劉 倩，曹 碩,2，張 昊,2，沈 紅,2*，張永紅,2*

(1．北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2.動物類國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(北京農(nóng)學(xué)院)，北京 102206)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)又名油安草，別名艾菊，系唇形科迷迭香屬植物，多年生常綠亞灌木[1]，其具有獨(dú)特的香氣。迷迭香是一種同時兼有欣賞價值、香料價值和藥用價值等多種價值屬性的植物。迷迭香精油是迷迭香次生代謝物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香精油除了含有香氣成分,還含有很多藥用成分,如抗菌、抗感染物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、調(diào)節(jié)抗癌物質(zhì)和天然色素等[2]。多數(shù)研究表明，迷迭香精油具有廣譜的抗菌性，但是對抗菌性的研究大多數(shù)都進(jìn)行體外試驗(yàn)，很少涉及體內(nèi)研究。近年來，對于精油治療功效的體內(nèi)研究大多是用芳香療法，有研究表明天王補(bǔ)心丹和迷迭香精油均可改善阿爾茲海默病小鼠的記憶功能,但以二者聯(lián)合使用效果為佳；迷迭香精油聯(lián)合天王補(bǔ)心丹對小鼠記憶力有改善作用,可以興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng),使其在新異環(huán)境中的自發(fā)活動和探究行為明顯增加；天王補(bǔ)心丹對阿爾茲海默病模型小鼠有一定的不良反應(yīng),迷迭香精油可降低天王補(bǔ)心丹對阿爾茲海默病模型小鼠的不良反應(yīng)[3]。佟棽棽[4]為探索芳香植物的香氣成分對神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)迷迭香和檸檬草的精油以及活體香氣,具有一定的抗抑郁作用。很少有體內(nèi)研究涉及迷迭香精油的抗菌作用。本研究首先采用藥敏試驗(yàn)確定迷迭香精油的抑菌作用，然后通過感染金黃色葡萄球菌制造小鼠肺炎模型，小鼠經(jīng)鼻吸入迷迭香精油，檢測體重、血常規(guī)、臟器指數(shù)、組織病理變化、細(xì)菌定植率等指標(biāo)，觀察其對肺炎是否有緩解作用，目的探討迷迭香精油通過嗅覺通路改善肺炎小鼠的可行性，以及迷迭香精油的抗菌作用，為其未來開發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

6～8周齡健康昆明小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK-(京)2016-0002】。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌29213和鏈球菌購于中國獸藥監(jiān)察所，MHB培養(yǎng)基與瓊脂粉購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，100%迷迭香精油、100%茶樹精油、100%薰衣草精油購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，小鼠白介素6(IL-6)試劑盒購自湖北伊萊瑞特生物科技有限公司。Leica EG1150石蠟包埋機(jī)、Leica RM2235型切片機(jī)購于德國Leica公司，WFZ-UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)購于尤尼柯(上海)儀器有限公司，MEK-7222K五分類血細(xì)胞分析儀購于日本NIHON KOHDEN公司。

1.2 方 法

1.2.1 迷迭香精油體外抑菌試驗(yàn) 取200 μL金葡萄球菌菌液加入滅菌的MHB中，過夜搖10 h，然后取適量過夜菌加到新的培養(yǎng)基中搖6 h,分光光度計(jì)檢測其OD值，根據(jù)公式y(tǒng)=1.25x+7.0115(x=OD值)計(jì)算菌落數(shù)為1×10yCFU/mL，每只鼠攻菌2×109CFU。

將100%純度的迷迭香精油、茶樹精油、薰衣草精油分別進(jìn)行5倍(取200 μL精油原液和800 μL植物油到1.5 mL離心管，振蕩)、10倍(吸500 μL 5倍稀釋溶液和500 μL植物油到1.5 mL離心管，振蕩)、20倍稀釋(吸500 μL 10倍稀釋溶液和500 μL植物油到1.5 mL離心管，振蕩)。取10 μL精油到紙片上，使各紙片充分浸透藥液。

按照文獻(xiàn)指導(dǎo)制備MHB固體培養(yǎng)基，采用涂布法將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌液分別涂在不同平皿培養(yǎng)基上，并保證菌液滲透于MHB固體培養(yǎng)基，然后將已含有精油紙片輕放于涂菌后培養(yǎng)皿相應(yīng)的區(qū)域。

1.2.2 迷迭香精油體內(nèi)抑菌試驗(yàn) 取40只小鼠隨機(jī)分對照組、感染菌模型組、迷迭香組(每組12只)。將小鼠固定，其余小鼠滴鼻感染(順著呼吸吸入)金葡菌(2×109CFUs/只)，待小鼠完全吸入菌液后，使其平躺籠中；陰性對照組小鼠則按照同樣方法處理，滴鼻給予等體積的PBS。

小鼠感染滴鼻細(xì)菌，2 h后開始吸入迷迭香精油。吸入方法：將盛有2 mL精油離心管固定于小鼠玻璃罩中上部，打開離心管迷迭香精油揮發(fā)彌漫玻璃罩內(nèi)，將迷迭香組小鼠置于罩內(nèi)每天2次，每次小鼠吸入精油30 min，連續(xù)7 d。同樣方法處理模型組和對照組小鼠，但不吸入任何精油。

所有小鼠感染前(0 d)稱重，然后分別于1、3、5、7 d稱重，同時每組隨機(jī)取3只小鼠采血，頸椎脫臼處死，打開腹腔摘取肝肺腎脾臟器，肉眼觀察臟器大小及色澤等，拍照及稱重。臟器系數(shù)=臟器重量/體重。試驗(yàn)結(jié)束后取小鼠采血，部分血液制備血清，按照IL-6試劑盒說明進(jìn)行檢測；部分血液用于血細(xì)胞分析儀分析小鼠血常規(guī)指標(biāo)。無菌條件取部分肺組織稱重，置于滅菌勻漿器內(nèi)，加2 mL無菌PBS快速勻漿處理，離心取上清勻漿液，將200 μL勻漿液涂布于MHB固體培養(yǎng)基上，37 ℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)24 h，取出記錄培養(yǎng)皿內(nèi)菌落個數(shù)，細(xì)菌定植數(shù)(CFU/mg)=平板上的菌落數(shù)×10/肺臟勻漿質(zhì)量。取疑似病變肺組織，用4 ℃生理鹽水洗凈后，濾紙拭干，將肺組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)分析比較各組數(shù)據(jù)，方差不齊時用t’檢驗(yàn)，用*和△△表示P<0.05 即差異顯著，用**和△△表示P<0.01 即差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 迷迭香精油對常見病原菌的抑菌活性分析

抗菌素抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>15 mm為最敏感，10～15 mm 為中度敏感， 7～9 mm 為低度敏感，0～7 mm為不敏感[5]。由圖1和表1知，迷迭香精油組金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌抑菌圈直徑分別為(12.6±1.2)mm、(12.4±2.4) mm和(11.5±0.5)mm(表1)，并且與茶樹精油和薰衣草精油相比迷迭香精油原液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌種有較強(qiáng)的抑菌活性(圖1)；圖2顯示迷迭香精油原液抑菌圈最大抑菌效果最好，5倍稀釋精油(之前的試驗(yàn)證明植物油對三種菌種無抑菌性)有稍弱的抑菌活性，10倍和20倍稀釋精油基本沒有抑菌圈。

A.金黃色葡萄球菌；B.大腸桿菌；M.迷迭香；C.茶樹；X.薰衣草A. Staphylococcus aureus; B. Escherichia coli; M. rosemary; C. tea tree; X. lavender圖1 不同植物精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of different plant essential oils on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

A.金黃色葡萄球菌；B.大腸桿菌；C.鏈球菌1. 迷迭香原液；2. 5倍稀釋；3. 10倍稀釋；4. 20倍稀釋圖2 不同稀釋倍數(shù)迷迭香精油對不同細(xì)菌抑菌效果A. Staphylococcus aureus; B. Escherichia coli; C. streptococci1. rosemary stock solution;2. 5-fold dilution;3. 10-fold dilution;4; 20-fold dilutionFig.2 Antibacterial effect of different dilutions of rosemary oil on different bacteria

Tab.1 Diameter of inhibition circle of three essential oils on bacteria in vitro

菌種迷迭香精油/mm茶樹精油/mm薰衣草精油/mm金黃色葡萄球菌12.6±1.2 12±2.3 —大腸桿菌12.4±2.410±1.9 —鏈球菌11.5±0.510.5±1.5—

2.2 小鼠體征變化

對照組小鼠無異常情況出現(xiàn)，但模型組和迷迭香精油組小鼠在感染細(xì)菌后開始表現(xiàn)暴躁喜斗，反應(yīng)強(qiáng)烈，采食減少及大便干結(jié)；小鼠吸嗅迷迭香精油后表現(xiàn)較為溫和，進(jìn)食量增加，尿量增多，體征情況好轉(zhuǎn)至恢復(fù)正常。

2.3 迷迭香精油對小鼠體重和臟器指數(shù)的影響

圖3對照組小鼠平均體重隨著飼養(yǎng)時間延長體重逐漸增加；肺炎模型組小鼠體重從第1天逐漸降低，從第3天后體重逐漸升高，與對照組比差異顯著；迷迭香組小鼠體重從第1～7天逐漸增加呈上升趨勢且高于模型組低于對照組，與模型組相比差異極顯著。迷迭香組小鼠肺臟指數(shù)從第3天后逐漸低于模型組并接近對照組。

與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與對照組相比，△P<0.05,△△P<0.01圖3 迷迭香精油對金葡菌致肺炎小鼠的體重及肺臟指數(shù)影響(*P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group)Fig.3 Effect of rosemary essential oil on body weight and lung index of mice with pneumonia caused by Staphylococcus aureus

2.4 迷迭香精油對小鼠炎性細(xì)胞及IL-6的影響

采用血細(xì)胞分析儀檢測小鼠感染細(xì)菌7 d內(nèi)血液中炎性細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果對照組小鼠的白細(xì)胞數(shù)量從第1天到第7天一直保持相對穩(wěn)定，模型組小鼠白細(xì)胞數(shù)逐漸增加并高于顯著對照組，迷迭香組小鼠血液白細(xì)胞數(shù)感染第1天高于對照組但低于模型組，以后逐漸升高從第3天白細(xì)胞數(shù)大幅度降低，極顯著低于模型組(圖4)；中性粒細(xì)胞數(shù)總體趨勢和白細(xì)胞變化一致，迷迭香組小鼠第3天中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯降低，且極顯著低于模型組(圖4)。圖5顯示小鼠血清中IL-6含量，對照組小鼠血液IL-6含量一直保持著相對穩(wěn)定，迷迭香組小鼠第1天血清中IL-6含量略有升高，第3天降低之后一直保持穩(wěn)定水平，且在第3天和第7天與模型組相比差異顯著。

與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與對照組相比，△P<0.05,△△P<0.01圖4 迷迭香精油對小鼠炎性細(xì)胞的影響*P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control groupFig.4 Effect of rosemary essential oil on inflammatory cells in mice

與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與對照組相比圖5 迷迭香精油對小鼠血清中IL-6含量的影響Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01Fig.5 Effect of rosemary essential oil on serum IL-6 contents in the mice

2.6 迷迭香精油對小鼠肺組織金葡菌定殖的影響

模型組小鼠感染細(xì)菌后1～3 d內(nèi)每毫克肺組織中金葡菌菌落數(shù)較高，第5和7天其菌落數(shù)極顯著降低；迷迭香組小鼠第1天肺組織中菌落數(shù)較高，隨后菌落數(shù)逐漸降低；對照組小鼠肺組織中細(xì)菌數(shù)一直保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)(圖6)。

2.7 小鼠肺臟組織病理學(xué)變化特征

試驗(yàn)結(jié)束打開小鼠腹腔，肉眼觀察小鼠感染細(xì)菌后肺臟出現(xiàn)腫脹、色澤暗紅，肺葉上均有大小不等和形狀各異的出血斑，肺臟充血，肺組織出現(xiàn)腫硬塊，肺門淋巴結(jié)腫大、出血；小鼠連續(xù)吸嗅迷迭香精油7 d后，肺臟形態(tài)出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，出血斑逐漸減少，充血減弱呈現(xiàn)出淡粉紅色，質(zhì)地變軟，接近陰性對照組小鼠肺組織狀態(tài)(圖7)。肺組織切片HE染色結(jié)果見圖7，與對照組相比，模型組小鼠感染細(xì)菌肺組織有大量充血，組織實(shí)變明顯，肺泡壁增厚，肺泡組織結(jié)構(gòu)完整性破壞，肺泡腔內(nèi)可見出血；小鼠吸嗅迷迭香精油后，肺組織充血明顯減輕，肺泡間隙炎性細(xì)胞浸潤減少，肺泡結(jié)構(gòu)完整性逐步恢復(fù)。

圖6 迷迭香精油對金葡萄定殖小鼠肺臟的影響Fig.6 Effects of Rosemary essential oil on staphylococcus aureus colonizing in the mice lung

圖7 小鼠肺臟剖檢肉眼觀察變化(1×)Fig.7 Visual observation changes of mouse lung biopsy (1×)

圖8 顯微鏡觀察HE染色肺組織結(jié)構(gòu)(200×)Fig.8 Microscopic observation of HE staining lung tissues from the mice (200×)

3 討 論

3.1 迷迭香精油抑菌活性及對小鼠肺組織細(xì)菌定殖的影響

Adriana等[6]研究發(fā)現(xiàn)迷迭香精油中的1,8-桉葉素可通過破壞大腸桿菌的細(xì)胞膜而起到抗菌作用?？嘴o思[7]應(yīng)用抑菌擴(kuò)散法測定和比較了香桃木、薰衣草薄荷、迷迭香精油和殘?jiān)嵛锏囊志町?，結(jié)果迷迭香精油原液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，其可能與迷迭香精油的主要成分α-蒎烯、樟腦和1,8-桉葉素[8]有關(guān)。先前的大多文獻(xiàn)研究迷迭香精油的抑菌活性時只針對其本身進(jìn)行，沒有選擇其他植物精油進(jìn)行對照，本試驗(yàn)選擇和迷迭香同科屬的薰衣草以及不同科屬的茶樹，結(jié)果顯示同科屬的薰衣草對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌沒有抑菌圈表明無抑菌作用，而迷迭香精油相較于茶樹精油有明顯抑菌圈且大于10 mm，說明表現(xiàn)較高的抑菌活性，并且抑菌效果呈濃度依賴性，試驗(yàn)結(jié)果與之前對迷迭香精油研究報道基本一致。肺炎模型組小鼠每毫克肺組織金葡菌菌落數(shù)在前3 d相對較高，隨著時間的推移其菌落數(shù)不斷的降低，說明小鼠有一定抵抗能力，但小鼠在吸入迷迭香精油后，小鼠肺部細(xì)菌定殖數(shù)不斷的降低，說明迷迭香精油明顯抑制金葡菌定殖。

3.2 迷迭香精油對小鼠肺臟組織結(jié)構(gòu)和臟器指數(shù)的影響

有研究顯示，迷迭香提取物對胃黏膜具有保護(hù)作用，將乙醇通過灌胃的方式進(jìn)入到大鼠的胃部，迷迭香提取物可以減輕大鼠胃部炎癥細(xì)胞的滲入。試驗(yàn)結(jié)果小鼠感染金葡菌后，早期肺臟結(jié)構(gòu)具有明顯的變化，但小鼠連續(xù)吸入迷迭香精油7 d后，小鼠肺臟形態(tài)出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，接近對照組小鼠肺組織。

體重是動物試驗(yàn)中一個重要的非特異性觀察指標(biāo)[9],試驗(yàn)動物臟器重量和臟器系數(shù)是生物醫(yī)學(xué)研究中常用的重要參考[10]。臟器系數(shù)升高和下降可能代表著該器官發(fā)生充血、水腫、增生肥大性等變化或者是該器官萎縮、有退行性變化[11]。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠體重明顯減輕，可能與細(xì)菌致小鼠肺炎后活動下降、采食飲水減少等有關(guān)；模型組肺臟指數(shù)高，小鼠每天吸入迷迭香精油后，臟器指數(shù)逐漸降低接近對照組，這可能小鼠體質(zhì)恢復(fù)，采食飲水增多，肺部炎癥得到緩解。研究發(fā)現(xiàn)，嗅覺對小鼠患病也具有治療效果，通過鼻子進(jìn)入體內(nèi)的迷迭香精油，同時可以進(jìn)入肺部，迷迭香精油的化學(xué)分子在肺部進(jìn)行氣體交換，再通過血液循環(huán)系統(tǒng)，達(dá)到相應(yīng)的療效[12]，其具體的作用機(jī)理還不清楚。

3.3 迷迭香精油對細(xì)胞因子及炎性細(xì)胞的影響

肺炎時致炎因子激活中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞后可釋放一系列細(xì)胞因子如非特異性炎癥因子IL-6等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷[13-16]。Zobel K[17]和Lee YL[18]研究表明，典型的細(xì)菌性感染可導(dǎo)致IL-6較高濃度，IL-6 量反映肺炎患者的疾病嚴(yán)重程度。本試驗(yàn)結(jié)果小鼠感染細(xì)菌致肺炎后，血液中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞升高，IL-6含量增加，小鼠處于肺炎應(yīng)激狀態(tài)且有炎癥反應(yīng)，但小鼠吸入迷迭香精油后白細(xì)胞數(shù)下降，IL-6含量降低，說明迷迭香精油緩解小鼠肺部炎癥。研究表明，迷迭香提取物降低了誘導(dǎo)炎癥發(fā)生的相關(guān)因子，如髓過氧化物酶、IL1-β、TNF-α等，以及減少白細(xì)胞有關(guān)[19]。綜上所述，迷迭香精油體外對大腸桿菌、鏈球菌、金葡菌有一定抑制作用，小鼠吸入迷迭香精油對金葡菌感染小鼠致肺炎癥狀有一定的緩解作用，研究結(jié)果為以后植物精油對動物炎癥影響的研究提供了良好的方法和試驗(yàn)動物模型。