龔倩倩,陳鐵江

龔倩倩,陳鐵江,義烏市中心醫(yī)院急診科 浙江省義烏市 322000

核心提要：miR-181a-5p在胰腺炎中發(fā)揮保護作用的機制與靶向抑制下游的促炎因子白血病抑制因子的表達密切相關.

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是胰腺內胰酶過度激活導致胰腺組織自身消化、出血、壞死的炎性疾病,易發(fā)生全身炎性反應綜合征,死亡率高達約30%[1,2].由于現(xiàn)代人生活不規(guī)律(暴飲暴食、酗酒),導致AP的發(fā)病率逐年上升[3].即使患者脫離生命危險,長期的藥物治療也會對胰腺造成損傷[4].miRNA為長度在19-23個核苷酸組成的內源性短鏈非編碼微小的RNA分子,其參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展[5].白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是白介素-6(interleukin-6,IL-6)家族中的一個多功能細胞因子,其作為促炎癥細胞因子參與了多種炎癥反應,但其胰腺炎癥作為抗炎因子發(fā)揮作用[6,7].miR-181a-5p與LIF在胰腺炎中的作用及機制尚未十分清楚.本研究擬以大鼠胰腺腺泡細胞AR42J為研究對象,用雨蛙素誘導AR42J損傷建立胰腺炎細胞模型,檢測雨蛙素誘導AR42J細胞中miR-181a-5p、LIF的表達,觀察過表達miR-181a-5p、敲減LIF對雨蛙素誘導AR42J細胞凋亡的影響,揭示其機制可能與miR-181a-5p靶向LIF有關,將為AP的靶向治療提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠胰腺腺泡細胞AR42J購自美國ATCC;雨蛙素購自美國sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司;LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒、淀粉酶(AMY)檢測試劑盒均購自江蘇江萊生物;PVDF膜購自德國羅氏公司;SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將大鼠胰腺腺泡細胞AR42J用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,置于37 ℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),待細胞生長至融合度75%左右,用胰蛋白酶消化約1 min,按照1：3的比例更換培養(yǎng)基,每2 d傳代一次.

1.2.2 AP細胞模型制造及分組：雨蛙素誘導的AR42J細胞AP模型：將AR42J細胞調整至5×104個/mL,接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,然后用15 nmol/L雨蛙素處理0、4、8、12、16 h,用于后續(xù)篩選最佳處理時間,并將最佳處理時間下的AR42J細胞標記為Cerulein組.將anti-miR-con、anti-miR-181a-5p、si-con、si-LIF按照LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑盒說明書要求轉染至Cerulein組AR42J細胞,轉染6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h,再用15 nmol/L雨蛙素處理8 h,標記為Cerulein+antimiR-con組、Cerulein+anti-miR-181a-5p組、Cerulein+sicon組、Cerulein+si-LIF組,用于后續(xù)試驗.

1.2.3 ELISA實驗檢測AMY、TNF-α和IL-6的表達：按照ELISA檢測試劑盒說明書要求操作檢測1.2.2各組AR42J細胞中AMY、TNF-α和IL-6的表達.

1.2.4 Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡：將1.2.2各轉染組細胞,用結合緩沖液 500 μL 懸浮細胞,分別加入5 μL的 Annexin V-/FITC和PI,混勻,室溫避光靜置15 min.采用流式細胞儀分析測定結果.細胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率.每個樣品重復3次.

1.2.5 Western blot檢測LIF、caspase-3的蛋白表達：收集1.2.2各轉染組細胞,加入裂解液,冰上裂解35 min.12000 rpm離心10 min,取上清置于EP管,加入5×SDS上樣緩沖液,沸水煮沸10 min.電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜;5%脫脂奶粉將膜封閉2 h,洗膜,加入Ⅰ抗,4 ℃過夜孵育,洗膜,加Ⅱ抗,4 ℃ 2 h.加發(fā)光液,曝光.

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗：將構建的BDNF 3'UTR-WT(含LIF 3'UTR片段)和LIF 3'UTR-MUT(含LIF 3'UTR片段突變體)的熒光素酶報告載體,采用LipofectamineTM2000分別將LIF 3'UTR-WT和LIF 3'UTRMUT與miR-181a-5p mimics、miR-con共轉染,轉染后培養(yǎng)24 h,按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作,記錄螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶激發(fā)值,以兩者的比值評價LIF基因的激活程度.

統(tǒng)計學處理實驗中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進行分析.計量資料用mean±SD表示,多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 雨蛙素誘導的AR42J細胞對AMY、TNF-α和IL-6表達及凋亡的影響 結果如圖1所示,Cerulein組AR42J細胞在處理8 h時AMY、TNF-α和IL-6的表達均升高(圖1A);與Control組相比,Cerulein組AR42J細胞的凋亡率顯著升高(圖2B和C,P＜0.05).

2.2 雨蛙素誘導的AR42J細胞miR-181a-5p低表達和LIF高表達 結果如圖2所示,與Control組相比,Cerulein組AR42J細胞miR-181a-5p表達顯著下降(圖2A),LIF mRNA(圖2B)和蛋白表達(圖2C和D)均顯著升高(P＜0.05).

2.3 過表達miR-181a-5p抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞的凋亡 結果如圖3所示,與Cerulein+miR-con組相比,Cerulein+miR-181a-5p組AR42J細胞中miR-181a-5p表達顯著升高(圖3A),細胞凋亡率顯著降低(圖3B,P＜0.05).

2.4 過表達miR-181a-5p對雨蛙素誘導的AR42J細胞中caspase-3蛋白的表達 結果如圖4所示,與Cerulein+miR-con組相比,Cerulein+miR-181a-5p組AR42J細胞中caspase-3蛋白表達顯著降低(圖4A和B,P＜0.05).

2.5 miR-181a-5p靶向LIF 運用miRcode數(shù)據(jù)庫預測到miR-181a-5p與LIF 3'UTR存在結合位點(圖5A);雙熒光素酶活性檢測結果顯示,與miR-con組相比,miR-181a-5p組WT-LIF細胞中熒光活性顯著降低,MUT-LIF細胞中熒光活性不受影響(圖5B);與miR-con組相比,miR-181a-5p組細胞中LIF表達顯著降低,與anti-miR-con組相比,antimiR-181a-5p組細胞中LIF表達顯著升高(圖5C,P＜0.05).

2.6 敲減LIF抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞的凋亡 結果如圖6所示,與Cerulein+si-con組相比,Cerulein+si-LIF組AR42J細胞中LIF蛋白表達量顯著下調(圖6A),細胞的凋亡率顯著降低(圖6B和C,P＜0.05).

圖2 雨蛙素誘導的AR42J細胞miR-181a-5p低表達和LIF高表達.A：雨蛙素對AR42J細胞中miR-181a-5p表達的影響;B：雨蛙素對AR42J細胞中LIF mRNA表達的影響;C、D：雨蛙素對AR42J細胞中LIF 蛋白表達的影響.aP＜0.05,與對照組相比.

圖3 過表達miR-181a-5p抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞的凋亡.A：過表達miR-181a-5p對雨蛙素誘導的AR42J細胞中miR-181a-5p表達的影響;B：過表達miR-181a-5p對雨蛙素誘導的AR42J細胞凋亡的影響;C：流式細胞術檢測細胞的凋亡.aP＜0.05,與對照組相比.

圖4 抑制miR-181a-5p抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞中caspase-3蛋白的表達.A：抑制miR-181a-5p對caspase-3蛋白表達的影響;B：抑制miR-181a-5p對caspase-3蛋白表達量的影響.aP＜0.05,與對照組相比.

圖5 miR-22靶向LIF.A：為互補序列;B：miR-181a-5p對AR42J細胞熒光活性的影響;C：miR-181a-5p對AR42J細胞中LIF蛋白表達的影響.aP＜0.05,與miR-con組相比較;cP＜0.05,與anti-miR-con組相比較.

3 討論

miRNA為1993年首次在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的一種22 nt的長鏈非編碼小分子RNA[8].miRNA參與構成機體約3%的基因組,30%-90%的人類基因由miRNA調控,且一個miRNA可調控數(shù)千個目標基因[9].近年來,miRNA在視網(wǎng)膜疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、癌癥等多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的調節(jié)作用被廣泛研究.如miR-551b-5p、miR-92b、miR-10a、miR-7在胰腺炎均出現(xiàn)異常表達,其中miR-551b-5p可通過正向調控組ICC內鈣離子濃度發(fā)揮調控胰腺炎進展的作用[10].林金歡[11]、傅冬陽等[12]在胰腺炎的研究中均報道,miRNA在胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,推測其機制可能與miRNA與mRNA之間復雜的調控網(wǎng)絡相關.姚汝鋮等[13]研究發(fā)現(xiàn),miR-181a可用來鑒別診斷胰腺癌、慢性胰腺炎、正常胰腺及胰腺的內分泌腫瘤.An等[14]在AP的研究中通過微陣列分析胰腺炎患者血清miRNA的表達譜發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p的表達不斷下調,并運用miRNA-mRNA網(wǎng)絡揭示了miR-181a-5p的下調與甘油三酯,總膽固醇和快速血糖具有良好的負相關性,與Ca2+呈正相關,提示miR-181a-5p可作為診斷AP的生物標志物.本研究運用qRT-PCR法檢測了雨蛙素誘導的AR42J細胞中miR-181a-5p的表達發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p低表達,這與An的研究結果相一致;進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達miR-181a-5p可抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞的凋亡促進作用;深入研究運用雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證,miR-181a-5p可靶向負調控LIF表達.

圖6 敲減LIF抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞的凋亡.A：敲減LIF對雨蛙素誘導的AR42J細胞中LIF表達的影響;B：敲減LIF對雨蛙素誘導的AR42J細胞凋亡的影響;C：流式細胞術檢測細胞的凋亡情況.aP＜0.05,與對照組相比.

TNF-α、IL-1、IL-6是胰腺炎的主要致炎因子[15],其中TNF發(fā)生在炎癥起始階段,誘導IL-1、IL-6引發(fā)的級聯(lián)反應[16],但有研究報道,炎性因子水平的變化與胰腺炎的病理進程并不相一致[17].LIF屬于IL-6家族成員,為多功能細胞因子,其在正常組織或血液中低表達,炎性介質可誘導其表達,抗炎物質可抑制其表達[18].滕曉麗等[19]通過?；悄懰徕c建立大鼠SAP模型,運用RT-PCR和免疫組織化學法檢測模型大鼠肺組織中LIF的表達顯示,LIF的表達在SAP大鼠中顯著升高,提示LIF在SAP肺損傷中發(fā)揮促炎作用.吳鑫等[20]報道,LIF在AP晚期發(fā)揮促炎作用.孫濤[21]在AP的研究中發(fā)現(xiàn),miR-494在損傷胰腺腺泡細胞中高表達,發(fā)揮抑制胰腺腺泡細胞凋亡的作用,且可通過直接抑制LIF的表達抑制雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞凋亡,提示LIF在急性胰腺腺細胞中發(fā)揮損傷作用.本研究運用qRT-PCR、Western blot檢測了雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞AR42J中LIF的表達發(fā)現(xiàn),LIF表達異常升高;深入研究發(fā)現(xiàn),敲減LIF可抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞凋亡.

總之,miR-181a-5p可抑制雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞凋亡,其機制可能與靶向LIF有關,為AP的治療研究奠定基礎.

文章亮點

實驗背景

miRNA在急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)中的作用已得到認可,其中miR-181a-5p在AP中的研究甚少,且miR-181a-5p在AP中的作用機制國內外尚未有人研究.

實驗動機

本研究旨在研究miR-181a-5p在氫化可的松誘導的大鼠胰腺腺泡細胞損傷的凋亡情況,以期望為及時高效治療AP提供線索.

實驗目標

探討miR-181a-5p調控氫化可的松誘導的大鼠胰腺腺泡細胞凋亡的作用,及這種作用的機制,以期為AP的治療提供新方向.

實驗方法

用15 nmol/L雨蛙素處理大鼠胰腺腺泡細胞AR42J 8 h,運用ELISA法檢測AMY、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的表達,分成Cerulein+anti-miR-con組、Cerulein+anti-miR-181a-5p組、Cerulein+si-con組、Cerulein+si-LIF組,用流式細胞術、qRT-PCR、Western blot檢測細胞的凋亡、miR-181a-5p mRNA和LIF mRNA及LIF、caspase-3蛋白的表達,雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-181a-5p靶向LIF.

實驗結果

本研究成功構建雨蛙素誘導的大鼠胰腺腺泡細胞AR42J損傷,其中miR-181a-5p表達下調,LIF表達上調,細胞凋亡率上調,且過表達miR-181a-5p或敲減LIF均可下調細胞的凋亡率,另外,miR-181a-5p靶向調控LIF.

實驗結論

miR-181a-5p可抑制氫化可的松誘導的大鼠胰腺腺泡細胞的凋亡,其可能與靶向LIF有關,提示miR-181a-5p可作為AP治療的潛在作用靶點.

展望前景

本研究僅在體外研究miR-181a-5p對大鼠胰腺細胞損傷的凋亡影響,后期還需增加miR-181a-5p在胰腺炎大鼠體內是否具有治療作用,以更清晰的展示miR-181a-5p對AP的治療價值,也為miR-181a-5p的靶向治療提供更加充分的依據(jù).