L）中，雖然花粉也可萌發(fā)，但萌發(fā)率顯著低于100～300 g/L 濃度下花粉的萌發(fā)率（P＜0.05），花粉管長(zhǎng)度顯著低于50～300 g/L 濃度下花粉管長(zhǎng)度（P＜0.05）（表1）。3個(gè)時(shí)段，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均隨蔗糖濃度的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)；培養(yǎng)48 h，花粉萌發(fā)率在250 g/L 濃度下達(dá)到最大（17.5%），花粉管長(zhǎng)度在200 g/L 濃度下最長(zhǎng)（89.4 μm）；培養(yǎng)72和96 h，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均在250 g/L 濃度下達(dá)到最大，分別為24.4%、141.3 μm和32.2%、210.8 μm。250 g/L 蔗糖較適合江南油杉花粉萌發(fā)。

2.2 H3BO3濃度對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響

不同H3BO3濃度處理，江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度存在極顯著差異（P＜0.01）。3個(gè)時(shí)段，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均隨H3BO3濃度的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)；培養(yǎng)48 h，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均在200 mg/L 濃度下達(dá)到高峰，分別為14.8%和82.9 μm；培養(yǎng)72和96 h，花粉萌發(fā)率均在200 mg/L 濃度下達(dá)到高峰，分別為26.8%和36.1%，花粉管長(zhǎng)度均在250 mg/L 濃度下達(dá)到高峰，分別為150.4和218.4 μm，但與200 mg/L 濃度下花粉管長(zhǎng)度差異不顯著（表2）。200 mg/L H3BO3較適合江南油杉花粉萌發(fā)。

表1 蔗糖濃度對(duì)江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度的影響Tab.1 Effects of sucrose concentrations on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

表2 H3BO3濃度對(duì)江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度的影響Tab.2 Effects of H3BO3 concentrations on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

2.3 CaCl2濃度對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響

3個(gè)時(shí)段，江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均隨CaCl2濃度的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)；培養(yǎng)48 h，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均在100 mg/L濃度下達(dá)到高峰，分別為18.7%和81.9 μm；培養(yǎng)72和96 h，花粉萌發(fā)率均在100 mg/L 濃度下達(dá)到高峰，分別為32.3%和41.3%，花粉管長(zhǎng)度均在150 mg/L濃度達(dá)到高峰，分別為151.4和215.3 μm，但與100 mg/L 濃度下花粉管長(zhǎng)度差異不顯著（表3）。100 mg/L CaCl2較適合江南油杉花粉萌發(fā)。

表3 CaCl2濃度對(duì)江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度的影響Tab.3 Effects of CaCl2 concentrations on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

2.4 pH值對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響

當(dāng)培養(yǎng)基pH 值為5.0和5.5 時(shí)，江南油杉花粉萌發(fā)率較低，兩者差異不顯著，花粉管生長(zhǎng)緩慢，隨著培養(yǎng)基pH 值升高，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度也隨之增加；當(dāng)pH 值為6.5 時(shí)，3個(gè)時(shí)段花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均達(dá)到最大，之后降低（表4）。培養(yǎng)基pH 6.5 較適合江南油杉花粉萌發(fā)。

表4 pH值對(duì)江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度的影響Tab.4 Effects of pH values on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

2.5 溫度對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響

不同溫度處理下江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度差異顯著（P＜0.05）。在15℃處理下，花粉萌發(fā)率較低，花粉管生長(zhǎng)緩慢；隨著溫度升高，花粉萌發(fā)率迅速升高，3個(gè)時(shí)段均在25℃最高，分別為18.5%（48 h）、33.2%（72 h）和42.1%（96 h）（圖1a）。3個(gè)時(shí)段花粉管長(zhǎng)度隨溫度的變化規(guī)律不一致；培養(yǎng)48 h，花粉管長(zhǎng)度隨溫度升高逐漸增加；培養(yǎng)72 h，花粉管長(zhǎng)度隨溫度升高先增加后減小，在30℃達(dá)到最大（156.24 μm），但與25℃花粉管長(zhǎng)度差異不顯著；培養(yǎng)96 h，花粉管長(zhǎng)度隨溫度升高先增加后減小，在25℃達(dá)到最大（217.44 μm）（圖1b）。

圖1 溫度對(duì)江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度的影響Fig.1 Effects of temperatures on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，在花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基中蔗糖、H3BO3和Ca2+為最常用的添加物質(zhì)，其中，蔗糖既是花粉萌發(fā)和花粉管壁合成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，又是花粉萌發(fā)時(shí)內(nèi)部代謝與跨膜運(yùn)輸?shù)奶荚矗S持著外界環(huán)境的滲透壓和花粉萌發(fā)形態(tài)[6，9]。Dane 等[10]研究發(fā)現(xiàn)花粉在離體萌發(fā)時(shí)，其自身儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控著外界的蔗糖濃度。本研究結(jié)果表明，在無(wú)蔗糖培養(yǎng)基中江南油杉花粉仍可萌發(fā)，但萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度顯著低于添加蔗糖的培養(yǎng)基，可能是花粉自身儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為其萌發(fā)提供一定養(yǎng)分，但隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，花粉管生長(zhǎng)緩慢；添加不同濃度蔗糖的培養(yǎng)基之間，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度差異顯著，高濃度蔗糖會(huì)抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)，這與田菊等[11]對(duì)油松（Pinus tabuliformis）花粉離體萌發(fā)和李國(guó)平等[12]對(duì)黑松（Pinus thunbergii）花粉離體萌發(fā)的研究結(jié)果一致。

花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基中的H3BO3可引導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)的Ca2+進(jìn)入花粉細(xì)胞內(nèi)，并增加花粉細(xì)胞對(duì)糖的吸收與代謝，促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)[13-14]。Ca2+對(duì)花粉管極性生長(zhǎng)與生長(zhǎng)方向具有調(diào)控作用[15]。相關(guān)研究表明，H3BO3濃度和Ca2+濃度對(duì)油松[11]、黑松[12]、五針?biāo)桑≒inus parviflora）、羅漢松（Podocarpus macro?phyllus）[16]和銀杏（Ginkgo biloba）[17]等裸子植物離體花粉的萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均表現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的作用，高濃度硼酸和Ca2+會(huì)抑制花粉的萌發(fā)，與本文研究結(jié)果一致。但本研究中，培養(yǎng)48 h，花粉管長(zhǎng)度在200 mg/L H3BO3和100 mg/L CaCl2處理下達(dá)到高峰，而培養(yǎng)72和96 h，花粉管長(zhǎng)度均在250 mg/L H3BO3和150 mg/L CaCl2處理下達(dá)到高峰，這可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)前期，200 mg/L H3BO3和100 mg/L CaCl2能滿足花粉管生長(zhǎng)的需求，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加需要更高的H3BO3和CaCl2濃度才能促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)。

不同植物花粉離體培養(yǎng)基最佳pH 值和最適培養(yǎng)溫度差異較大。趙麗娟等[6]研究表明小黑楊（Pop?ulus simonii×P.nigra）花粉離體萌發(fā)的最佳pH 值為6.0，最適培養(yǎng)溫度為21℃；黃家興等[18]研究表明凱特杏（Prunus armeniaca‘Katy’）花粉離體萌發(fā)的最佳pH值為6.0，最適培養(yǎng)溫度為20℃；Kakani等[19]研究表明陸地棉（Gossypium hirsutum）花粉離體萌發(fā)的最適溫度為32℃。試驗(yàn)表明，pH 值和培養(yǎng)溫度均對(duì)江南油杉花粉萌發(fā)影響顯著。江南油杉花粉離體培養(yǎng)基最適pH值為6.5，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，花粉萌發(fā)率下降，當(dāng)pH 值為5.0 時(shí)，花粉萌發(fā)率極低，且花粉管生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明江南油杉花粉萌發(fā)需要弱酸環(huán)境，強(qiáng)酸可能會(huì)破壞花粉細(xì)胞內(nèi)部代謝平衡[20]。江南油杉花粉萌發(fā)的最適溫度為25℃，過(guò)高或過(guò)低均會(huì)抑制其花粉萌發(fā)，25℃與江南油杉散粉期外界溫度相近，說(shuō)明溫度并不是自然條件下江南油杉球果授粉不足的限制因素。

綜上所述，江南油杉花粉離體萌發(fā)最佳培養(yǎng)基組合和培養(yǎng)條件為250 g/L 蔗糖+ 200 mg/L H3BO3+100 mg/L CaCl2，pH值為6.5，置于25℃光照培養(yǎng)96 h時(shí)萌發(fā)率為42.4%，為進(jìn)一步開(kāi)展江南油杉種質(zhì)資源保存和人工授粉的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。