蘇佳佳, 曾 杰, 邵鄰相

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

生酮飲食對(duì)人乳腺癌[1]、神經(jīng)性母細(xì)胞瘤[2]、結(jié)腸癌[3]、前列腺癌[4]和胃癌[5]等腫瘤具有明顯的治療效果,通過(guò)逆轉(zhuǎn)基因表達(dá)模式、降低活性氧的水平、抗血管生成和抗炎等作用抑制腫瘤生長(zhǎng),延長(zhǎng)患癌動(dòng)物生存時(shí)間[6-9].生酮飲食產(chǎn)生酮體,包括3-羥基丁酸、乙酰乙酸和丙酮等,其中起主要作用的成分是3-羥基丁酸.3-羥基丁酸能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡[10],但3-羥基丁酸在細(xì)胞水平上抑制癌細(xì)胞增殖方面的研究報(bào)道甚少.

腫瘤細(xì)胞從胞外環(huán)境攝取的葡萄糖的量是正常細(xì)胞的十幾倍[11]．大量攝取葡萄糖為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供了充足的能量；糖尿病患者患癌風(fēng)險(xiǎn)比普通人高25%以上[1]，患胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)比普通人高5倍以上[12].因此，葡萄糖饑餓的癌癥治療方法受到人們廣泛關(guān)注．實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，碳源饑餓能抑制HeLa細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡[13-16]；并且HeLa癌細(xì)胞與人體臍帶正常細(xì)胞在葡萄糖饑餓共培養(yǎng)條件下，HeLa癌細(xì)胞先于正常細(xì)胞凋亡，這為臨床上饑餓療法治療腫瘤提供了理論依據(jù).饑餓療法或道家服氣辟谷期間機(jī)體處于較低的血糖水平(空腹血糖)，人體動(dòng)用脂肪在肝臟產(chǎn)生酮體(如3-羥基丁酸)，進(jìn)入血液給機(jī)體細(xì)胞提供能量.為模擬人體環(huán)境，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了相當(dāng)于人體空腹血糖條件下，用3-羥基丁酸處理HeLa癌細(xì)胞和人臍帶正常細(xì)胞共培養(yǎng)組作為對(duì)照組，觀察3-羥基丁酸對(duì)人體正常細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.探討了3-羥基丁酸抑制HeLa癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用與誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制,為腫瘤的生酮飲食療法和酮體療法提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

3-羥基丁酸為杭州昊天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;caspase-3,Bim,Bad兔抗體,P27鼠抗體為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品;HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG,HRP-標(biāo)記山羊抗小鼠IgG,HRP-GAPDH-mAb為Bioworld Technology公司產(chǎn)品;其他常規(guī)試劑均為金華醫(yī)藥公司產(chǎn)品.

流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品;半干轉(zhuǎn)蛋白印跡系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)為上海天能科技有限公司產(chǎn)品.

1.2 HeLa癌細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活力檢測(cè)

G25K0組:25 mmol/L葡萄糖+0 mmol/L 3-羥基丁酸組;G5K0組:5 mmol/L葡萄糖+0 mmol/L 3-羥基丁酸組;G5K25組:5 mmol/L葡萄糖+25mmol/L 3-羥基丁酸組;G25K25組:25 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L 3-羥基丁酸組.HeLa癌細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[15].

1.3 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè) DNA 損傷

3-羥基丁酸處理HeLa癌細(xì)胞48 h,收集細(xì)胞.單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[17].

1.4 流式細(xì)胞分析

3-羥基丁酸處理HeLa癌細(xì)胞48 h后,胰酶消化,離心,用PBS沖洗2遍,每組細(xì)胞加入1×Annexin V結(jié)合緩沖液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,分別取400 μL重懸液加入到1.5 mL EP管中.G25K0組分別用單染(10 μL 20 μg/mL Annexin V),單染(5 μL 50 μg/mL PI),雙染(10 μL Annexin V+5 μL PI),陰性空白染色(無(wú)Annexin V和 PI);實(shí)驗(yàn)組G25K25組雙染(10 μL Annexin V+5 μL PI).室溫避光孵育15 min后 ,1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞檢測(cè).數(shù)據(jù)采用Flow Jo 7.6軟件進(jìn)行處理.

1.5 Western Blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

3-羥基丁酸處理HeLa癌細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞,提取總蛋白.Western Blot 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[18].

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異.

2 結(jié) 果

2.1 3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞活力的影響

為了檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞活力的影響,利用MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),結(jié)果如表1所示:G5K0組,G5K25組和G25K25組3-羥基丁酸處理HeLa癌細(xì)胞后增殖抑制率,24 h時(shí)分別為10.2%,41.4%,1.2%;48 h時(shí)分別為28.8%,65.1%,12.6%;72 h時(shí)分別為51.2%,66.3%,17.8%.以上結(jié)果表明3-羥基丁酸能夠降低HeLa癌細(xì)胞活力,且呈時(shí)間依賴(lài)性;在低葡萄糖條件下,3-羥基丁酸對(duì)抑制HeLa癌細(xì)胞活力的作用更明顯(見(jiàn)表1).

2.2 AO/EB熒光染色檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞凋亡的影響

表1 3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞活力的影響

注：*P< 0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,**P< 0.01為差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

利用AO/EB熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞凋亡程度的影響.G25K0組細(xì)胞利用AO/EB熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞凋亡程度的影響.G25K0組細(xì)胞(見(jiàn)圖1A)為分布均勻的綠色,細(xì)胞膜與細(xì)胞核完整,細(xì)胞呈多邊形或梭形,邊界清晰;G5K0組細(xì)胞(見(jiàn)圖1B)大多數(shù)為分布均勻的綠色,僅有極少數(shù)細(xì)胞皺縮變圓,呈典型的早期凋亡特征；G5K25組細(xì)胞(見(jiàn)圖1C)密度明顯減小,大多數(shù)細(xì)胞收縮變圓,細(xì)胞為橘紅色,出現(xiàn)凋亡小體,呈典型的晚期凋亡特征；G25K25組細(xì)胞(見(jiàn)圖1D)密度明顯減小,多數(shù)細(xì)胞呈橢圓形,少數(shù)細(xì)胞為淡橘色,出現(xiàn)凋亡小體,呈典型的中期凋亡特征.結(jié)果表明，3-羥基丁酸能夠抑制HeLa癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞凋亡;在低葡萄糖條件下,3-羥基丁酸誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞凋亡的作用更明顯.

A:G25K0組;B:G5K0組;C:G5K25組;G25K25組

圖1 AO/EB熒光染色檢測(cè)3-羥基丁酸誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞凋亡

2.3 3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞DNA的損傷

為了進(jìn)一步探究3-羥基丁酸抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制,采用單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞DNA的受損情況.如圖2所示,G25K0組細(xì)胞(見(jiàn)圖2A)的彗星頭熒光強(qiáng),細(xì)胞核在電場(chǎng)的作用下仍較圓,極少彗尾形成,細(xì)胞核DNA保持完好未受到損傷;G5K0組細(xì)胞(見(jiàn)圖2B)在電場(chǎng)的作用下,細(xì)胞核DNA有少量跑出,造成輕微的拖尾現(xiàn)象,彗星頭大小不均一,細(xì)胞核DNA受到輕微的損傷;G5K25組細(xì)胞(見(jiàn)圖2C)在電場(chǎng)作用下,彗星頭明顯縮小甚至消失,彗尾長(zhǎng),細(xì)胞核DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷;G25K25組細(xì)胞(見(jiàn)圖2D)在電場(chǎng)的作用下,分子量大小不等的DNA片段跑出細(xì)胞核,彗星頭明顯縮小,形成細(xì)長(zhǎng)的彗尾,呈扇形散開(kāi),細(xì)胞核DNA受到損傷,但損傷程度低于G5K25組細(xì)胞.CASP彗星分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如表2所示.與G25K0組相比較,G5K0組、G25K25組和G5K25組彗星頭部DNA含量百分比(HDNA%)逐漸減少(P<0.01),尾部DNA含量百分比(TDNA%),彗星全長(zhǎng)(CL),彗星尾長(zhǎng)(TL),尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)都明顯增多(P<0.05).

這些結(jié)果均表明，HeLa癌細(xì)胞經(jīng)3-羥基丁酸處理后,細(xì)胞核DNA受到損傷,可能引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生;在低葡萄糖條件下,HeLa癌細(xì)胞經(jīng)3-羥基丁酸處理后,細(xì)胞核DNA損傷程度增加.

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果如圖3所示.G25K0組與G25K25組的早期凋亡率分別為2.74%和24.80%;晚期凋亡率分別為1.79%和14.90%.因此,G25K25組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加.

A:G25K0組;B:G5K0組;C:G5K25組;G25K25組圖2 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA的損傷表2 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞DNA鏈斷裂的各項(xiàng)指標(biāo)

注：*P< 0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,**P< 0.01為差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western Blot檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá).結(jié)果表明,HeLa癌細(xì)胞經(jīng)3-羥基丁酸處理48 h,與G25K0組相比,G25K25組、G5K0組和G5K25組caspase-3主帶蛋白含量逐漸減少,灰度值分別減少10.63%,38.95%,52.04%,與G25K0組相比具有極顯著性差異(P<0.01);G5K0組,G5K25組中促凋亡蛋白Bim表達(dá)量逐漸增多,G25K0組與G5K25組比較具有極顯著性差異(P<0.01);與G25K0組相比,G25K25組、G5K0組和G5K25組Bad蛋白表達(dá)量均有增多,具有顯著性差異(P<0.05)(見(jiàn)圖4和表3).說(shuō)明3-羥基丁酸可以通過(guò)caspase依賴(lài)性細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞凋亡.

圖4 3-羥基丁酸處理后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量

表3 3-羥基丁酸對(duì)HeLa癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

注：*P< 0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,**P< 0.01為差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.6 3-羥基丁酸對(duì)共培養(yǎng)的HeLa癌細(xì)胞和人臍帶正常細(xì)胞的影響

上述結(jié)果表明，3-羥基丁酸能夠抑制HeLa癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.為檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)人體正常細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,設(shè)計(jì)了HeLa癌細(xì)胞和人臍帶正常細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示:G25K0組人臍帶正常細(xì)胞和HeLa癌細(xì)胞為分布均勻的綠色熒光,細(xì)胞生長(zhǎng)良好(見(jiàn)圖5A1～A2).G5K0組人臍帶正常細(xì)胞少數(shù)細(xì)胞收縮變圓為橘紅色,半數(shù)細(xì)胞為綠色(見(jiàn)圖5B1);而HeLa癌細(xì)胞多數(shù)細(xì)胞收縮變圓,為淡橘紅色,呈典型的中期凋亡特征,僅有少數(shù)細(xì)胞為綠色(見(jiàn)圖5B2).G5K25組人臍帶正常細(xì)胞大多數(shù)細(xì)胞染色為分布均勻的綠色,僅少數(shù)細(xì)胞為橘紅色,呈早期凋亡特征(見(jiàn)圖5C1);而HeLa癌細(xì)胞密度明顯降低,大多數(shù)細(xì)胞為橘紅色,呈明顯的晚期凋亡特征,僅有極少數(shù)細(xì)胞為不明顯的綠色,表明細(xì)胞狀態(tài)差,大部分細(xì)胞已凋亡(見(jiàn)圖5C2).G25K25組人臍帶正常細(xì)胞為分布均勻的綠色熒光,極少數(shù)細(xì)胞為橘紅色(見(jiàn)圖5D1);而HeLa癌細(xì)胞密度減少,一些細(xì)胞為不明顯的綠色熒光,一些細(xì)胞為橘紅色,表明細(xì)胞狀態(tài)差,部分細(xì)胞已凋亡(見(jiàn)圖5D2).結(jié)果表明,在共培養(yǎng)條件下,3-羥基丁酸誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞先于人臍帶正常細(xì)胞凋亡.

A1～A4:人臍帶正常細(xì)胞;B1～B4:HeLa癌細(xì)胞

圖5 AO/EB熒光染色檢測(cè)3-羥基丁酸對(duì)共培養(yǎng)的HeLa癌細(xì)胞和人臍帶正常細(xì)胞的影響

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生與能量代謝異常密切相關(guān).正常細(xì)胞可以利用葡萄糖、脂肪酸和酮體提供能量;腫瘤細(xì)胞在有氧條件下以糖酵解作為主要產(chǎn)能方式[19],并且腫瘤細(xì)胞線粒體缺乏利用酮體供能的一種或多種關(guān)鍵酶,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更依賴(lài)葡萄糖供能且不能利用酮體供能[19-20].

生酮飲食是一種由高比例脂肪、適量蛋白質(zhì)、低碳水化合物及其他營(yíng)養(yǎng)素組成的飲食.生酮飲食中脂肪含量占70%以上,在體內(nèi)分解產(chǎn)生3-羥基丁酸.生酮飲食中起主要作用的成分是3-羥基丁酸.

用3-羥基丁酸處理HeLa細(xì)胞后，MTT檢測(cè)表明，3-羥基丁酸能夠降低HeLa癌細(xì)胞活力;AO/EB熒光染色、單細(xì)胞凝膠電泳和流式細(xì)胞儀檢測(cè)都表明，3-羥基丁酸能夠抑制HeLa癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞凋亡.Shukla等[10]用3-羥基丁酸處理人胰腺癌細(xì)胞,研究表明,3-羥基丁酸能夠抑制胰腺癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Shukla等[10]研究結(jié)果一致.

促凋亡蛋白Bim從微管蛋白復(fù)合體上釋放出來(lái)并移位于線粒體外膜,促凋亡蛋白Bad位于胞質(zhì),移位并插入線粒體外膜;Bim和Bad最終通過(guò)caspase-3依賴(lài)的細(xì)胞有絲分裂障礙而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.3-羥基丁酸處理HeLa癌細(xì)胞后與G25K0組相比,G5K25組Bim蛋白表達(dá)上調(diào)41.23%;G25K25組、G5K0組和G5K25組Bad蛋白表達(dá)分別上調(diào)36.19%,140.95%,119.52%(見(jiàn)表3),從而誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞凋亡.在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí),caspase-3需要從沒(méi)有活性的全長(zhǎng)caspase-3(35 kD)被剪切成17 kD的肽段而被激活;3-羥基丁酸處理HeLa癌細(xì)胞后與G25K0組相比,G25K25組,G5K0組和G5K25組caspase-3主帶蛋白含量分別減少10.63%,38.95%,52.04%,說(shuō)明caspase-3蛋白主帶(35 kD)發(fā)生剪切而被激活,從而誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞凋亡.綜上所述,3-羥基丁酸可以通過(guò)caspase依賴(lài)性細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞凋亡.

癌癥患者體內(nèi)癌細(xì)胞數(shù)量占比少,而正常細(xì)胞數(shù)量占絕大多數(shù).雖然3-羥基丁酸能夠抑制HeLa癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.但是3-羥基丁酸對(duì)人體正常細(xì)胞是否會(huì)產(chǎn)生副作用,由此進(jìn)行了HeLa癌細(xì)胞和人臍帶正常細(xì)胞共培養(yǎng)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).在共培養(yǎng)條件下,HeLa癌細(xì)胞組與人臍帶正常細(xì)胞組相比,細(xì)胞密度減少、生長(zhǎng)狀態(tài)差、活力降低,HeLa癌細(xì)胞先于人臍帶正常細(xì)胞凋亡.以上結(jié)果為癌癥治療提供了一個(gè)有益的治療靶向,通過(guò)這一靶向作用既可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,又能較少損傷正常的健康組織,為腫瘤的生酮飲食療法和酮體療法提供理論依據(jù).這也為饑餓療法或道家服氣辟谷(較低空腹血糖，較高的3-羥基丁酸)治療腫瘤提供了理論上的依據(jù).