陳素紅， 鄒 璞， 廖景平

(1. 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院， 廣州 510520； 2. 中國(guó)科學(xué)院 華南植物園， 廣州 510650)

花粉離體萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)早已證實(shí)了鈣在其中起重要作用。然而，花粉管的離體生長(zhǎng)系統(tǒng)可以模擬但不能完全代替花粉管的體內(nèi)生長(zhǎng)狀況。要證實(shí)體內(nèi)花粉管生長(zhǎng)與鈣的關(guān)系，還需要對(duì)花粉管在體內(nèi)雌蕊組織中的生長(zhǎng)途徑加以研究。

目前，國(guó)內(nèi)多位研究者[1-6]采用焦銻酸鹽沉淀法研究了多種植物的花粉管生長(zhǎng)軌道(柱頭表面、花柱引導(dǎo)組織、子房壁內(nèi)表面、珠孔)，發(fā)現(xiàn)雌蕊組織均有豐富的鈣沉淀顆粒，且在這些組織中的鈣沉淀顆粒多分布在引導(dǎo)組織細(xì)胞壁和胞外基質(zhì)的質(zhì)外體系統(tǒng)中，證明在離體實(shí)驗(yàn)中花粉管生長(zhǎng)需要鈣的特征在體內(nèi)可以從富含鈣的引導(dǎo)組織中得以滿(mǎn)足。離體實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)花粉管有向高鈣濃度方向生長(zhǎng)的向化性特征，并在金魚(yú)草[7]的雌蕊中也確實(shí)發(fā)現(xiàn)鈣有明顯的梯度分布，推測(cè)雌蕊中的鈣梯度分布是吸引花粉管定向生長(zhǎng)的原因。但除了少數(shù)幾種植物如煙草[5]、金魚(yú)草[7]、萵苣[8]和獼猴桃[9]的雌蕊中存在鈣梯度分布，在向日葵[1]、陸地棉[2]、水稻[3]、刺槐[10]等其他許多植物的雌蕊中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的鈣梯度。這可能與植物種類(lèi)、研究方法等有關(guān)，需進(jìn)行更為廣泛的觀察。

鈣在體內(nèi)生長(zhǎng)的花粉管中的分布特征也是研究受精前花粉管生長(zhǎng)與鈣關(guān)系的重要方面。Jaffe等用示蹤元素45Ca作為外源鈣發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入花粉管中的45Ca最初集中在花粉管頂端區(qū)域[11]。Reiss等用proton-induce x-ray emission (PIXE) 技術(shù)測(cè)量麝香百合花粉管中的總鈣分布，結(jié)果顯示花粉管頂端區(qū)域的鈣濃度高，而基部的相對(duì)較低，呈現(xiàn)梯度分布[12]。多位研究者[13-16]用金霉素處理后觀察花粉管中的細(xì)胞器膜鈣時(shí)發(fā)現(xiàn)花粉管頂端區(qū)域含較高的膜鈣，而基部區(qū)域的膜鈣較低，也呈現(xiàn)出梯度分布。隨著研究技術(shù)的改進(jìn)，有關(guān)花粉管中游離鈣的梯度分布研究顯示，鈣梯度的明顯區(qū)域在花粉管頂端20 μm以?xún)?nèi)，20 μm以后的鈣梯度變化幅度較小[17-21]。然而，對(duì)花柱中生長(zhǎng)的花粉管的鈣分布研究非常少，只在向日葵[1]、陸地棉[2]和煙草[22]中，研究者應(yīng)用焦銻酸鹽沉淀法觀察到體內(nèi)生長(zhǎng)的花粉管尖端的細(xì)胞器區(qū)段的胞質(zhì)、細(xì)胞器及管尖外周鈣含量較高，并且也僅在煙草研究中根據(jù)授粉和未授粉的花柱在開(kāi)花后1 d引導(dǎo)組織胞外基質(zhì)在靠近子房的部位有密集的鈣沉淀顆粒，推測(cè)花柱中存在鈣離子濃度梯度。本文采用焦銻酸鉀沉淀法對(duì)藍(lán)豬耳體內(nèi)生長(zhǎng)的花粉管以及柱頭和花柱中的鈣分布進(jìn)行定位，以期揭示鈣對(duì)藍(lán)豬耳體內(nèi)花粉管生長(zhǎng)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

試驗(yàn)材料藍(lán)豬耳(Toreniafournieri)種植在中科院華南植物園溫室，每年4—12月開(kāi)花，盛花期6—10月。藍(lán)豬耳花柱長(zhǎng)1.5 cm，通?；ǚ墼谥^上萌發(fā)需要1 h，花粉管在體內(nèi)生長(zhǎng)7 h到達(dá)子房頂部。將花柱0.3、0.9和1.5 cm處人為分為3個(gè)時(shí)期(從柱頭端開(kāi)始量取)，授粉后1 h取柱頭，2、4及6 h取上述3個(gè)時(shí)期的花柱，7 h取子房頂部。每次取柱頭、3個(gè)時(shí)期的花柱以及子房頂部進(jìn)行相對(duì)應(yīng)比較(圖1)。取去雄未授粉的柱頭、0.3、0.9、1.3和1.5 cm 處(從柱頭端開(kāi)始量取)的花柱進(jìn)行對(duì)比觀察。切取柱頭和約1 mm 長(zhǎng)的花柱，子房頂部，將其迅速放入含2%戊二醛、1%焦銻酸鉀、0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的前固定液(pH 7.8)中，4℃下固定12～24 h。用1%焦銻酸鉀、0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的洗滌液(pH 7.8)洗滌3次，每次30 min，之后轉(zhuǎn)入1%鋨酸、1%焦銻酸鉀、0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的后固定液(pH 7.8)中，在 4℃下固定16 h。再用上述洗滌液沖洗，經(jīng)乙醇梯度(30%、50%、70%、80%、90%和100%)脫水，環(huán)氧丙烷置換，Epon 812環(huán)氧樹(shù)脂滲透并包埋。每個(gè)處理切5個(gè)樣品。用LK-S型超薄切片機(jī)切片80 nm厚的柱頭和花柱切片用醋酸雙氧鈾染色20 min，清洗并晾干后用日本JEM-1010透射電子顯微鏡100 kV觀察、拍照。

圖1 藍(lán)豬耳雌蕊以及劃分花柱時(shí)期

2 結(jié)果與分析

藍(lán)豬耳柱頭屬濕型，由兩裂片構(gòu)成。裂片相對(duì)的內(nèi)表面為花粉接受面，外表面為非接受面。在接受面上的柱頭細(xì)胞為乳突細(xì)胞，緊接乳突細(xì)胞之下是引導(dǎo)組織。藍(lán)豬耳花柱屬開(kāi)放型，花柱道兩端較寬、中間較窄，其中充滿(mǎn)分泌物?；ㄖǖ烙幸粚犹鼗膬?nèi)表皮細(xì)胞，即通道細(xì)胞(或稱(chēng)引導(dǎo)組織細(xì)胞)。

2.1 花粉萌發(fā)以及花粉管在花柱內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中鈣的分布特征

藍(lán)豬耳在開(kāi)花當(dāng)天，柱頭兩裂片緊閉，開(kāi)花后2 d，兩裂片敞開(kāi)，開(kāi)始自然接受花粉。開(kāi)花前去雄，開(kāi)花后2 d進(jìn)行人工授粉。授粉1 h，花粉在柱頭上水合并萌發(fā)。剛萌發(fā)出的花粉管壁上沉淀較多的鈣沉淀顆粒，花粉管內(nèi)容物中很少有鈣沉淀顆粒分布(圖版Ⅰ-1)。此時(shí)花粉萌發(fā)的外環(huán)境中鈣分布較少。授粉2 h，花粉管沿著引導(dǎo)組織細(xì)胞生長(zhǎng)至0.3 cm花柱處。此時(shí)與花粉管相鄰的通道細(xì)胞細(xì)胞壁上及胞外基質(zhì)中分布較多的鈣沉淀顆粒，而花粉管尖端細(xì)胞器區(qū)段的鈣沉淀顆粒不多，集中分布在花粉管壁上，且鈣沉淀顆粒較大(圖版Ⅰ-3)；而管中內(nèi)容物的鈣沉淀顆粒很少，僅在管內(nèi)細(xì)胞器上有少量鈣沉淀顆粒(圖版Ⅰ-6)。授粉4 h，花粉管生長(zhǎng)至0.9 cm花柱處。此時(shí)花粉管中的鈣沉淀顆粒有所增加，并且在花粉管生長(zhǎng)的胞外基質(zhì)中也均勻分布較多的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅰ-4)。花粉管中大量的鈣沉淀顆粒聚集在管壁上，并且?guī)缀踹B成線狀；在管內(nèi)的液泡中也有較大的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅰ-7)。授粉6 h，花粉管生長(zhǎng)至1.5 cm花柱(花柱基部)處。此時(shí)花粉管中分布大量的鈣沉淀顆粒，而其周?chē)陌饣|(zhì)中鈣分布相對(duì)少一些(圖版Ⅰ-5)。大量的鈣沉淀顆粒不僅分布在花粉管壁上，而且在管內(nèi)細(xì)胞器以及其他內(nèi)容物中也有大量鈣分布(圖版Ⅰ-8)。授粉7 h，花粉管已從花柱生長(zhǎng)至子房頂部子房室中。此時(shí)花粉管頂端的鈣主要分布在管壁上，管內(nèi)幾乎沒(méi)有鈣分布；然而在花粉管生長(zhǎng)的外環(huán)境子房室中有大量的鈣沉淀顆粒，并且大量的細(xì)小鈣沉淀顆粒包圍著花粉管頂端(圖版Ⅰ-2)。藍(lán)豬耳花粉管在花柱中生長(zhǎng)期間的鈣含量隨著生長(zhǎng)存在著逐漸遞增的過(guò)程，花粉管到達(dá)花柱基部時(shí)，鈣沉淀顆粒達(dá)到最多。待花粉管進(jìn)入子房室，室內(nèi)環(huán)境中鈣含量遠(yuǎn)大于花粉管中的(圖版Ⅰ-2)。藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)及花粉管在花柱內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中的鈣分布情況見(jiàn)表1。

圖版I 花粉萌發(fā)及花粉管在花柱內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中鈣的分布特征

Plate I Calcium distribution ofToreniafournieripollen tubes during pollen germination and pollen tube growth in style

1：授粉1 h，花粉剛萌發(fā)出花粉管，Bar=500 nm；2：授粉7 h，花粉管進(jìn)入子房頂部，Bar=1 μm；3：授粉2 h的花粉管，Bar=2 μm；4：授粉4 h的花粉管，Bar=2 μm；5：授粉6 h的花粉管，Bar=2 μm；6：授粉2 h的花粉管，Bar=500 nm；7：授粉4 h的花粉管，Bar=500 nm；8：授粉6 h的花粉管，Bar=500 nm

2.2 花粉管在各發(fā)育階段的不同細(xì)胞學(xué)區(qū)域中鈣的分布特征

花粉管是頂端生長(zhǎng)，通過(guò)細(xì)胞壁物質(zhì)成分向頂端的分泌增加花粉管的長(zhǎng)度?；ǚ酃艿慕Y(jié)構(gòu)可依次區(qū)分出不同的細(xì)胞學(xué)的區(qū)域：頂端區(qū)、亞頂端區(qū)、核區(qū)、液泡化區(qū)和胼胝質(zhì)塞區(qū)。藍(lán)豬耳的花粉管在各個(gè)發(fā)育階段的不同區(qū)域中的鈣分布存在差異。生長(zhǎng)2 h的花粉管中，亞頂端區(qū)域前段的花粉管壁上鈣沉淀顆粒不多，但鈣沉淀顆粒細(xì)小(圖版Ⅱ-9)，而在管內(nèi)細(xì)胞器上有較多的鈣沉淀顆粒，且鈣沉淀顆粒較大(圖版Ⅱ-10)；亞頂端區(qū)域中段的花粉管壁上鈣沉淀顆粒較多，且鈣沉淀顆粒較大，同時(shí)在管內(nèi)物質(zhì)中也分布較多的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅱ-11)；亞頂端區(qū)域末段的花粉管中出現(xiàn)小液泡，此段花粉管壁以及內(nèi)容物中有少量的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅱ-12)。生長(zhǎng)4 h的花粉管中，亞頂端區(qū)的花粉管壁上有大量的鈣沉淀顆粒，幾乎連成粗線狀，而花粉管內(nèi)細(xì)胞器以及內(nèi)容物中鈣沉淀顆粒很少(圖版Ⅱ-13)；核區(qū)的花粉管壁以及細(xì)胞器上聚集較多的大顆粒的鈣沉淀(圖版Ⅱ-14)，而管內(nèi)細(xì)胞核及其中央的內(nèi)容物中鈣沉淀顆粒相當(dāng)少，幾乎沒(méi)有(圖版Ⅱ-15)；液泡化區(qū)的花粉管中鈣沉淀顆粒很少，只在電子密度大的內(nèi)容物中有分布，花粉管壁以及液泡中幾乎沒(méi)有鈣分布(圖版Ⅱ-16)。生長(zhǎng)7 h的花粉管中，頂端區(qū)的花粉管壁上聚集大量的細(xì)小鈣沉淀顆粒，而管內(nèi)鈣沉淀顆粒很少(圖版Ⅱ-17)；亞頂端區(qū)的花粉管中鈣沉淀顆粒很少，而在管外基質(zhì)中分布較多的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅱ-18)；核區(qū)的花粉管中幾乎沒(méi)有鈣沉淀顆粒，僅在管壁上有少量的鈣沉淀顆粒，但在管外基質(zhì)中分布著較多的細(xì)小鈣沉淀顆粒(圖版Ⅱ-19)。藍(lán)豬耳同一發(fā)育階段的花粉管中鈣呈現(xiàn)出梯度分布；隨著花粉管的不斷生長(zhǎng)，頂端區(qū)域的鈣不斷增加，鈣梯度分布更明顯。

表1 藍(lán)豬耳花粉管在花柱內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中的鈣分布變化

“-” 表示沒(méi)有鈣沉淀顆粒； “+” 表示有少量鈣沉淀顆粒； “++”表示有一些鈣沉淀顆粒； “+++”表示有較多鈣沉淀顆粒；“++++”表示有大量鈣沉淀顆粒

2.3 未授粉柱頭以及花柱的鈣分布特征

為探索柱頭和花柱組織中的鈣分布特征與花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)之間的關(guān)系，對(duì)只去雄未授粉的柱頭和花柱組織進(jìn)行觀察。取藍(lán)豬耳開(kāi)花后2 d(花去雄3 d)的柱頭和花柱進(jìn)行觀察。柱頭接受面的乳突細(xì)胞已形成了大液泡，在細(xì)胞壁，細(xì)胞質(zhì)以及液泡膜上鈣沉淀顆粒相當(dāng)少(圖版Ⅲ-20)。未授粉花柱0.3 cm處的通道細(xì)胞形狀規(guī)則，其細(xì)胞壁和大液泡中幾乎沒(méi)有鈣沉淀顆粒，而在胞外基質(zhì)中有一些細(xì)小的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-21)。在花柱0.9 cm處，通道細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞壁和大液泡中鈣沉淀顆粒仍然很少，而在花柱道內(nèi)分泌物中有較多的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-22)。在花柱1.3 cm處，通道細(xì)胞變得更加不規(guī)則，并且胞外基質(zhì)以及花柱道中的分泌物很多，在胞外基質(zhì)和分泌物中有大量的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-23)。在花柱1.5 cm處，通道細(xì)胞變得規(guī)則，且在細(xì)胞中有淀粉粒出現(xiàn)，此時(shí)胞外基質(zhì)中均勻分布著大量的鈣沉淀顆粒，而通道細(xì)胞中仍然很少鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-24)；然而在此處花柱組織的微管束細(xì)胞中也很少有鈣沉淀顆粒，只是在胞內(nèi)液泡膜上有零星的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-25)。藍(lán)豬耳未授粉花柱由上至下鈣沉淀顆粒呈遞增的梯度分布。藍(lán)豬耳未授粉柱頭及花柱的鈣分布情況見(jiàn)表2。

圖版II花粉管在各發(fā)育階段的不同細(xì)胞學(xué)區(qū)域中鈣的分布特征Plate II Distribution of calcium in different cytological regions of Torenia fournieri pollen tubes at different development stages

9～12：生長(zhǎng)2 h的花粉管；9為亞頂端區(qū)域前段，Bar=500 nm；10為亞頂端區(qū)域前段花粉管內(nèi)細(xì)胞器，Bar=500 nm； 11為亞頂端區(qū)域中段，Bar=200 nm；12為亞頂端區(qū)域末段，Bar=200 nm。13～16：生長(zhǎng)4 h的花粉管；13為亞頂端區(qū)，Bar=500 nm；14為核區(qū)，Bar=200 nm；15為核區(qū)中兩精細(xì)胞核(SN)及營(yíng)養(yǎng)核(VN)，Bar=200 nm；16為液泡化區(qū)，Bar=200 nm。17～19：生長(zhǎng)7 h的花粉管；17為頂端區(qū)，Bar=1 μm；18為亞頂端區(qū)，Bar=1 μm；19為核區(qū)，Bar=1 μm

3 討論與結(jié)論

鈣不僅影響藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)，也對(duì)花粉管生長(zhǎng)起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[23]。藍(lán)豬耳花粉在柱頭上萌發(fā)時(shí)，柱頭細(xì)胞的鈣沉淀顆粒很少，花粉管壁上鈣沉淀顆粒較多；花粉管剛進(jìn)入花柱時(shí)，相鄰的花柱通道細(xì)胞和胞間基質(zhì)中鈣沉淀顆粒較多，而管壁上的鈣沉淀顆粒相對(duì)減少，管內(nèi)的鈣沉淀顆粒相對(duì)增多；花粉管伸長(zhǎng)至花柱基部時(shí)，相鄰花柱組織的鈣沉淀顆粒相應(yīng)減少，而管壁上的鈣沉淀顆粒先增多后減少，管內(nèi)的鈣沉淀顆粒逐漸增多；當(dāng)花粉管進(jìn)入子房，子房室內(nèi)有大量的鈣沉淀顆粒，花粉管壁上鈣沉淀顆粒又有增多，而這時(shí)管內(nèi)的鈣沉淀顆粒相對(duì)較少。由此推測(cè)：花粉萌發(fā)時(shí)，藍(lán)豬耳的花粉中有足夠的鈣滿(mǎn)足花粉萌發(fā)；花粉管生長(zhǎng)中，鈣不斷從花柱組織細(xì)胞中進(jìn)入花粉管，滿(mǎn)足花粉管內(nèi)雄性生殖細(xì)胞的分裂和花粉管的生長(zhǎng)；花粉管進(jìn)入到子房，花粉管內(nèi)無(wú)需太多的鈣，而管外高鈣環(huán)境有助于花粉管進(jìn)入珠孔。

圖版III 未授粉柱頭以及花柱鈣的分布特征Plate III Calcium distribution of stigma and style in unfertilized Torenia fournieri

20：柱頭的乳突細(xì)胞，Bar=10 μm。21：0.3 cm花柱處的引導(dǎo)組織(TT)和花柱道(SC)，Bar=10 μm。22：0.9 cm花柱處的引導(dǎo)組織和花柱道，Bar=10 μm。23：1.3 cm花柱處的引導(dǎo)組織和花柱道，Bar=2 μm。24：1.5 cm花柱處的引導(dǎo)組織和花柱道，Bar=2 μm。25：1.5 cm花柱處的微管束(VB)，Bar=10 μm

表2 藍(lán)豬耳未授粉柱頭及花柱的鈣分布變化

“+” 表示有少量鈣沉淀顆粒； “++”表示有一些鈣沉淀顆粒； “+++”表示有較多鈣沉淀顆粒；“++++”表示有大量鈣沉淀顆粒

已經(jīng)有多位研究者對(duì)花粉管中的總鈣、膜鈣和游離鈣分布進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)花粉管中的鈣呈梯度分布，并且發(fā)現(xiàn)花粉管中的鈣梯度分布現(xiàn)象僅在生長(zhǎng)中的花粉管內(nèi)存在[12-21]。在培養(yǎng)基中加入或直接向花粉管內(nèi)注射鈣抑制劑后，花粉管中的鈣梯度消失，花粉管停止生長(zhǎng)；去掉鈣抑制劑后，花粉管中的鈣梯度重新建立，花粉管恢復(fù)生長(zhǎng)[24-30]?；ǚ酃苤械拟}梯度分布與花粉管的生長(zhǎng)密切相關(guān)。藍(lán)豬耳體內(nèi)生長(zhǎng)的花粉管中鈣也呈梯度分布，并且隨著花粉管不斷生長(zhǎng)，鈣的梯度分布更加明顯。

對(duì)雌蕊花粉管生長(zhǎng)軌道的鈣分布研究結(jié)果表明，凡是在花粉管生長(zhǎng)所必經(jīng)的部位中均有較相鄰組織更為豐富的鈣，而且這些組織的鈣主要分布在質(zhì)外體系統(tǒng)——細(xì)胞壁和胞外基質(zhì)[8]。然而，雌蕊花粉管軌道中鈣的梯度分布與花粉管定向生長(zhǎng)的關(guān)系仍無(wú)定論。到目前為止，也只在煙草[5]、金魚(yú)草[7]、萵苣[8]和獼猴桃[9]中發(fā)現(xiàn)花粉管軌道的鈣呈梯度分布，而在向日葵[1]、陸地棉[2]、水稻[3]、刺槐[10]等植物不同切段的花柱中，并未觀察到鈣的梯度分布。不同植物花柱中鈣梯度分布現(xiàn)象存在差異。這種差異的產(chǎn)生可能有以下幾個(gè)原因：一是有些植物花柱中的鈣分布差異很小，現(xiàn)有的技術(shù)難以檢測(cè)出這種鈣分布梯度；二是不同植物花柱中是否存在鈣梯度分布特征可能與植物的種類(lèi)有關(guān)。短花柱的植物花粉管可能無(wú)需花柱鈣梯度分布定向吸引即可到達(dá)胚囊，而一些長(zhǎng)花柱的植物花粉管到達(dá)胚囊需要很長(zhǎng)時(shí)間，可能需要有某種機(jī)制保證花粉管的定向生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，藍(lán)豬耳的花柱屬中等長(zhǎng)度，在未授粉時(shí)已出現(xiàn)花柱中有明顯的鈣梯度分布特征，并且在授粉后，花粉管生長(zhǎng)到達(dá)的部位均有較為豐富的鈣。從而推測(cè)藍(lán)豬耳花柱的鈣梯度分布對(duì)其中生長(zhǎng)的花粉管可能也具有引導(dǎo)作用。